全 文 ：第 33卷 第 2期 生 态 科 学 33(2): 262−268
2014 年 3 月 Ecological Science Mar. 2014

收稿日期: 2013-03-11; 修订日期: 2013-11-25
基金项目: 中国科学院知识创新工程重要方向性项目(KSCX2-EW-G-12C); 国家自然科学基因项目(41176101); “十一五”国家科技支撑计划重点项目
(2012BAC07B0402); 热带海洋环境国家重点实验室(中国科学院南海海洋研究所)开放课题(LTO1408)
作者简介: 吴鹏(1985—), 男, 博士研究生, 研究方向为海洋生态, E-mail: wupeng980521@163.com
*通信作者: 王友绍, 男, 教授(二级), 博士生导师, E-mail: yswang@scsio.ac.cn

吴鹏, 王友绍, 张建东. 珠江口萘双加氧酶基因多样性及其与环境因子相关性分析[J]. 生态科学, 2014, 33(2): 262−268.
WU Peng, WANG Youshao, ZHANG Jiandong. Diversity of ndo genes in sediments of the Pearl River estuary in relation to environ-
mental variables [J]. Ecological Science, 2014, 33(2): 262−268.

珠江口萘双加氧酶基因多样性及其与环境因子相关
性分析
吴鹏 1,2, 王友绍 1,2,*, 张建东 1,2
1. 中国科学院南海海洋研究所热带海洋环境国家重点实验室, 广州 510301
2. 中国科学院大亚湾海洋生物综合试验站, 深圳 518121

【摘要】 选取珠江口上游到下游的四个站点采用 16S rRNA-DGGE 方法分析了珠江口表层沉积物中微生物群落结构。
结果表明: 四个站点中微生物组成差别较大, 并且珠江口上游的微生物多样性稍低于下游。基于萘双加氧酶基因(ndo
基因)的 DGGE 分析则表明珠江口上游和下游区域中的 ndo 基因多样性(站点 A1 和 A4)高于珠江口中游(站点 A2 和
A3)。为了进一步探讨环境因子与 ndo 基因分布的相关关系, 典型对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)发
现站点 A1 中 ndo 基因组成主要受 NH4-N 影响, 该基因在站点 A2 的分布主要与 SiO3-Si 正相关, 而站点 A4 的该基因
组成则与盐度的相关性较高。研究结果能为珠江口的 PAHs 生物降解提供重要理论参考。

关键词：多环芳烃; 萘双加氧酶; 上覆水; 典型对应分析
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2014.02.010 中图分类号：Q938.1 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2014)02-262-07
Diversity of ndo genes in sediments of the Pearl River estuary in relation to
environmental variables
WU Peng1,2, WANG Youshao1,2,*, ZHANG Jiandong1,2
1. State Key Laboratory of Tropical Oceanography, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences,
Guangzhou 510301, China
2. Daya Bay Marine Biology Research Station, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518121, China
Abstract: Surface sediments across a four-site transect along the upstream to the downstream of the Pearl River estuary were
examined. Bacterial community compositions were firstly characterized using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
analysis of bacterial 16S rRNA gene. Bacterial community compositions were quite different in this estuary, and the diversity of
bacteria in the upstream was lower than the downstream. Based on the PCR-DGGE analysis of ndo gene, the diversity of ndo gene
in the upstream and downstream (sites A1 and A4) was higher than the middle stream (sites A2 and A3). To further explore the
relationships between the distribution of ndo genes and environmental factors, canonical correspondence analysis (CCA) was
conducted. The composition of ndo gene at site A1 was significantly influenced by NH4-N, while the concentration of SiO3-Si
displayed positive correlation with this gene composition at site A2. However, salinity had a positive influence on the gene
composition at site A4. This study can provide for a broader estimation of the PAHs biodegradation potential in this estuary.
Key words: Polycyclic aromatic hydrocarbons; naphthalene dioxygenase; overlying water; canonical correspondence analysis (CCA)
2 期 吴鹏, 等. 珠江口萘双加氧酶基因多样性及其与环境因子相关性分析 263

1 前言
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)
是一类含有两个或两个以上的苯环并以线形排列、弯
接或簇聚的方式而构成的化合物, 而它主要来源于
人类活动和能源利用过程[1–2]。由于 PAHs 具有潜在
的致癌及致畸特性, 已引起各国环境科学家的极大
重视。美国环保局在 20 世纪 70 年代就将 16 种 PAHs
列为环境优先监测污染物[3]。PAHs 溶解度在水体中
都较低, 而且它随着分子量的增加而降低, 这也使
得沉积物是 PAHs 主要的“汇”[4]。因为广东省快速
的经济增长和城市化, 珠江三角洲的污染问题受到
极大关注。而溢油事件, 煤炭和木材燃烧, 尾气排放
和自然释放原因使得 16 种优先监测的 PAHs 在珠江
各河段沉积物都被监测到, 该 16 种 PAHs 总和在
415—14497 (ng·g–1, 干重)范围[3,5]; 而目前已有报道
发现 16 种 PAHs 总和含量最高值为美国 Elizabeth河
(151000 ng·g–1, 干重); 在世界其他区域该值普遍在
102—103 级别[3]。由此可见珠江口 PAH 污染还是较
严重, 但目前珠江口 PAHs 研究主要集中在 PAHs 在
水体和沉积物中的时空分布规律和特征[3,6–8]。然而,
以往研究表明PAHs能够对沉积物微生物群落结构和
功能产生重要的影响[9–11], 但是目前缺乏关于珠江口
PAHs降解菌的研究。在16种优先控制的PAHs中, 由
于萘的水溶性相对较高, 萘通常作为模式化合物被
研究。自从第一个 PAHs 降解菌—pseudomonas 菌对
萘降解的报道以来[12], 很多研究关注萘的微生物降
解, 例如: 萘的降解途径, 降解基因和降解酶[9,13–15]。
萘双加氧酶(naphthalene dioxygenase, NDO)是启动
低分子量 PAHs 有氧代谢的关键酶系统[9–10]。目前发
现很多基因能参与 NDO 酶的 Rieske 型铁硫蛋白 α
亚基的编码, Gomes 等[10]针对该酶中的 Rieske 型铁
硫蛋白 α亚基设计了简并引物来扩增ndo基因, 并发
现具有很好的特异性。该 ndo 基因主要包括了 nahAc
和 phnAc 两类基因。环境因子能够影响微生物群落
结构组成, 环境因子的异质性能形成微生物的区域
—分类群单元[16–18]。例如: 西太平洋“暖池”的氨
氧化菌就与南海和南极沉积物中的明显不同[17]。本
课题组已有研究发现环境因子 NO2-N、pH 和 SiO3-Si
是决定珠江口微生物群落结构的重要因素[18]。本研
究的主要目标有 : 通过变性梯度凝胶电泳 (PCR-
DGGE)的方法来分析 ndo 基因在珠江口不同区域表
层沉积物中的分布; 利用统计学的方法分析决定珠
江口 PAHs 降解菌分布的潜在关键环境因子。该研
究为阐明 ndo 基因在珠江口沉积物中分布提供基本
资料, 为珠江口 PAHs 污染的微生物治理提供理论
基础。
2 材料与方法
2.1 研究区域和野外采样
通过“沉积物—水界面柱状采泥器”于 2009 年
8 月份在珠江口 4 个站点采集表层沉积物(0—2 cm)
和上覆水样品, 具体站位如图 1。采集装置中的上覆
水通过虹吸法采集, 而沉积物采集后置于聚乙烯袋
中密封, 并储存于–20℃。
2.2 上覆水理化参数测定
上覆水参数的测定参照《海洋化学调查技术规
范》[19], 溶解氧(Dissolved Oxygen, DO), 盐度和 pH
通过 YSI 6000 水质仪(YSI Incroporated, USA)进行
原位测定。
2.3 沉积物基因组 DNA 的提取
沉积物基因组 DNA 通过 E.Z.N.A. Soil DNA Kit
(OMEGA)提取, 每个站点取 0.4 g 沉积物样品并分
别提取三次。
2.4 沉积物总 DNA 中 16S rRNA 基因扩增
为了阐明珠江口中微生物多样性, 本研究先通

图 1 珠江口采样站位图
Fig. 1 The sampling sites in the Pearl River estuary
264 生 态 科 学 33 卷

过 PCR-DGGE 的方法扩增 16S rRNA 基因片段。将
提取的各站点的三份总DNA先混合, 然后以此为模
板进行巢式 PCR 扩增 16S rRNA。第一轮 PCR 先通
过引物 27F 和 1492R 扩增[20], 第二轮 PCR 则通过引
物 341F (5’端加上一个 40 bp 的 GC 夹)和 518R[21]。
每个 PCR反应分别进行 2次, 然后用于DGGE分析,
考察 PCR 反应是否会产生偏好性。
2.5 沉积物总 DNA 中 ndo 基因扩增
同样采用巢式 PCR 的方法进行扩增 ndo 基因。
首轮 PCR 采用引物 NAPH-1F (5’-TGGCTTTTCYT
SACBCATG-3’)和引物 NAPH-1R (5’-DGRCATSTC
TTTTTCBAC-3’)[10]。PCR反应体系: 10×PCR Buffer
5 μL, 0.1 μM 引物 NAPH-1F 和 NAPH-1R, 5 mM
dNTPs, 1.25U Taq DNA polymerase (Takara,Japan),
2500 ng牛血清蛋白和1 μL模板DNA(5—30 ng·μL−1),
加超纯水至 50 μL。PCR 反应参数为: 95 ℃预变性
5 min; 38循环的94 ℃ 1 min, 53 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min;
最后 72 ℃延伸 10 min。第二轮 PCR 以首轮 PCR 产
物为模板, 引物为 NAPH-2F (5’-TATCACGGCTGG-
3’)和带 40 bp GC 夹的 NAPH-2R (5’-ATSTCTTTTT
CBAC-3’), 其中 GC 夹在 5’端。反应体系同上。PCR
反应参数为: 94 ℃预变性5 min; 34循环的95 ℃ 1 min,
51 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 2 min; 最后 72 ℃延伸 10 min。
2.6 16S rRNA 和 ndo 基因的 DGGE 分析
采用 Bio-Rad 公司 Dcode TM 的基因突变检测
系统分别对两类基因的 PCR 产物进行分析。聚丙烯
酰胺胶浓度均为 6%; 两类基因的变性剂浓度有所
不同, 其中 16S rRNA 基因的变性剂浓度为 45%—
60% (100%变性剂为 7 mol·L–1的尿素和 40%的去离
子甲酰胺的混合物), 而 ndo 基因的变性剂浓度为
26%—58%; 电泳条件都为 60℃ , 1×TAE Buffer,
120 V 电压下电泳 9 h。电泳结束后在 EB 染色液中
染色 20—30 min, 然后在 AlphaImager 成像系统中
拍照。
2.7 DGGE 数据分析
采用 Quantity one 4.6 软件对 DGGE 图谱进行
条带模式化处理和 UPGMA(an unweighted pair
group method arithmetic average)聚类分析[7]。根据
DGGE 图谱中的条带位置和亮度, 采用 Quantity one
4.6 软件对 DGGE 图谱进行数字化处理后, 通过
BIODAP 软件计算 shannon 指数和 simpson 指数[22];
此外通过 CANOCO 4.5 软件进行典型对应分析
(canonical correspondence analysis, CCA)来研究珠
江口萘双加氧酶基因的多样性及其与环境因子的
相关性[23]。
3 结果与分析
3.1 珠江口 16S rRNA-DGGE 指纹图谱分析
珠江口四个站点沉积物中的细菌 16S rRNA-
DGGE 图谱如图 2 所示。图中各泳道中显示的条带
数可以反映该站点中微生物的多样性; 而条带信号
的强弱, 可以反映该物种的相对数量。各站点中两
平行样间的 DGGE 条带位置和数量相似, 这表明
PCR 过程没有偏好性扩增。站点 A1 和 A3 的条带数
为 6 左右, 而站点 A2 和 A4 为 10。不同站点间的微
生物群落结构具有很大差别。
3.2 珠江口 ndo-DGGE 指纹图谱分析
珠江口沉积物中基于 ndo 基因的 DGGE 指纹图
谱分析如图 3 所示: A1 站点的条带数为 4—5 条; A3
站点为 4 条; A2 站点为 3 条; 而 A4 站点为 4—8 条。
珠江口总共有 15 种微生物携带 ndo 基因。通过
UPGMA 分析表明: 站点与站点之间携带 ndo 基因
的微生物还是具有很大差别, 但是相同站点的平
行样中携带 ndo 基因的微生物具有很好的相似性

图 2 珠江口中 16S rRNA 的 DGGE 指纹图谱分析
Fig. 2 DGGE analysis of bacteria in the Pearl River
estuary; the labels of A2, A10, A14 and B4 at the top of the
lanes represent corresponding sample sites
2 期 吴鹏, 等. 珠江口萘双加氧酶基因多样性及其与环境因子相关性分析 265

(图 4)。根据 DGGE 图谱中的条带位置和亮度, 采用
Quantity one 4.6 软件进行 UPGMA 分析可以看出关
于 ndo 基因组成的每个站点基本上聚在一簇中, 站
点 A1 的 ndo 基因组成大约与其他的 3 个站点相似
性在 30%, 而站点 A3 的相似性和站点 A2 达到
60%(图 4)。

图 3 珠江口中 ndo 基因的 DGGE 指纹图谱分析
Fig. 3 PCR–DGGE analysis of ndo gene obtained from Pearl River estuary
266 生 态 科 学 33 卷


图 4 珠江口中 ndo 基因的聚类分析
Fig. 4 UPGMA dendrogram constructed using ndo-DGGE
profile from Pearl River estuary
3.3 ndo 基因的多样性分析
根据 ndo 基因在 DGGE 图谱中的条带位置和亮
度, 采用 Quantity one 4.6 软件对 DGGE 图谱进行数
字化处理。然后通过 BIODAP 软件计算 shannon 指
数和 simpson 指数。表 1 所示: ndo 基因的 Shannon
指数(H’, E)在站点 A1、A4 和 A3 较高, 而在站点
A2 最低; Simpson 指数(1/D)分析发现其在站点 A1
和 A4 较高, 而在 A2 和 A3 相对较低。Shannon 指数
主要反映微生物丰度[24], 而 simpson 指数(1/D)主要
反映优势种的多样性[25]。
3.4 珠江口沉积物上覆水的理化参数
珠江口4个站点沉积物中上覆水参数显示在表2。

表 1 珠江口沉积物 ndo 基因多样性指数分析
Tab. 1 Diversity indexes of ndo gene fragment from Pearl River estuary
ndo 基因多样性指数 站点 A1 站点 A2 站点 A3 站点 A4
H’ 1.32±0.02 0.73±0.05 1.19±0.04 1.75±0.35
Shannon 指数(H’, E)
E 0.95±0.01 0.67±0.04 0.85±0.02 0.95±0.02
D 0.20±0.02 0.55±0.04 0.61±0.54 0.11±0.07
Simpson 指数(D, 1/D)
1/D 5.08±0.44 1.82±0.12 2.52±1.42 10.92±4.95

表 2 珠江口沉积物上覆水的理化参数
Tab. 2 Overlying water characteristics of the Pearl River estuary
站点 经度/o 纬度/o NH4-N /(mg·L–1)
SiO3-Si
/(μmol·L–1)
PO4-P
/(mg·L–1)
NO3-N
/(μmol·L–1)
NO2-N
/(μmol·L–1) pH 盐度
溶解氧
/(mg·mL–1)
A1 113.433 23.086 2.41 29.82 0.052 109.16 12.04 7.21 0.17 12.56
A2 113.75 22.51 0.17 59.46 0.009 114.49 5.24 7.8 16.94 11.73
A3 113.615 22.215 0.18 41.25 0.047 85.62 0.35 7.59 14.07 4.77
A4 113.722 22.12 0.30 35.89 0.020 74.06 5.04 7.96 30.34 5.04

各站点的理化参数间的差别较大, 特别体现在珠江口
上游到下游的这种区域分布。从表中可见, NH4-N、
PO4-P、NO2-N和DO在站点A1最高分别为2.41 mg·L–1,
0.052 mg·L–1, 12.04 μmol·L–1和 12.56 mg·mL–1; 而位于
珠江上游的 A1 站点的 SiO3- Si 和盐度最小; NO3-N 在
站点 A1 和 A2 的浓度高于站点 A3 和 A4。pH 值则在
各站点都为弱碱性, 数值在 7.21 到 7.96 之间。
3.5 具有 ndo 基因的微生物群落与上覆水理化指标
的相关性分析
通过 CANOCO 4.5 软件对珠江口四个站点的物
种数据首先进行去趋势对应分析(etrended corres-
pondence analysis, DCA), 发现该物种数据可以用
CCA方法来分析微生物群落结构与环境因子之间的
相关性。将珠江口 ndo-DGGE 图谱的数值化结果和
上覆水的理化指标相结合进行 CCA 分析, 其结果在
表 3 中显示。Monte Carlo per-mutation test 显示 8 个
特征参数(NH4-N、SiO3-Si、PO4-P、NO3-N、NO2-N、
pH、盐度和 DO)与 AX1 轴及全部排序轴均有显著的
相关性。表 3 显示第 1 排序轴解释了样本中 27.4%的
变异, 前三个排序轴合并解释了 58.6%的样本变异。
第 1 和第 2 排序轴的种-环境相关系数分别为 0.990
和 0.964, 这说明珠江口沉积物中携带 ndo 基因的微
生物群落结构和环境因子间存在很强的关联。同时前
2 个排序轴种-环境累积百分率就高达 78.9%, 这充分
解释了环境与微生物物种之间的相关性。
图 5 是由 AX1 和 AX2 轴生成的二维排序图。
第 1 排序轴与盐度正相关(r= 0.7647), 而与 NO3-N
(r= –0.9145)和 DO(r= –0.7599)负相关。第 2 排序轴
与SiO3-Si呈正相关(r=0.8307), 而与PO4-P呈负相关
(r= –0.9399)。站点 A1 出现的条带(条带 4、12 和 14)
主要与 NH4-N 正相关。站点 A2(条带 3 和 5)主要与
SiO3-Si 相关。站点 A4 则与盐度的相关性较高。
2 期 吴鹏, 等. 珠江口萘双加氧酶基因多样性及其与环境因子相关性分析 267

表 3 典型对应分析结果
Tab. 3 Summary of the results of Canonical Correspond-
ence analysis
项目 AX1 AX2 AX3
特征值 0.666 0.457 0.301
种-环境相关系数 0.990 0.964 0.951
种累积百分比变化率 27.4 46.2 58.6
种-环境累积百分比变化率 46.8 78.9 100
4 讨论
过去的研究发现有机污染物能够很明显的影
响微生物群落结构, 高浓度的污染物甚至能够降低
微生物的多样性[4,26]。因此, 污染物降解菌的研究
是目前一个热点。科学家们也试图从环境中分离出
能够降解污染物的微生物。但是由于传统的方法固
有的缺陷, 99%的微生物不能够从境中分离。DGGE
技术可以利用非可培养的优点来分析环境中微生
物的群落结构。
基于 16S rRNA-DGGE 图谱发现珠江口中微生
物群落具有较大的差别。由于 DGGE 技术主要反映
的是特定环境下占优势的该类微生物, 从图 2 可知
微生物在珠江口沉积物中的数量不是很多(每个站
点大约在 6—10 种微生物), 并且珠江上游的微生物
多样性稍微低于下游。为了进一步探讨萘降解菌在

图5 具ndo基因的微生物与上覆水理化子的典型相关性分析
Fig. 5 Canonical correspondence analysis (CCA) ordina-
tion diagram of ndo-DGGE profile, with environmental
factors as arrows and individual abundant bacterial phylo-
types as triangles
珠江口中的分布, 我们采用 DGGE 的技术首次分析
了 ndo 基因在珠江口沉积物中的微生物多样性。从
Shannon 指数分析发现珠江口中 ndo 基因在上游和
下游区域(站点 A1 和 A4)的多样性高于珠江口中游-
浑浊带(站点 A2 和 A3)。但是总体而言, 珠江口的
ndo 基因多样性和其他地区相当, Shannon 指数都在
0.7—1.8 之间(表 4)。
环境因子在塑造微生物群落结构时起着重要的
作用。为了进一步阐明珠江口中携带 ndo 基因的微
生物与环境因子相互作用关系, 本研究通过 CCA 方
法分析了两者之间的关系(图 4)。站点 A1 携带 ndo
基因的微生物主要与 NO3-N 正相关。站点 A2 的主
要受 SiO3-Si 影响。站点 A4 则与盐度的相关性较高。
本研究发现珠江口各站点中携带 ndo 基因的微生物
与环境因子的相关性很高。这与本课题组曾经分析
珠江口微生物与环境因子的关系极其相似。本课题
组通过 CCA 方法分析了 16S rRNA 基因和环境因子
之间的关系发现: 珠江口站点 A4 的微生物主要受
盐度和 pH 值影响, 而 A2 站点受 SiO3-Si 影响, 站点
A1 则受 NH4-N 的作用明显[18]。可见珠江口上游的
微生物主要受河流冲淡水的影响, 河流带入大量的
营养盐; 而珠江下游的微生物主要受外海海水的影
响, 主要体现在盐度和 pH 的影响。中间浑浊带的微
生物与各个环境因子的作用关系都较强。
总之, 本研究通过 PCR-DGGE 方法首次分析了
珠江口中 ndo 基因多样性, 并通过 CCA 分析发现珠
江口的微生物受环境因子的影响。进一步的研究将
集中在: 第一, 通过不可培养的手段(克隆文库构建
或 RFLP 方法)探讨珠江口 PAHs 降解菌的种类; 第
二, 采用定量 PCR 方法分析珠江口 PAHs 降解菌的
丰度。通过这两方面内容结合环境中 PAHs 含量变
化和环境理化因子分析为珠江口 PAHs 环境污染问
题提供重要理论根据。

表 4 基因 ndo 在珠江口及其他环境中的 shannon 指数分析
Tab. 4 The shannon index analysis of ndo gene in natural
environment from various international location
站点 Shannon 指数 文献
A1 1.32 本研究
A2 0.73 本研究
A3 1.19 本研究
A4 1.75 本研究
Camargue (法国) 0.852 [11]
Berre (法国) 1.74 [11]
King George Bay (南极) 约 1.0 [27]
268 生 态 科 学 33 卷

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