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32 生态科学 24卷
表1多重PcR引物序列
!垒!!璺!g翌!望!!!!坐垒Q!坐坠!!i仑!!兰里g堡卫!i里!!!：
引物丁砌(℃) 引物序列57—3
7
对McyB基因，产物长度689bp。见表l。
1．3测试藻株藻细胞及水库水样藻细胞的收集
(1)测试藻株藻细胞的收集选取处于对数生
长期的藻株作为建立方法和测试用样品。藻液充分混
匀镜样品。藻液充分混匀镜检计数后，取0．1mL，15000
r·m‘1离心10min，弃上清，沉淀用灭菌双蒸水重悬
至1mL，重复洗涤两次后重悬至0．1mL。按10倍比
系列稀释。
(2)水库水样藻细胞的收集水样解冻后，充分
混匀，取2mL15000r·m。1离心10min，弃上清，用
20uL灭菌双蒸水重悬备用。
1．4 27F1／409R、209F／409R双重PCR反应体系
反应体系采用25uL，其中含10×PCRBuffer(含
M一+)4“L(M∥+终浓度为3．2mm01．Lq)，lo
mm01·L。’dNTPs0．75UL，5mg·mL。1BSA0．5pL，
引物27F1、209F、409R分别为10pm01、15pmol、25
pmol，Taq酶2U，10灿处理后藻细胞或水样，不足部
’
分用双蒸水补充。
反应参数：95℃变性5min，接着94℃1min，57
℃lmin，65℃2min，30cycles，最后，65℃延伸30min。
1．527F1／409R、209F／409R、MTR仆压TF三重PCR反应体
系反应体系采用50¨L，其中含10×PCRBuffer(含M92
+)8¨L(Mf+终浓度为3．2mmol·L。1)，10mm01．L。1
dNTPs2¨L，5g·L。1BSA1 uL，弓I物27F1、209F、
409R分别为20pmol、30pmol、50pmol，Taq酶5U，20
uL处理后藻细胞或水样，不足部分用双蒸水补充。
反压渗数：95℃变性5min，接着94℃1min，55
℃1min，65℃2min，35cvcles，最后，65℃延伸40min。
1．6PCR反应结果观察
PCR扩增结束后，取PCR产物8uL，2．0％琼脂
糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
2结果
2．1双重PCR反应方法的灵敏度测试结果及水样测试
结果
(1)选用藻细胞数在104cell·mL‘1的处理后的藻
细胞液进行双重PCR反应，产物电泳后可以看到两条
大小分别为200bp和400bp的产物带。灵敏度测试结
果(图1)显示双重PCR反应的可检测区间在10’～
103cell·mL。1级之间，其中蓝藻的特异性400bp条带
的检测下限可以达到102cell·mL～。图1中a、b、c
是水样实测的电泳结果。图中，最前面的一条模糊条
带为引物二聚体。
(2)水库水样测试结果
利用确定的双重PCR对40个广东水库水样进行
了检测，同时参照文献【luj中的方法对各水样做了利用
MTR／MTF引物的对mcvB基因的检测(可检测细胞
浓度区间在106～104cell·mL。1之问)，结果见表2。
MT剐MTF单一PCR在40个水样中共检出13例阳性
结果，阳性率32．5％。双重PCR检测40例水样中微
囊藻33例阳性，阳性率82．5％；蓝藻39例阳性结果，
阳性率97．5％。
图1双重PCR灵敏度及水样测试结果。
1．8：藻细胞密度依次为107、106、105、104、103、102、101、
100(ceH·mL。1)；a、b、c：三种水样(2003．12．2汤溪大坝，2004．5．8
汤溪大坝，2004．7．6鹤地大坝)的测试结果。
Fig1TheresultsofduplexPCRaⅡlplificationsensitivenesst st
andwaters锄ples
M：DNAMarker：1—8：TheceHconcentrationsin he rderof
107、106、105、104、103、102、101、100(cell·mL。1)：a、b、
c：Thedetectingresultsof2003．12．2Damofll ngxi、2004．5．8D锄
of’rangxi，2004．7．6DamofHedi
对比发现2004．5．8鹤地兰山河口微囊藻和微囊
藻毒素检测均呈阳性，而蓝藻检测阴性，这可能是水
样浓缩后蓝藻细胞密度超出了可检测区问的结果。7
例微囊藻阴性水样中6例可产毒微囊藻检测阴性，其
中2004．3．8汤溪新桥水样蓝藻、可产毒微囊藻检测均
阳性，而微囊藻检测阴性，这说明水样中可能存在着
可产毒素的其它非微囊藻属的藻类。以藻细胞数在
万方数据
1期 张占会，等：全细胞多重PcR检测蓝藻、微囊藻及产毒微囊藻方法初探 33
表227F1阚9R、209Ⅳ409R双重PCR及IncyB基因PCR检测结果
Table2 1kresllltsofduplexPCRaIld附taIllplific撕onresIll协of
吐lere百onillIncyB
瑞芝。采要地宦篇瓣9P黑f1s篇挚sa删ngS沁弓器鬈辚’篇器
汤溪TangXi
2003．7．14溪头1Innowl 一
溪头2Innow2+
新桥1Xinqia01 ．
新桥2Xinqia02+
大坝D锄 +
2003．9．2汇水处磐．ofwater —
gaInenng
新桥侧Sideof
xinqiao
2003．11．4浮l头Innow+
新桥侧Sideof
Xinqiao
新桥Xinqiao 一
汇水处Siteofwater
gatllering
2003．12．3新桥Xinqiao
新桥侧Sideof
XmqlaO
溪头侧SideofInnow
大坝Dam
2004．3．8 溪头Inflow
大坝Dam
新桥Xinqiao
2004．5．8 溪头Innow
大坝DaIIl
新桥xinqiao
汇水处siteofwater
gathering
2004．9．15溪头侧sideofInnow
新桥侧Sideof
Xinqiao
新桥xinqiao
溪头ITlnow
大坝D锄
汇水处water
gatllering
鹤地Hedi
2004．5．8 石角Shiiiao
兰山河口Estuaryof
Lanshan
2004．7．6 石角Shiiiao
高朗GaolaJlg
丹儿河口EstuaDrof
Daner
兰山河口Estuarvof
Lanshan
大坝Dam
2004．9．6 石角Shiiiao
高朗Gaolang
丹儿河口Estuaryof
Daner
兰山河口Estuar、，of
LanshaIl
大坝Dam
105cell·ⅡlL。的处理后的藻液作为模板，三重PCR
反应后产物电泳可得到三条符合大小的特异性产物
带。灵敏度测试结果(图2)可检测区间在105～102
cell·mL。之间，最佳区间在10’～103cell·mL。之间。
其中微囊藻的检测上限可以达到106ceU·mL～，但是
在实测水样时mcvB基因特异性条带的表达效率不是
很理想。图中，最前面的一条模糊条带为引物二聚体。
图2三重PCR反应灵敏度测试结果l一8：藻细胞密度依次
为107、106、105、104、103、102、101、100(ceU·mL。1)；a、
b、c：汤溪溪头(2004．3．8)、汤溪新桥侧(2003．11．2)汤溪大
坝(2003．12．3)的测试结果
Fig2TheresultsoftdDlexPCRanlplific撕onsensitivenesst st
andwatersamples．
M：DNAMarl，er：
1．8：Thec Uconcen仃ationsintlleorderof：107、100、10’、104、
lO。、102、101、10u(cell·mL。1)
a，b，c：Thedetec缸ngresultsof2003．12．2InnowofTan2Xi、
2004．5．8SideofⅪnQiaon‰gXia11d2004．7．6D锄of
TangXi
3讨论
目前检测微囊藻毒素的方法主要有生物检测法
(小鼠法)、高效液相色谱法(HPLC)以及酶联免疫
(ELISA)法等，这些方法一般需要样品量大，耗时
费力，且均是水体中的毒素产生后的检测。Tillet等通
过基因敲断和突变的方法报道了mcy基因的全序
列【111。因此可以选择mcv基因的保守序列进行引物的
设计，以判断是否有可产毒微囊藻的存在。但是目前报
道的针对mcv基因的PCR方法多需要提取总DNA，
步骤过于复杂。目前已见的全细胞PcR的方法多只针
对培养纯藻株，未见直接用于水样的检测【7，12】。多重
全细胞PCR简便省时，无需太多样品，因此可应用于
大批水体微囊藻毒素监测及预警。
天然水体中藻类的多样性及各种藻类丰度的不
同，使得使用PCR方法直接检测水样困难重重。因为
每一种PCR检测方法都有其检测区问，高出或低于这
个范围就得不出可靠结果。本方法比较适用于较低藻
细胞密度范围内的水样。因此，实际使用中如果能采
用不同浓缩程度的水样对比测试，比如同时测试原始
万方数据
生态科学 24卷
水样和浓缩100倍后的水样，这样就会在更大藻细胞
密度范围内得到更为准确的结果。
本文所使用的MT刚MTF引物虽然在纯培养微囊
藻株多重PcR中可以得到高效表达，完全可以用于实
验室培养的藻株的筛查，但应用于水样多重PCR时其
表达效率并不高而受到限制，这可能与水样中杂质及
非微囊藻的背景藻类细胞的大量存在有关。这需要设
计筛选针对mcv基因特异性和表达效率更好的引物来
替代它。同时实际操作时采取如在离心重悬后静置几
分钟，让一些大颗粒杂质沉淀(藻细胞沉降缓慢)，吸
取其上层等措施来减少杂质进入反应体系等方法来减
少干扰。
’
产物电泳条带中出现了较明显的引物二聚体条
带，这说明对各引物之间形成二聚体方面在设计和筛
选引物时还存在不足，另外优化反应条件时在考虑灵
敏度的同时还要尽量考虑减少引物二聚体的形成。
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万方数据
全细胞多重PCR检测蓝藻、微囊藻及产毒微囊藻方法初探
作者： 张占会， 谢数涛， 韩博平， 林少君， 钟秀英， 林桂花， ZHANG Zhan-hui， XIE Shu-
tao， HAN Bo-ping， LIN Shao-jun， ZHONG Xiu-ying， LIN Gui-hua
作者单位： 张占会,谢数涛,韩博平,林少君,ZHANG Zhan-hui,XIE Shu-tao,HAN Bo-ping,LIN Shao-
jun(暨南大学水生生物研究中心,广州,510632)， 钟秀英,林桂花,ZHONG Xiu-ying,LIN
Gui-hua(广东省水文局,广州,510150)
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGIC SCIENCE
年，卷(期)： 2005,24(1)
被引用次数： 4次

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