全 文 ：2011年 6月 甘　肃　农　业　大　学　学　报 第 4 6 卷
第 3 期 59～ 64 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSIT Y 双 月 刊
兰州百合病毒多重 PCR和 ELISA 检测体系
的比较与应用
李瑛1 ,黄惠英1 ,张金文1 , 2 ,张菲菲1 ,王旺田2 ,季彦林1 ,王威1
(1.甘肃农业大学农学院 ,甘肃 兰州　730070;2.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室 , 甘肃 兰州　730070)
摘要:采用多重 PCR和 E LISA 2种方法分别对兰州百合中的主要病毒进行检测 , 以调查田间发病率 , 对比筛
选病毒检测最优的方法.结果表明:通过多重 PC R ,从带有黄瓜花叶病毒 、百合无症病毒和百合斑驳病毒的样品中
同时扩增出 3 条与试验设计大小相符的特异条带.ELLSA 检测表明 , 兰州百合病情含量随种植年限的增加而增
加 , 3 年生>2 年生>1 年生;通过脱毒组培苗的检测 ,脱毒率随培养代数的增加而增加.对 2 种不同病毒检测方法
的结果进行卡方检测 ,二者的符合率在 90%以上 ,且多重 PCR检测的特异性和敏感性较高.
关键词:兰州百合;病毒;多重 PCR;ELISA 检测;发病率
中图分类号:S 682.2+65　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1003-4315(2011)03-0059-06
作者简介:李瑛(1983-),女 ,硕士研究生 ,研究方向为植物生物技术.E-mai l:liy9461613@163.com
通信作者:张金文 ,男 ,教授 ,主要从事作物遗传育种与种质创新研究.E-mail:jw zhang305@163.com
基金项目:甘肃省科技支撑计划项目(0804NKCA057);国家星火计划项目(2006EA860003).
收稿日期:2010-03-24;修回日期:2010-05-08
Comparison and application of multiplex-PCR and ELISA
detection sy stem fo r virus of Lanzhou lily
LI Ying
1 , HUANG Hui-ying1 , ZHANG Jin-wen1 , 2 ,ZHANG Fei-fei1 , WANG Wang-tian2 ,
JI Yan-lin1 ,WANG Wei1
(1.Colleg e of Ag ronomy , Gansu Ag ricultural Univer sity , Lanzhou 730070 , China;2.Gansu Key Labo rato ry
o f C rop Genetic Improven & Germplasm Enhancement , Lanzhou 730070 , China)
Abstract:Mult iplex PCR and ELISA were used to detect the main vi rus of Lanzhou lily in orde r to in-
vestig ate the incidence in field , and to compare the tw o methods.The results show ed that multiplex PCR
amplif ied simultaneously three specific bands from samples w ith CMV , LSV and TBV through optimiza-
tion o f amplif ication condi tions.ELISA indicated that the incidence in f ield increased along wi th the years
of g row th ,3 years g row th>2 years g row th>1 year g row th.The virus-f ree ra te of plant let enhanced along
wi th the generation of tissue culture.T he co rrelation of ELISA to multiplex PCR was mo re than 90%, and
multiplex PCR had a higher specif icity and sensit ivity
Key words:Lanzhou Lily;virus;mult iplex PCR;ELISA detection;incidence
　　兰州百合(Li l ium davidi i Var unicolo r Co t-
to n)为甘肃省地方特产 ,具有很高的营养和药用价
值 ,在国内外久负盛名.兰州百合繁殖一般通过分
球 、株芽及鳞片扦插等无性繁殖方式进行 ,在此过程
中一旦感染病毒将在植株体内积累和传播 ,使植株
生长衰弱 、产量下降 、品质变劣.据调查 ,危害兰州百
合的病毒主要是黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic
vi rus , CMV)、百合无症病毒(lily symptomless vi-
DOI :10.13432/j.cnki.jgsau.2011.03.017
甘 肃 农 业 大 学 学 报 2011 年
rus , LSV)和百合斑驳病毒(li ly mot t le virus ,
LM oV)又称郁金香碎叶病毒(tulip breaking virus ,
TBV)3种 ,其分布广 、危害大 ,且多为复合感染[ 1] .
应用无毒苗是控制病毒病的主要措施之一 ,而高效
可靠的病毒检测技术是种苗无毒化生产和病毒病防
治的重要科学手段.
目前 ,已报道的百合病毒检测方法有指示植物
法 、电子显微镜技术 、酶联免疫法和分子生物学方法
等[ 2-4] .指示植物法虽然简单 ,但受季节限制 ,而且检
测速度很慢 ,灵敏度也较低;而且有些百合病毒仅由
蚜虫传播 ,也不适用指示植物法 ,使其应用局限性较
大[ 4] .本试验拟以 LSV 、TBV 和CMV的 RNA为检
测对象 ,研究多重 PCR检测技术在检测兰州百合病
毒方面的有效性和可靠性 ,并采用该方法对兰州百
合生产中的病毒病害发生情况进行调查 ,以期为兰
州百合种苗无毒化生产和病毒防治提供一定的技术
支持.
1　材料与方法
1.1　试验材料
2009年 6月 ,在兰州百合主要产地兰州市七里
河区和西固区 ,根据不同栽植年份及发病状况 ,随机
选 7块七里河区和 2块西固区种植的兰州百合田
块 ,随机确定取样点 ,分别采集 10株带有新鲜叶片
的植株 ,带回实验室 ,取上部叶后用自来水和无菌水
清洗 1遍 ,风干 ,置于-80 ℃超低温冰箱保存.另
外 ,选用经过不同脱毒处理后的试管苗.
1.2　病毒检测方法
1.2.1　引物设计　利用美国国立生物信息中心网
站搜素 LSV 、CMV 和 TBV 的 RNA 序列 ,然后对
LSV(AM422452.2)、CMV(AJ495841.1)和 TBV
(S44147.1)序列进行 BLAS T(basic lo cal alignment
search too l)相似性比较 ,找出 3种病毒 RNA 的高
度特异性区段.按照多重 PCR引物设计原则[ 5] ,利
用引物设计软件 Premier 5.0和 Olig o 6.22 ,针对 3
种病毒高度保守区段设计引物 ,使得设计的 3 对引
物在 PCR 扩增中得到的片段长度相差 200 bp 以
上 ,并且具有相似的扩增条件和扩增效率.设计的引
物提交基因公司合成 ,引物合成后 ,用 ddH 2O 溶解
到浓度为 20 μmol·L-1 .
1.2.2　RNA 提取　称取 0.1 g 叶片置于碾钵中 ,
加液氮研磨成粉;用美国 Invit rogen 公司 TrizoL 试
剂盒提取总 RNA ,溶解到 30 μL 焦碳酸二乙酯(di-
ethypy ro carbonate ,DEPC)处理过的 ddH 2O 中.用
1%的变性琼脂糖凝胶和溴化乙锭(ethidium bro-
mide , EB)染色后 ,在紫外灯下观察 RNA 的完整性.
1.2.3　多重 PCR检测　以总 RNA 为模板 ,用反
转录试剂盒(美国 MBI 公司产品)合成 cDNA 第 1
链 ,然后在 PTC-200 PCR仪上进行PCR扩增.反应
体系为:10 ×PCR 缓冲液 2.5 μL , dN TPs(10
mmol·L-1)1.5 μL ,上 、下游引物(10 μmol· L-1)
各 0.5μL , cDNA 第 1链 2μL ,无菌 ddH 2O补平到
25 μL ,混匀后用 15 μL 石蜡油覆盖.在 95℃变性 10
min 后加入 5 U ·μL-1 Taq DNA 聚合酶 0.5 μL;
PCR反应参数为:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性
40 s ,51 ℃复性 40 s , 72 ℃延伸 1 min ,共 35 个循
环;72 ℃延伸 10 min.PCR扩增产物用 1%琼脂糖
电泳.
1.2.4　双抗体夹心酶联免疫吸附检测法　取 0.3 g
样品 ,置于研钵中 ,加 3 mL 提取缓冲液 ,研磨成匀
浆后转移到 3 mL 离心管中 , 摇匀;4 ℃、14 000
r ·min-1离心 5 min ,将上清液转移到一干净的离
心管中 ,置-20 ℃保存备用.病毒检测所用抗体购
自英国 ANDGE 公司 ,测定方法按照的抗体说明书
提供的双抗体夹心酶联免疫吸附(double antibody
sandw ich assay ,DAS-ELISA)进行.
在试验条件恒定的情况下 ,利用标本/阴性对照
的比值进行分析.在得出标本(S)和阴性对照(N)的
A值后 ,计算 I/H 值=(样品的平均吸光值-阴性
对照的吸光值)/阴性对照的吸光值).数据判断标
准 ,阳性 I/H ≥2.1 ,疑似 1.5I/H ≤1.5.
1.3　检测分析
采用上述 2 种方法 ,对田间采集的 9份病样及
8份组培苗进行对比试验 ,以多重 PCR检测阳性数
与双抗体夹心 ELISA 检测阳性数之比为两者的阳
性符合数 ,并利用卡平方检测对上述 2 种方法的特
异性分别进行计算及比较.
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第 3 期 李瑛等:兰州百合病毒多重 PCR和 ELISA 检测体系的比较与应用
2　结果与分析
2.1　多重 PCR引物设计与评估
通过 BLAS T 对 3种病毒 RNA 序列的相似性
进行比较 , 确定 LSV(AM422452.2)1 ～ 2979 bp 、
CMV(AJ495841.1)1 803 ～ 2 227 bp 、 TBV
(S44147.1)1 010 ～ 1 555 bp为高度特异区段 ,三者
的同源性为9.08%.经过 Primer Premier 5.0 自动
设计引物后 ,利用 Oligo 6.22对新设计引物进行全
面评估 ,根据评估结果进行微调 ,使其基本符合核心
引物设计的要求(表 1).
由表 1可知 ,3对相差200 bp 的扩增产物上 、下
游引物 Tm 值最大达 74.4 ℃,最小为 68.6 ℃,差异
在 6 ℃以内;扩增产物的 Tm 值在 84.6 ～ 86.6 ℃之
间 ,它与引物之间的差异在 18 ℃以内;引发效率一
般在 400 ～ 500之间;上 、下游引物的引发效率差异
尽量控制在 70以内;避免 3′端形成二级结构 ,尤其
要避免 3′端能自我引发形成产物的情况 ,上 、下游
引物之间二聚体的形成主要控制在 2 ～ 4个碱基上;
上 、下游引物的 GC 含量在 47%～ 61%, PCR扩增
产物的 GC 含量控制在 44%～ 51%;3′端 G 值在
5.5 ～ 10.0.由此可见 ,通过引物之间相比 ,不同引物
具有了相似的序列特征 ,便可采用相同的扩增条件
进行扩增.
表 1　多重 PCR 引物设计结果
Tab.1　Results o f primer design fo r multiplex PCR
病毒 引物序列(U;L.5′※ 3′)
产物大
小/ bp
变性温度/ ℃
(U;L;P)
GC 含量/ %
(U;L;P) 引发效率
二聚体
(U;L;UL)
发夹
(U;L)
3′端 ΔG
(U;L)
LSV
GGTTCAACT TCCCCATGCCAG
CACGGGT TATGCTCACGAGG
729
74.4;
72.3;85.3
57.1;
60.0;45.4 470;456 4;2;3 0;0 9.8;9.9
TBV
CAAATCATGGCGCACT TCTCA
CAAATCATGGCGCACT TCTCA
514
72.9;
70.9;84.6
47.6;
52.2;44.6 486;476 4;4;3 0;0 6.8;5.8
CM V
GCCGTCCTCGTGTATTCAAA
ACGGACCGAAGTCC TTCC
346
69.5;
68.6;86.6
50.0;
61.1;50.6 427;405 2;3;3 0;4 7.4;8.2
　　注:U.上游引物序列;L.下游引物序列;P.扩增产物;UL.上下游引物序列.
2.2　多重 PCR检测兰州百合病毒的效果
在进行多重 PCR之前先进行单对特异性引物
进行扩增 ,分别得到了分子量约 700 bp 、500 bp 和
350 bp的片段(图 1).CMV 、LSV 和 TBV 在单对
引物扩增条件的基础上 ,将 3 对特异性引物加入同
一反应管内 ,经多重 PCR同时扩增出了 729 bp ,514
bp和 346 bp的特异性片段(图 1).将经过 5代脱毒
的健康组培苗作为病毒检测的对照(图1).由图1
注:M.核酸分子量标准Ⅱ;1.CM V+TBV+LSV;2.LSV;
3.TBV;4.CMV;5.健康植株叶片.
图 1　多重 RT-PCR 特异性试验
Fig.1　Specificity of multiplex-RT-PC R
可见 , 3种病毒扩增的各个片段与预期设计的片段
大小相符.组培苗的脱毒效果较好.
2.3　兰州百合田间发病调查结果
利用双抗体夹心 ELISA 对兰州百合田间发病
进行调查 ,分析测定结果可进一步证明兰州百合中
含有 LSV 、CMV 和 TBV.数据显示 LSV 的阳性检
出率为 66.7%;CMV 的阳性检出率为 33.3%,疑似
率为 33.3%;TBV 的阳性检出率为 25%.由上述数
据表明 ,病毒含量随种植年限的增加而增加 ,3年生
>2年生>1年生的兰州百合;脱毒组培苗的检测时
发现 ,脱毒率随培养代数的增加而增加 ,且茎尖培养
结合热处理的脱毒效果高于其他脱毒培养的
(表 2).
2.4　2种检测方法的比较分析
通过对 9份田间病株和 7份脱毒组培苗进行两
种不同方法的病毒检测 ,证明两者有较高的符合率 ,
且符合率在 90%以上(表 3).经卡平方检测 ,多重
PCR的卡平方小于χ22 , 0.975 =0.05 ,即不同病毒之间
61
甘 肃 农 业 大 学 学 报 2011 年
表 2　双抗体夹心 ELISA 测定结果
Tab.2　Results o f DAS-ELISA(D405)
样品 I/ H
LSV CMV TBV
阳性对照 7.16 5.37 4.56
西果园西果村
2 年生 4.37 1.98 1.04
3 年生 7.89 2.58 2.67
2 年生 3.06 1.86 2.63
3 年生 7.89 2.20 2.37
1 年生 1.81 1.96 1.71
西果园青岗村 5.59 2.01 2.47
西果园袁家湾 1.51 1.65 1.58
西固区大金沟 8.54 2.52 1.12
西固区百合基地 8.74 2.99 2.40
病毒唑脱毒 4 代组培苗 0.97 0.43 0.71
病毒唑脱毒 2 代组培苗 1.62 0.27 1.67
茎尖脱毒培养 2 代组培苗 1.41 0.24 1.04
恒温热处理组培苗 2.25 0.96 0.87
变温热处理组培苗 1.48 0.71 0.69
病毒唑+变温热处理组培苗 0.79 0.33 0.41
茎尖培养+恒温热处理组培苗 0.33 0.31 0.24
表 3　多重 PCR与双抗体夹心 ELISA检测对比试验结果
Tab.3　Results o f compare multiplex PCR with DAS-ELISA
病毒 多重 PCR检测植株 带毒植株
双抗体夹心 ELISA
检测植株 带毒植株 符合率/ %
LSV 12 9 12 10 90
CMV 12 9 12 9 100
TBV 12 8 12 8 100
χ2c 0.0374 0.0526
无显著相关;而双抗体夹心 ELISA 大于 χ22 , 0.975 =
0.05 ,即不同病毒之间有显著相关.因此 ,多重 PCR
的特异性和敏感性较好.
3　讨论与结论
目前 , Lee 等[ 6] 利用电子显微镜观察到百合样
品中呈丝状 、弯杆状和杆状的病毒粒子 ,但由于电镜
技术需用电子显微镜 ,而且样品的制备费用较高 ,所
以电子显微镜技术应用受到一定的限制.酶联免疫
吸附法 (enzyme-linked immunoso rbnent assay ,
ELISA)和点免疫结合试验(do t-immunobinding as-
say ,DIBA)是目前百合病毒检测的常规方法[ 7-10] ,
具有灵敏度较高和测定方便的特点.但 ELISA 方法
只能检测到纳克水平的病毒 ,难于检测更低浓度的
病毒[ 11] .在病毒检测方面 , 核酸分子杂交 、双链
RNA 电泳 、反转录聚合酶链式反应(reverse tran-
scription polyme rase chain reaction , RT-PCR)以及
基因芯片等分子生物学技术的应用均有研究.其中 ,
RT-PCR技术具有无放射性危险 ,可检测到飞克数
量级的植物病毒 ,已被证实是目前特异性最强 、灵敏
度最高的病原检测方法 ,现已广泛应用于病毒诊断
和检测[ 12-13] .在此基础上 ,人们又开发了用于植物病
毒检测的多重 PCR技术(mult iplex PCR),可以一
次检测出多达 6 种植物病毒[ 14] ,在复合侵染诊断
中 ,不仅可以大大提高检测效率 ,又可以显著降低试
验成本 ,具有很高的实际应用价值.在百合属植物
上 ,王继华等[ 15] 、徐榕雪等[ 16] 、Yoshiji等[ 17] 研究开
发了以外壳蛋白基因序列为依据 ,应用二重或三重
RT-PCR 的方法检测花卉百合 LSV 、LM oV 和
CMV的方法.
一个理想的多重 PCR反应体系需要对目的产
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第 3 期 李瑛等:兰州百合病毒多重 PCR和 ELISA 检测体系的比较与应用
物进行全面分析 、反复试验 ,建立适宜的反应体系和
反应条件.本试验通过选择兰州百合中常见 3 种病
毒的 RNA序列 、利用 Prem ie r 5.0和 Oligo 6.22全
面评估设计引物 、反复试验后最终建立适合于兰州
百合病毒检测的体系.首先 ,多重 PCR的目标是多
个目的片段的扩增 ,为了保证基因检测的准确性 ,通
过 DNAMAN和 BLAST 选择具有高度特异性的目
的片段 ,且 3个扩增片段之间相差约 200 bp ,以利于
鉴别产物和每对引物的扩增效果.其次 ,引物的设计
是 PCR反应成败的关键 ,对多重 PCR尤其重要.多
重 PCR包含多对引物 ,各个引物必须高度特异 ,避
免非特异性扩增;不同引物对之间互补的碱基不能
太多 , 否则引物之间相互缠绕 , 严重影响反应结
果[ 5] .再次 ,复性温度与时间取决于引物的长度 、碱
基组成及其浓度 ,还有目的片段的长度.试验通过
O lig o 6.22得到 LSV 、TBV 和 CMV 的退火温度分
别为56.4 ℃、55.5 ℃和 56.2 ℃,遵循多重 PCR的
设计原则 ,同时结合三者的 Tm 值分别降低 4 ～ 6
℃,最终得到适合于兰州百合多重 PCR病毒检测的
复性温度为 51 ℃,而复性时间略微延长 ,可使引物
与模板之间完全结合.最后 ,延伸反应的时间要根据
待扩增片段的长度而定 ,延伸时间不宜过长 ,否则会
导致非特异性扩增带的出现.多重 PCR扩增试验初
期 ,由于提取的总 RNA 背景复杂 ,因此 ,对引物和
模板 DNA的量要适当 ,过高的引物和模板易造成
非特异扩增样品 ,而特异性扩增产物量过多 ,电泳时
出现特异性条带过宽 、亮度太强 ,也会影响其他条带
的鉴定 ,调节引物浓度和模板可以限制过多特异
PCR产物的产生.总之 ,在单一 PCR的基础上 ,遵
循引物组合的一般原则 ,适当调整反应条件 ,不难建
立多重 PCR反应体系.
试验采用双抗体夹心 ELISA 对兰州百合田间
发病进行调查.结果表明 ,兰州百合起源地兰州市七
里河区西果园袁家湾原种的带毒率较小 ,随着兰州
百合的广泛种植 ,其他区域植株的含毒量较高;随种
植年限的增加带毒率增加 , 3年生>2 年生 >1 年
生;通过脱毒的组培苗 ,脱毒率随培养代数的增加而
增加 ,且茎尖培养结合热处理的脱毒效果高于其他
脱毒培养的.
试验还利用卡平方检测对多重 PCR和双抗体
夹心 ELISA 进行了特异性和敏感性比较 ,但由于二
者的特异性都较高(χ22 , 0.05 =5.99),在卡平方检测
时选择 a=0.975 , v=2的值进行对比.结果显示 ,两
者的符合率在 90%以上 ,多重 PCR的特异性高于
双抗体夹心 ELISA 法.因此 ,多重 PCR可在一份样
品中同时检测出 3种病毒 ,达到多种病毒的同时检
测的目的 ,比双抗体夹心 ELISA 的检测效率高 ,检
测成本低 ,对兰州百合中这 3种病毒的混合侵染检
测具有重要的应用价值.
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