全 文 ：中国农业科学 2012,45(2):338-345
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.02.016

收稿日期：2011-07-21；接受日期：2011-10-31
基金项目：国家自然科学基金项目（31071582）、浙江省钱江人才计划项目（2009R10033）、宁波市农业择优委托项目（2010C10017）
联系方式：翁佩芳，Tel: 13566315678；E-mail: weng-pf@163.com。通信作者吴祖芳，Tel：0574-87609573；E-mail:wuzufang06@yahoo.com.cn


榨菜低盐腌制细菌群落多样性的分析
翁佩芳，陈 希，沈锡权，吴祖芳，任 静
(宁波大学生命科学与生物工程学院/应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江宁波 315211)

摘要：【目的】揭示在低盐浓度条件下榨菜不同盐度腌制体系细菌种群分布及优势菌变化规律，为进一步确
定微生物类型与榨菜腌制质量品质之间的相关性提供微生物学基础。【方法】采用 16S rDNA 基因克隆文库及克隆
子分析方法，对 5%和 7%盐度条件下榨菜腌制体系的微生物多样性、优势种群及其变化规律进行分析。【结果】5%
盐度腌制体系的中前期优势种群为乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和魏斯氏菌属
(Weissella)；7%盐度腌制体系的中前期优势乳酸菌为希腊魏斯氏菌（Weissella hellenica）；腌制后期，起主
导作用的种群均变成了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。在 5%盐度腌制条件下 pH 下降较快，在第 10 天
最低达 3.79；而 7%盐度条件下，pH 变化相对较慢在第 20 天达最低为 4.49，相对应其乳酸菌数量前者生长较快，
在第 10 天达到 3.22×108 CFU/mL，而在 7%盐度条件下乳酸菌数量减少相差近 100 倍；经腌制 3 个月的半成品其
硝酸盐和亚硝酸盐含量分别在 320 mg·kg-1和 2.9 mg·kg-1。【结论】 采用 16S rDNA 克隆文库法可检测榨菜低盐
腌制过程微生物多样性。低盐条件下腌制 pH 始终呈下降趋势最后稳定在 3.9-4.0；5%盐度腌制较适合乳酸菌的
生长，其早期优势菌主要有乳杆菌属、明串珠菌属和魏斯氏菌属;7%盐度时腌制前期优势菌种为希腊魏斯氏菌；
最后起主导作用的种群均为植物乳杆菌。低盐腌制后硝酸盐和亚硝酸盐含量显著低于传统高盐腌制工艺，其它
无显著差异。
关键词：榨菜；腌制；低盐浓度；16S rDNA 克隆文库；优势种群

Microbial Community Diversity Analysis During the Pickled
Processing of Mustard Tuber with Low-Salinity
WENG Pei-fang, CHEN Xi, SHEN Xi-quan, WU Zu-fang, REN Jing
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University /Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of
Education, Ningbo 315211)

Abstract：【Objective】 Microbial community structure, population changes of microorganism and the quality characters of
pickled vegetables were investigated, respectively, in order to elucidate the predominant microorganisms involved in pickled
processing of mustard tuber under the condition of low salt concentration.【Method】 By means of 16S rDNA clone library and clone
units analysis, the microbial diversity, predominant community and its changes were conducted during different fermentation phases
at 5% and 7% salinity of pickled mustard tuber.【Result】 The results showed that Lactobacillus, Leuconostoc and Weissella were the
predominant community at the early stage of the 5% salt concentration system, but the dominant microorganism at 7% system was
Weissella hellenica. At the late phase of pickled processing, Lactobacillus plantarum played a leading role in the pickled system of
mustard tuber. In addition, the pH change descended quickly at the 5% salt concentration, reached the lowest value of 3.79 within 10
days, but it reached 4.49 at 7% salt concentration within 20 days. In contrast, the population of lactic acid bacteria increased rapidly
at lower salinity, which reached the 3.22×108CFU/mL at the 10th day, the total population of lactic acid bacteria was the 100 times
lower compared to that of 7% salinity. The content of nitrate and nitrite in pickled product of three month preservation reached 320
2 期 翁佩芳等：榨菜低盐腌制细菌群落多样性的分析 339
mg·kg-1 and 2.9 mg·kg-1, respectively. 【Conclusion】 Microbial diversity of pickled mustard tuber could be investigated by 16S
rDNA clone library method. The pH value always descends until a stable level between 3.9 and 4.0. Low salt concentration is
benefitical to the growth of lactic acid bacteria and the predominant species are Lactobacillus, Leuconostoc and Weissella at the early
phase under the 5% salinity pickling. But the main species become Weissella hellenica at 7% salinity. The crucial microorganism is
Lactobacillus plantarum in the stable periods of pickling. The content of nitrate and nitrite in pickled product is greatly lower
compared with the traditional processing of pickled mustard tuber. No significant difference of other components occurred between
them.
Key words: mustard tuber; pickling; low salt concentration; 16S rDNA colone library; predominant community

0 引言
【研究意义】榨菜（Brassica juncea coss var.
tsatsai）是中国特产，属于世界三大酱菜之一，榨菜
在中国的种植面积广，产量高，是主要的腌制加工蔬
菜之一[1]，传统的榨菜腌制加工多采用高盐浓度，但
易消耗大量水资源及产生高盐废水或制品营养损失等
一系列问题[2]。在低盐腌制条件下，榨菜腌制过程中
微生物组成丰富，不同微生物种群由于其生长与代谢
特性的差异，对腌制品的营养与感官品质及保存质量
产生显著的影响[3-5]。因此，对于榨菜自然发酵腌制特
别是在低盐浓度条件下微生物体系的研究特别重要。
【前人研究进展】环境中微生物种类繁多，目前这些
微生物无法用现有技术培养[6]；自从 Pace 等[7]首次将
16S rRNA 基因序列分析技术应用于环境微生物区系
中微生物的分类鉴定和系统发育关系以来，关于环境
微生物群落研究的报道也很多，目前已在肠道菌群、
土壤微生物群落和海洋微生物系统[8-11]等建立了文
库。食品微生物的分子生物学研究也随着进入了一个
新阶段[12]。前期研究表明[13]，采用单链构象多态性检
测（SSCP）方法可研究腌制榨菜中的微生物多样性，
它是一种可以快速、简便地研究微生物群落结构的方
法[14]，但是所测序列较短，个别菌落只能确定到科、
属阶段，无法精确的鉴定到种；而 16S rDNA 序列检
测技术很好地弥补了这种不足[15]，目前已成为细菌种
属鉴定和分类的一种标准检测方法[15-17]；16S rDNA 序
列既有保守性，又具有高变性，保守性可以反映生物
物种的亲缘关系，并给分析系统发育提供了线索，而
高变性能则可以表明生物物种的特征核酸序列，并且
具有种、属的结构特征，因此，高变性是生物种属鉴
定的分子基础[18]；16S rDNA 序列分析目前已成为分
子鉴定和系统学研究中最具权威性和准确性的检测方
法之一[17]。国内也有学者采用 DGGE 方法研究传统榨
菜或泡菜腌制加工过程中细菌的多样性[19]。【本研究
切入点】本文采用 16S rDNA 序列克隆文库的方法，
以及通过克隆文库中克隆子出现的频率来了解样品
的细菌组成比例，在允许的低盐浓度范围内腌制，
通过改变盐浓度考察榨菜腌制体系中的微生物种群
组成以及优势菌种的变化特点。【拟解决的关键问
题】由于蔬菜腌制保藏过程中特别是在低盐浓度条
件下，乳酸菌等细菌的菌群组成结构及相对数量对
保持产品品质和食用安全性具有重要影响，拟通过
分子微生态检测方法研究其腌制系统的特征性微生
物或构建基因指纹图谱，来准确反映榨菜低盐腌制
过程中的微生物组成及优势微生物，为蔬菜低盐腌
制保持产品质量与安全提供微生物学证据，为进一
步改良腌制菜传统生产工艺提供理论基础。与此同
时，也为腌制蔬菜食品微生物分子生态检测方法的
建立提供试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜青菜头（榨菜）购于农产品市场；榨菜发酵
汁液实验室自制。
培养基为 MRS 固体培养基、LB 培养基和选择性
LB 培养基（Amp+）按文献方法配制[2,13]。
1.2 主要试剂和仪器
10×Buffer、dNTPs、Ex-Taq polymerase、DNA
Marker 购自宝生物工程有限公司；E. coli DH5α感受
态细胞、胶回收试剂盒购于上海生工生物工程有限公
司；梯度 PCR 仪、Centrifuge 5415D 型微量离心机均
为 eppendorf 产品；Alphalmger 2200 凝胶成像系统为
Alpha 产品。
1.3 试验方法
1.3.1 榨菜的腌制 榨菜低盐腌制操作流程按照前
期方法并在自然不接种条件下腌制[2,20]，于 2011 年 4
月上旬榨菜收获季节在宁波大学食品生物技术实验室
制备 5%和 7%两种盐浓度的榨菜腌制样品。
340 中 国 农 业 科 学 45 卷
1.3.2 腌制过程中榨菜体系中的乳酸菌数和酸度的
检测 在腌制过程中，分别取 0、5、10、和 20 d 的腌
制液，进行梯度稀释，然后取合适的梯度分别涂布于
MRS 固体培养基平板上，培养 2 d 后计数，分别得到
腌制过程不同盐浓度下榨菜体系中不同时期总的乳酸
菌数。另外，将取样得到的腌制液通过 pH 检测仪测
定其 pH，得到榨菜腌制体系在不同时期 pH 变化。
1.3.3 样品总 DNA 提取纯化 取腌制过程中 5、10
和 20 d 共 3 个时间点的样品约 70 mL 进行 DNA 的提
取。采用 Fast DNA SPIN Kit 试剂盒，按试剂盒给定步
骤进行样品总 DNA 的提取。
1.3.4 PCR 扩增 PCR 扩增所用引物：27F（5′-AGAG
TTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-TACGGCTA
CCTTGTTACGACTT-3′）。PCR 扩增所用反应体系：
10×Buffer 5 μL，Mg2+（25 mmol·L-1）5 μL，dNTP（2.5
mmol·L-1）8 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各 1.0 μL，
模板 DNA1.0 μL，Ex-Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.4
μL，用无菌 ddH2O 补足 50 μL 体系。PCR 反应的循环
条件为 94℃预变性 5 min，30 个循环（94℃变性 50 s，
52℃退火 50 s，72℃延伸 1 min30 s），72℃最后延伸
10 min。PCR 产物采用纯化试剂盒切胶纯化。
1.3.5 16S rDNA 克隆文库的构建 PCR 扩增的 16S
rDNA 片段经切胶回收，将纯化后的 PCR 产物与质粒
载体 pMD-18T 连接,转化到 E. coli DH5α，涂板在含
有选择性 LB 培养基（Amp+）的平板上 37℃过夜培养。
用引物 M13+和 M13-随机检测 40—80 个阳性克隆，送
交上海英骏生物技术有限公司测序。M13+（5′-CGCC
AGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′），M13-（5′-AG
CGGATAACAATTTCACACGA-3′）。
1.3.6 测序与序列分析 测序结果采用 DAMBE、
DNASTAR、MEGA4.1 等软件进行编辑分析，并把
编辑好的序列在GenBank数据库中进行 BLAST同源
性比对，分析出克隆子所属物种及与之最近似的种
类。
1.3.7 分析方法 水分、蛋白质、脂肪和粗纤维的测
定分别按 GB/T 5009.3,5,6,10—2003 方法执行；硝酸盐
和亚硝酸盐的测定按GB/T 5009.33—2010离子色谱法
执行；酸度和盐度的测定分别按文献[2]执行。
2 结果
2.1 不同盐浓度下榨菜腌制过程 pH 和乳酸菌数量变
化
根据前期盐浓度对乳酸菌生长、代谢的影响结果
及低盐腌制清洁生产的工艺要求的研究结果[20-21]，设
定 2 种盐浓度 5%和 7%，测定榨菜腌制不同时期内 pH
和乳酸菌数变化（图 1）。
由图 1 可以看出，2 种不同腌制盐浓度的 pH 变化
趋势一致，但 5%浓度的样品比 7%的样品 pH 下降趋
势明显。在最初的 10 d 内，5%浓度的 pH 由 6.2 急速
下降到 3.79，7%盐度的 pH 则相对比较平缓下降到
4.49，至 20 d 时，二者的 pH 均在 3.9—4.0，5%盐度
样品的 pH 还有回升的趋势。与 pH 相对的是乳酸菌数
量的变化，5%腌制盐度样品在整个自然过程中的乳酸
菌数量比 7%的样品大。5%盐浓度样品的乳酸菌变化
经历了一个急速上升到急速下降的过程，发酵至 10 d
时乳酸菌含量达到 3.22×108CFU/mL；7%样品在最初
的 10 d 内急速上升，到 10 d 左右达到最大值 7.4×106
CFU/mL，此后缓慢下降。



图 1 不同盐浓度榨菜腌制过程中 pH 和乳酸菌数量的变化（A：pH，B：乳酸菌数量）
Fig. 1 The change of pH and total population of lactic acid bacteria during the processing of mustard tuber at different salinities (A:
pH, B: the population of lactic acid bacteria)
2 期 翁佩芳等：榨菜低盐腌制细菌群落多样性的分析 341
2.2 不同盐浓度样品总 DNA 的提取和 PCR 扩增
分别对榨菜不同腌制时期的汁液进行DNA 提取，
将所提取的总 DNA 用通用引物 27F 和 1492R 进行扩
增，PCR 产物经电泳检测结果如图 2 所示。
从检测结果发现在约 1500 bp 处均出现了荧光条
带，说明 PCR 反应特异性较好，适合下一步 16S rDNA
克隆文库的构建。



M: 2000 bp marker; 1、2、3 分别为 5%浓度 5、10 和 20 d 样品 DNA 的
PCR 扩增结果；4、5、6 分别为 7%浓度 5、10 和 20 d 样品 DNA 的 PCR
扩增结果
1,2 and 3 represent PCR amplified results at day 5, 10 and 20 with 5% salt
concentration, respectively; 4, 5 and 6 represent PCR amplified results at
day 5, 10 and 20 with 7% salt concentration, respectively

图 2 PCR 扩增结果
Fig. 2 Results of PCR-amplified of 16S rDNA
2.3 16S rDNA 克隆文库的构建
2.3.1 5%盐度榨菜腌制体系细菌 16S rDNA 基因克隆
文库的构建 来自 5%盐度榨菜腌制体系中细菌测序
结果在 GenBank 数据库中进行 BLAST 比对，检测出
腌制 5、10 和 20 d 的样品分别有 11、9、8 个不同的
菌种，3 个时期的克隆子与 GenBank 数据库中已知细
菌的 16S rDNA 序列相似性范围在 90%—100%；5%
盐度榨菜腌制体系不同时期样品的细菌群落测定结果
如表 1 所示。
由表 1 可知，5%盐度的榨菜腌制体系，在腌制 5
d 时，榨菜腌制液中优势种群主要有 3 个乳酸菌属，
分别为乳杆菌属（ Lactobacillus）、明串珠菌属
（Leuconostoc）及魏斯氏菌属（Weissella），其中清
酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）占绝大多数，占 35%；
干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）只在 5 d 腌制液中存
在；当榨菜腌制到第 10 天时，腌制体系中的优势乳酸
菌种类也发生了变化，其中主要有 3 种乳酸菌，清酒
乳杆菌（Lactobacillus sakei）还是占优势，占 40%，
数量略有上升，在此期间，弯曲乳杆菌（Lactobacillus
curvatus）数量有所增加，而干酪乳杆菌（Lactobacillus
casei）消失；腌制10 d后出现了草乳杆菌（Lactobacillus
graminis）；明串珠菌属中的 Leuconostoc gasicomitatum、
冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）、泡菜明串珠

表 1 16S rDNA 克隆文库法对 5%盐浓度样品的细菌群落组成分析结果
Table 1 Analytical results of bacterial community composition at 5% salinity sample based on 16S rDNA clone library method
不同时期的克隆子数量Number of clones during different periods菌属名
Bacterial genus
菌种名
Strains 5d 10d 20d
乳杆菌属
Lactobacillus
清酒乳杆菌 Lactobacillus sakei
乳酸杆菌 Lactobacillus sp.
弯曲乳杆菌 Lactobacillus curvatus
干酪乳杆菌 Lactobacillus casei
草乳杆菌 Lactobacillus graminis
植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum
棒状乳杆菌 Lactobacillus coryniformis
短乳杆菌 Lactobacillus brevis
14
3
3
2
16
3
6

1

2
1
2


21
1
6
明串珠菌属
Leuconostoc
泡菜明串珠菌 Leuconostoc kimchii
仁海明串珠菌 Leuconosto inhae
明串珠菌 Leuconostoc gasicomitatum
冷明串珠菌 Leuconostoc gelidum
柠檬明串珠菌 Leuconostoc citreum
假肠膜明串珠菌 Leuconostoc pseudomesenteroides
4
3
1
2
1

2
1

2

1

1



1
魏斯氏菌属 Weissella 希腊魏斯氏菌 Weissella hellenica 3 2
假单胞菌属 Pseudomonas 荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 1
342 中 国 农 业 科 学 45 卷
菌（Leuconostoc kimchii）和仁海明串珠菌（Leuconosto
inhae）所占克隆子数也有所降低。当榨菜腌制到第 20
天时，榨菜体系中的优势菌株发生了巨大变化，魏斯
氏菌属消失；乳杆菌属占绝对优势，在此期间，植物
乳杆菌（Lactobacillus plantarm）的数量增加，为总数
的 63.6%，并且出现了棒状乳杆菌（Lactobacillus
coryniformis）和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）；明串
珠菌属的菌种所占比例很小，仅有 5%。
2.3.2 7%盐度榨菜腌制体系细菌 16S rDNA 基因克隆
文库的构建 来自 7%榨菜腌制体系中细菌测序结果
在 GenBank 数据库中进行 BLAST 比对，检测出腌制
5、10 和 20 d 的样品分别有 12、4、4 个不同的菌种，
3 个时期的克隆子与 GenBank 数据库中已知细菌的
16S rDNA 序列相似性范围在 93%—100%。7%盐度榨
菜腌制体系不同时期样品的细菌群落测定结果如表 2
所示。

表 2 16S rDNA 克隆文库法对 7%盐浓度样品的细菌群落组成分析结果
Table 2 Analytical results of bacterial community composition at 7% salinity based on 16S rDNA clone library
不同时期的克隆子数量 Number of clones during different periods菌属名
Bacterial genus
菌种名
Strains 5d 10d 20d
乳杆菌属 Lactobacillus 清酒乳杆菌 Lactobacillus sakei
植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum
1 2 11
17
明串珠菌属 Leuconostoc 肉色明串珠菌 Leuconostoc carnosum 1
魏斯氏菌属 Weissella 希腊魏斯氏菌 Weissella hellenica 22 23 3
肠杆菌属 Enterobacter 河生肠杆菌 Enterobacter amnigenus
肠杆菌 Enterobacter sp.
1
1

寡养单胞菌属 Stenotrophomonas 寡养单胞菌 Stenotrophomonas chelatiphaga 1
工地杆菌属 Pedobacter 工地杆菌 Pedobacter cryoconitis 1
假单胞菌属 Pseudomonas 韩国假单胞菌 Pseudomonas koreensis
假单胞菌 Pseudomonas sp
草假单胞菌 Pseudomonas poae
1


1


1
黄杆菌属 Flavobacterium 黄杆菌 Flavobacterium sp 1 1
葡萄球菌属 Staphylococcus 琥珀葡萄球菌 Staphylococcus succinus 1
詹森菌属 Janthinobacterium 詹森菌 Janthinobacterium sp 1
拉恩菌属 Rahnella 拉恩菌 Rahnella sp 1

由表 2 可知，7%盐度榨菜腌制体系，在腌制 5 d
时，榨菜腌制液中优势菌种为希腊魏斯氏菌，占文库
的 55%；清酒乳杆菌和肉色明串珠菌也在这个时期出
现 1 个克隆子数；此外，肠杆菌属、寡养单胞菌属、
工地杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、葡萄球菌属、
詹森菌属和拉恩菌属各有 1—2 个克隆子，占文库的
22.5%。当榨菜腌制到第 10 天时，腌制体系中的优势
乳酸菌希腊魏斯氏菌仍然占优势，占文库的 57.5%；
明串珠菌属消失，清酒乳杆菌的克隆子数稍有增多，
其余菌属只检测到假单胞菌属和黄杆菌属。当榨菜腌
制到第 20 天时，榨菜体系中的优势菌株发生了明显变
化，魏斯氏菌属的克隆子数急剧下降，乳杆菌属中的
植物乳杆菌和清酒乳杆菌的数量增加，分别占文库的
42.5%和 27.5%，其余菌属逐渐消失。
2.4 不同盐浓度下榨菜腌制的产品质量分析
在以上分子微生态检测研究结果的基础上，同时
在低盐浓度范围内（5%—7%）对腌制 3 个月的榨菜
样品进行产品质量分析测定，得到的结果如表 3 所示。
从以上检测指标可以看出，采用本研究的低盐腌
制新工艺其腌制榨菜半成品，其水分、蛋白质和纤维
素含量约高于传统高盐浓度（大于 10%盐度）腌制工
艺的产品[2]，与传统高盐腌制方法相比（其中硝酸盐
含量 1 120 mg·kg-1）显著降低（另文发表），其平均
值只有 320 mg·kg-1，这可能跟菌群的种类与数量差异
有关，从而最终导致产品亚硝酸盐含量较低，平均值
2.9 mg·kg-1，即成品亚硝酸盐含量比传统高盐腌制工
艺数量相差达 1/2[2]，从而为产品的高质量品质及工艺
过程控制奠定了基础。
2 期 翁佩芳等：榨菜低盐腌制细菌群落多样性的分析 343
表 3 低盐腌制榨菜样品的质量分析结果
Table 3 Analytical results of pickled mustard tuber composition at low salinity
组分
Composition
蛋白质
Protein
脂肪
Lipid
粗纤维
Crude fiber
硝酸盐 a
Nitrate
(g·kg-1)
亚硝酸盐 b
Nitrite
(mg·kg-1)
盐度
Salinity

总酸 c
Total acidity
水分
Moisture
含量 Content (g100/g) 2.2±0.2 0.2±0.05 0.78±0.06 0.32±0.07 2.9±0.8 6.2±0.7 0.72±0.11 80.8±0.65
平均值±SD (n=2): 对两个独立样品重复测定的平均值及标准偏差。a：硝酸盐以硝酸钠计；b：亚硝酸盐以亚硝酸钠计；c：总酸量以乳酸计
Mean±SD (n=2): average values of duplicate determinations for two independent samples. a: Nitrate (quantified with sodium nitrate); b: Nitrite (quantified with
sodium nitrite); c: Total acidity (quantified with lactic acid)

3 讨论
对腌制汁液通过试剂盒进行 DNA 提取，扩增所
获得的 PCR 产物，是不同盐浓度各个时期各种微生物
16S rDNA 的混合物，代表了该生长期榨菜腌制时培
养液中的微生物群体。
由细菌克隆文库分析结果可知，5%和 7%盐浓度
榨菜腌制体系微生物群落结构存在差异。在发酵前期，
5%盐度的基因克隆文库中其优势菌属分别为乳杆菌
属（占 55%）和明串珠菌属（占 27.5%），其中的乳
杆菌属中主要有清酒乳杆菌、乳酸杆菌、弯曲乳杆菌
和干酪乳杆菌 4 类；明串珠菌属主要有泡菜明串珠菌、
仁海明串珠菌、Leuconostoc gasicomitatum、冷明串珠
菌和柠檬明串珠菌。由文献报道的 DGGE 方法结合传
统分离培养方法对榨菜腌制环境的微生物区系多样性
分析结果[19]，榨菜腌制阶段菌群测定结果为明串珠菌
属的丰度最高，是腌制过程中的主要优势菌群，而本
研究结果主要优势菌为乳杆菌属，其主要原因可能是
腌制的盐度、地域、基质条件及腌制环境等重要影响
因子的差异；次优势菌是乳球菌（Lactococcus lactis）。
同时也报道了乳杆菌是优势乳酸菌，这与本腌制条件
下的菌群分布特性相似。适当提高盐浓度至 7%，由
于渗透压的改变，相对渗透压敏感的乳酸菌及其它一
些细菌菌属的生长将会受到抑制[22]，从而可能引起菌
群结构尤其是优势菌数量的变化；从腌制早期样品的
克隆文库中可以看出，其优势菌为魏斯菌属中的希腊
魏斯氏菌，有少量的清酒乳杆菌和肉色明串珠菌；此
外，其它菌属种类所占比例远大于 5%盐浓度。随着
发酵的进行，5%体系中乳杆菌属和明串珠菌属依然占
优势，直到 20 d 左右乳杆菌属的体系发生了变化，植
物乳杆菌占绝对优势；7%体系在 10 d 左右变化不大，
只是其它菌属相对减少，腌制后期清酒乳杆菌和植物
乳杆菌占优势，魏斯菌属急剧减少；这些菌属的变化
可能是由于盐度的改变引起菌群构成变化造成环境生
化状态的改变，进一步引起不同菌种的消长。
结果表明，在一定的低盐浓度范围内，腌制体系
中改变盐浓度其菌群结构存在差异，但两者细菌群落
动态变化的趋势是一致的。在一般的自然发酵过程
中，明串珠菌属和魏斯氏菌属等异型乳酸菌启动发
酵[23]，产生有机酸、过氧化氢和细菌素等物质，抑制
其它杂菌的生长，同时产生乙醇、乙醛、甘露醇等风
味物质，对榨菜特有风味的形成起决定性作用。由于
环境条件的改变，随后植物乳杆菌和短乳杆菌等同型
乳酸菌成为优势菌，进一步降低环境的 pH 和抑制有
害杂菌的繁殖[24]。理化参数测定结果也表明，低浓度
食盐能使腌制环境的 pH 较迅速的降低，5%盐度腌制
pH 由 6.2 急速下降到 3.79；缩短了异型乳酸菌的发酵
时间，所以在腌制第 5 天就同时出现了异型乳酸菌明
串珠菌属和同型发酵菌乳杆菌属，而无其它杂菌的生
长，同时影响乳酸菌的数量变化趋势。提高盐浓度减
缓了环境 pH 的下降速度，且其异型乳酸菌的发酵时
间明显比低浓度食盐的长，直到 20 d 左右才出现同型
发酵乳酸菌。但是，两者的乳酸菌数量差异显著，说
明 5%盐度腌制体系适合乳酸菌的生长，实现榨菜低
盐腌制完全可行 [25]。通过对低盐浓度范围（5%—
7%）腌制产品的常规质量指标分析结果，其中的硝
酸盐与亚硝酸盐含量与传统高盐腌制工艺相比[2]，
其数值显著降低，而其它营养指标相差不大，造成
这种差异的结果与腌制体系微生物结构组成的差异
性有关[4,5,22,24]，如乳酸菌数量及硝酸盐还原菌等。另
一方面，由于传统工艺生产的高盐榨菜经过后续工艺
过程的大量水漂洗操作，营养成分的损失较多，因此
低盐腌制工艺对原料中营养物质的利用及产品质量安
全产生积极的影响。
研究表明，16S rDNA 克隆文库法能较好反映腌
制菜体系微生物群落的多样性及变化，打破了一般传
统培养方法不同种类细菌检出的局限性。文献报道的
DGGE 方法存在的缺点是要求分析用 16S rDNA 片段
长度至少达到 500 bp，此外，只能对菌体数量大于总
菌量 1%的菌群进行分析；同前期采用 SSCP-PCR 检
344 中 国 农 业 科 学 45 卷
测方法相比[13,26]，本方法得到的细菌微生物群落组成
更丰富，主要原因是 SSCP 方法以条带的丰度来选择
分析对象，而文库克隆是对 16S rDNA 全长序列进行
扩增，能更好反映环境中微生物的群落情况。比较研
究结果，认为本方法的局限性主要体现在样品 DNA
提取时，细胞破碎难易程度不一，造成 DNA 本身与
实际样品之间的偏差；此外，PCR 扩增过程中的偏好
性和不同细菌基因拷贝数的差异会对结果造成一定的
影响；所以，以 16S rDNA 为基础的分子生物学技术
并不能完全替代其它微生物生态技术[27]；为进一步弄
清腌制体系中不同阶段细菌群落组成情况，还需要结
合纯分离培养方法及其它分子检测手段，以验证和完
善克隆文库的精确性。本研究只对细菌的 16S rDNA
基因文库进行构建，对于真菌（主要是酵母菌）的全
面认识及对腌制品功能实现的影响，将作下一步研究。
4 结论
该低盐腌制体系环境中两者的 pH 始终呈现下降
的趋势，5%盐浓度的 pH 由 6.2 急速下降到 3.79，7%
盐浓度 pH 下降则相对比较平缓直至 4.49，腌制至第
20 天后两者 pH 均在 3.9—4.0；5%盐度样品在整个自
然腌制过程中的乳酸菌数量比 7%盐度的样品大，两
者乳酸菌数量差异显著，说明 5%盐度的腌制体系适
合乳酸菌的生长。
通过 16S rDNA 克隆文库法对两种低盐浓度腌制
过程微生物多样性分析表明，5%盐度腌制体系前期优
势种群为乳杆菌属、明串珠菌属和魏斯氏菌属；而 7%
盐浓度腌制体系中前期优势乳酸菌种为希腊魏斯氏
菌，在保证腌制品质量的前提下，最后起主导作用的
种群均为植物乳杆菌。因此，在确定的条件下，以上
菌群变化规律及优势菌的存在对腌制产品质量维持具
有重要意义。
低盐腌制条件下其成品的水分、蛋白质和纤维素
含量高于传统高盐浓度腌制的产品，而硝酸盐和亚硝
酸盐含量显著降低，这些结果与菌群组成种类及数量
差异有关。可进一步通过其它相关研究（如 RT-PCR
等）手段来完善低盐浓度腌制体系中微生物群落数量
的动态变化，以深刻揭示微生物对产品功能影响的本
质。

References
[1] 吴祖芳，刘 璞，翁佩芳. 榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进
展.食品与发酵工业，2005, 31(8): 73-76.
Wu Z F, Liu P, Weng P F. Key Technologies and development of
lactic acid bacteria application in pickled mustard tuber processing.
Food and Fermentation Industries, 2005, 31(8): 73-76.(in Chinese)
[2] 吴祖芳，刘 璞，翁佩芳. 传统榨菜腌制加工应用乳酸菌技术的研
究. 食品工业科技, 2008(2): 101-103.
Wu Z F, Liu P, Weng P F. Study on application of lactic acid bacteria
technology to the processing of traditional pickled mustard tuber.
Science and Technology of Food Industry, 2008(2): 101-103.(in
Chinese)
[3] 施安辉，周 波. 蔬菜传统腌制发酵工艺过程中微生物生态学的意
义. 中国调味品, 2002(5): 11-14.
Shi A H, Zhou B. The micro-ecological significance of the traditional
green stuff pickling process. Chinese Condiment, 2002(5): 11-14.(in
Chinese)
[4] 陈飞平. 微生物发酵对蔬菜腌制品品质的影响. 中国食物与营养,
2009(9): 28-30.
Chen F P. Impacts on quality of pickled vegetables with microbial
fermentation. Food and Nutrition in China, 2009(9): 28-30. (in
Chinese)
[5] Jamuna M, Jeevaratnam K. Isolation and characterization of
lactobacilli from some traditional fermented foods and evaluation of
the bacteriocins. The Journal of General and Applied Microbiology,
2004, 50(2): 79-90.
[6] Amann R I, Ludwing W, Schleifer K H. Phylogenetic identification
and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.
Microbiological Reviews，1995, 59: 143-169.
[7] Pace N R, Stahl D A, Lane D J, Olsen G J. The analysis of natural
microbial populations by ribosomal RNA sequences. Advances in
Microbial Ecology, 1986(9): 1-55.
[8] Brambilla E, Hippe H, Hagelstein A, Hagelstein A, Brian J, Tindall,
Stackebrandt E. 16S rDNA diversity of cultured and uncultured
prokaryotes of a mat sample from Lake Fryxell, McMurdo Dry
Valleys, Antarctica. Extremophiles, 2001, 5(1): 23-24.
[9] Carola B, Stefan W. Evaluation of the use of PCR and reverse
transcriptase PCR for detection of pathogenic bacteria in biosolids
from anaerobic digestors and aerobic composters. Applied
Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 4618-4627.
[10] Juck D, Charls T, Whyte L G, Creer C W. Polyphasic microbial
communities analysis of petroleum hydrocarbon contaminated soils
from two northern Canadian communities. FEMS Microbiology
Ecology, 2000, 33(3): 241-249.
[11] Andrew J M, Robert G B, Carl E C, Duane C, Ruth G L, Alexander H
R, Sharon A S, Peter G. Microbial characterization of biofilms in
2 期 翁佩芳等：榨菜低盐腌制细菌群落多样性的分析 345
domestic drains and the establishment of stable biofilm microcosms.
Applied Environmental Microbiology, 2003, 69(1): 177-185.
[12] Lee J S, Heo G Y, Lee J W, Oh Y J, Park J A, Park Y H, Pyun Y R,
Ahn J S. Analysis of Kimchi microflora using denaturing gradient gel
electrophoresis. International Journal of Food Microbiology, 2005,
102: 143-150.
[13] 翁佩芳, 吴祖芳, 龚 业, 张 锐，沈锡权. SSCP 方法的条件优化与
榨菜低盐腌制微生物多样性分析 .食品与生物技术学报 , 2011,
30(2): 261-266.
Weng P F, Wu Z F, Gong Y, Zhang R, Shen X Q. Optimization of
SSCP condition and diversity of microbial community in pickled
mustard tuber with low salinity. Journal of Food Science and
Biotechnology, 2011, 30(2): 261-266. (in Chinese)
[14] Lee D H, Zo Y G and Kim S J. Nonradioactive method to study
genetic profiles of natural bacterial communities by
PCR-single-strand-conformation polymorphism. Applied and
Environmental Microbiology, 1996, 62: 3112-3120.
[15] 刘 琳，刘 洋，刘红娟. 基于 16S rDNA 的系统发育分析在微生物
进化关系中的应用.生物学通报 2008, 43(11): 4-6.
Liu L. Liu Y, Liu H J. The phylogenetic tree and its application on
analysis of microbiological evolution based on 16S rDNA. Bulletin of
Biology, 2008, 43(11): 4-6. (in Chinese)
[16] 孙志宏, 孟 和, 孙天松，包秋华，张和平. 分子标记技术用于乳酸
菌分类鉴定研究进展.中国乳品工业，2006, 34(5): 35-38.
Sun Z H, Meng H, Sun T S, Bao Q H, Zhang H P. Research progress
of application of molecular marking technology in classification and
identification of lactic acid bacteria. China Dairy Industry, 2006,
34(5): 35-38. (in Chinese)
[17] Amann R, Ludwg W. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes
for studies in microbial ecology. FEMS Microbiology Reviews, 2000,
24(5): 555-565.
[18] 肖作为，张红刚，杨岩涛，鲁曼霞，杨 崧. 基于 16S rRNA 基因
的 7种乳酸杆菌的分子系统发生. 广东农业科学，2010(4): 198-200.
Xiao Z W, Zhang H G, Yang Y T, Lu M X, Yang S. The molecular
phylogeny of lactic acid bacteria based on partial 16S rRNA gene
sequences. Guangdong Agricultural Sciences, 2010(4): 198-200. (in
Chinese)
[19] 李正国，付晓红，邓 伟，杨迎伍，崔英双，赵 平. 传统分离培
养结合 DGGE 法检测榨菜腌制过程的细菌多样性. 微生物学通报,
2009, 36(3): 371-376.
Li Z G, Fu X H, Deng W, Yang Y W, Cui Y S, Zhao P. Analysis of
bacterial diversity during the processing of Brassica juncea coss var.
tsatsai by the culture-independent and denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) methods. Microbiology, 2009, 36(3):
371-376. (in Chinese)
[20] 吴祖芳，刘 玲，翁佩芳. 低盐腌制榨菜保脆工艺的优化研究.食品
工业科技, 2009, 30(11): 205-207.
Wu Z F, Liu L, Weng P F. Study on the brittleness-keeping technology
optimization of pickled mustard tuber processing at low salinity.
Science and Technology of Food Industry, 2009, 30(11): 205-207. (in
Chinese)
[21] Weng P F, Wu Z F, Shen X Q, Liu P. A new cleaner production
technique of pickle mustard tuber at low salinity by lactic acid bacteria.
Journal of Food Process Engineering, 2011, 34(4): 1144-1155.
[22] 李学贵 , 严晓燕 . 低盐化榨菜生产原理及其应用初探 . 中
国酿造 , 2004(5): 4-6.
Li X G, Yan X Y. Principle of low-salted tsatsai process and initial
study on its application. China Brewing, 2004(5):4-6. (in Chinese)
[23] Bjorkroth K J, Schillinger U, Geisen R, Weissella N，Hoste B，
Holzapfel W H，Korkeala H J，Vandamme P. Taxonomic study of
Weissella confusa and description of Weissella cibaria sp. nov.,
detected in food and clinical samples. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002, 52(Pt 1): 141-148.
[24] 尹利端，韩北忠，黄晶晶，彭 坚，黄 静. 萝卜泡菜发酵过程中食
盐对微生物变化的影响. 中国酿造，2005, 114(3): 19-21.
Yin L D, Han B Z, Huang J J, Peng J, Huang J. Effect of salt on
microbial changes in pickled radish. China Brewing, 2005, 114(3):
19-21. (in Chinese)
[25] Gardner N J, Savard T, Obermeier P, Claude G, Champagne C P.
Selection and characterization of mixed started cultures for lactic acid
fermentation of carrot, cabbage, beet and onion vegetable mixture.
International Journal of Food Microbiology, 2001, 64(3): 261-275.
[26] 王 岩, 沈锡权, 吴祖芳. PCR-SSCP 技术在微生物群落多态性分析
中的应用进展. 生物技术, 2009, 19(3): 84-87.
Wang Y, Sheng X Q, Wu Z F. Application of PCR-SSCP technology
in diversity analysis of microbial communities. Biotechnology, 2009,
19(3): 84-87. (in Chinese)
[27] 张 彤, 方汉平. 微生物分子生态技术: 16S rRNA/DNA 方法. 微生
物学通报, 2003, 30(2): 97-101.
Zhang T, Fang H P. Microbial molecular-ecology: 16S rRNA/DNA
approaches. Microbiology, 2003, 30(2): 97-101. (in Chinese)

（责任编辑 曲来娥）