全 文 ：井冈山大学学报(自然科学版) 37
文章编号：1674-8085(2013)04-0037-04

匍匐茎草本蛇莓 RAPD反应体系优化

*廖信军，李雅宜，胡雪华
（井冈山大学生命科学学院，江西，吉安 343009）

摘 要：为了建立蛇莓 RAPD反应的最佳反应体系，我们对每个反应因子进行优化研究。在本实验室常用的 RAPD
反应体系的基础上，根据 RAPD扩增效果确定蛇莓基因组 DNA的最佳 RAPD反应体系。经优化后，我们建立了
适合蛇莓的最佳 RAPD反应体系：25 μL反应体系中含 10×Buffer 2.5 μL，2 mmol/L Mg2+，1.5 UTaqDNA聚合酶，
50 ng模板，0.22 mmol/L dNTPs，0.35 μmol/L随机引物 S30。本研究结果为下一步野生蛇莓遗传多样评估奠定基
础。
关键词：蛇莓；RAPD；扩增程序
中图分类号：Q785/Q948.1 文献标识码：A DOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2013.04.008

OPTIMIZATION OF RAPD REACTION SYSTEM IN THE
STOLONIFEROUS HERB, DUCHESNEA INDICA
* LIAO Xin-jun, LI Ya-yi, HU Xue-hua
(School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)
Abstract: In order to establish the optimal RAPD reaction system in Duchesnea indica, every factor in the system
was optimized. Based on the RAPD reaction system commonly used in our lab, the optimal RAPD reaction
system of genome DNA of D. indica was determined according to the RAPD amplification effects. The optimal
PCR system was as follows: 2.5 μL 10×buffer, 2.0 mmol/L Mg2+, 1.5 U Taq polymerase, 50 ng DNA template, 0.2
mmol/L dNTPs, 0.35 μmol/L random primer S30 in 25μl reaction system. The results of this paper will lay the
basis for assessing the genetic diversity of the wild D. indica.
Key words: Duchesnea indica; RAPD; amplification procedure

蛇莓(Duchesnea indica)为蔷薇科多年生草本植
物，其性味甘、苦、寒，具有清热凉血、消肿解毒
之功效，临床上应用于治疗热病、惊痫、咽喉肿痛、
咳嗽吐血、蛇虫咬伤等[1-3]。目前，蛇莓中化学成分
分析研究较多[4-6]，而有关蛇莓分子遗传标记研究鲜
有报道，仅姚旭丽等人 2009 年进行了蛇莓
ISSR-PCR 体系的建立和优化的研究[7]。RAPD 由
Williams 和 We1sh 两个研究小组儿乎同时于 1990
年建立起来的一项分子标记技术，是目前中药研究
者最常使用的 DNA标记技术[8-9]。但 RAPD易受各
种因素的干扰，其最佳扩增条件在不同物种各有不
同，因此，在对不同物种进行 RAPD分析时，完全
有必要对各因子的反应条件进行优化，建立稳定
的、最佳的反应体系。本研究将对蛇莓 RAPD体系
进行优化，为进一步评估野生蛇莓群体遗传多样性
奠定基础。
第 34卷第 4期 Vol.34 No.4 井冈山大学学报(自然科学版)
2013年 7 月 July. 2013 Journal of Jinggangshan University (Natural Science) 37

收稿日期：2013-03-01；修改日期：2013-06-17
基金项目：井冈山大学科研项目(JZ0821)
作者简介：廖信军(1978-），男，江西吉安人，实验师，博士生，从事分子遗传学研究和教学(E-mail：liaoxinjun7811@126.com);
李雅宜(1987-），男，福建龙岩人，井冈山大学生命科学学院本科生(E-mail：liyayi56@126.com);
胡雪华(1977-），女，江西吉安人，实验师，硕士，主要从事植物学研究(E-mail：huxuehua2008@jgsu.edu.cn ).
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1 材料与方法
1.1 材料
实验材料为野生蛇莓群体，采自吉安市井冈山大
学校园内。每个植株上摘取茎尖端的少量幼叶，编号
然后置于保鲜袋中，密封保存，放到冰壶内，带回实
验室后洗净晾干，并于当日提取基因组DNA。
1.2 基因组 DNA提取
参考改良 CTAB法[10]提取基因组 DNA。
1.3 DNA浓度及纯度检测
提取的 DNA先进行 1%琼脂糖凝胶电泳，然后
经紫外分光光度计（Eppendorf）检测其浓度和纯度，
最后用 ddH2O稀释至 25 ng/μL。
1.4 试剂
试验所用MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶均
购自上海生工，随机引物由上海生工合成。
1.5 RAPD反应
以蛇莓基因组 DNA 为模板，对已筛选的 S30
（5’－3’依次为 GTGATCGCAG）随机引物进行扩
增（德国 Biometra-T3000ThermocyclerPCR仪）。本
实验对影响扩增结果的模板浓度、镁离子浓度、Taq
酶、引物浓度、dNTPs浓度、退火温度和循环次数
等主要因子进行依次研究。在保持其他因子不变的
情况下，按一定梯度改变单一因子进行扩增，筛选
最优条件，以获得最优化、最稳定的反应体系（各
因子梯度见表 1）。
1.6 RAPD扩增产物检测
RAPD 产物经 1%琼脂糖凝胶（含 Goldview）
电泳（10 V/cm，35 min）分离，DNA Ladder范围
为 100~3000 bp，YLN-2000凝胶成像仪观察照相。
表 1 RAPD反应体系各成分优化试验设计
Table 1 Optimum design of components for RAPD-
PCR protocol
反应成分 浓度梯度
dNTPs/ mmol·L-1 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
Primer/μmol ·L-1 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
Mg2+/ mmol ·L-1 1.0 1.2 1.5 1.8 2.0
Template DNA/ ng 40 50 60 70 80
Taq polymerase/ U·μL-1 0.01 0.02 0.04 0.06 0.07
注：反应总体积 25μL（含 10×buffer 2.5μL）
2 结果与分析
2.1 模板 DNA
基本反应体系：2.5 μL 10*Buffer，2 μL 1.8 mmol/L
MgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL dNTP，
0.4 μL primer，dd H2O 补充至 25 μL。 DNA优化
分 5个浓度梯度进行：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ng/μL。
结果见图 1：模板 DNA用量在 0.5~2.5 ng/μL的范
围内均能扩增出条带，当浓度为 0.5 ng/μL时条带稍
淡，浓度为 2 ng/μL时条带最清晰。因此，我们最
后选取了浓度为 2.0 ng/μL (总含量 50 ng)为最佳模
板浓度。

M: SM0321 Marker
图 1 模板浓度对扩增的影响
Fig.1 Effect of template DNA concentration on RAPD results
2.2 引物
引物浓度低时，无法与所有的模板 DNA 结合
位点结合，导致扩增结果不理想；引物浓度过高时，
会增加碱基错配的机率，产生非特异性条带。本研究，
基本反应体系：2.5 μL 10*Buffer，2 μL1.8 mmol/L
MgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL dNTP，
50 ng DNA，dd H2O 补充至 25 μL，引物设计了 5
个梯度（依次为 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 μmol/L）。结果
见图 3：引物浓度小于 0.2 μmol/L时条带淡且数目
明显更少，引物浓度在 0.4~0.5 μmol/L较其它浓度
更清晰，出于节约成本最终确定的引物采用量为
0.4 μmol/L。

M: SM0321 Marker
图 2 引物浓度对扩增结果的影响
Fig.2 Effect of random primer concentration on RAPD results
井冈山大学学报(自然科学版) 39
2.3 dNTP
dNTPs是反应中磷酸根的主要来源，其浓度
大小直接影响产物的质量，特异性及合成的可靠
性[11]。本研究基本反应体系：2.5 μL 10*Buffer，
2 μL 1.8 mmol/LMgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，
50 ng DNA，0.4 μL primer，dd H2O 补充至 25μL，
dNTP在 120~240 μmol/L之间，设置了 5个浓度梯
度，分别为 120，160，200，220，240 μmol/L。结
果见图 2。

M: SM0321 Marker
图 3 dNTP浓度对 RAPD反应的影响
Fig.3 Effect of dNTP concentration on RAPD reaction
注：条带从强到弱的浓度依次为，220，200，160，240，120μmol/L。
故，选择 dNTP终浓度为 220 μmol/L进行 RAPD 扩增。
2.4 Mg2+浓度
Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影
响，浓度过高会使反应特异性降低，浓度过低又会
降低 Taq酶的活性，使反应产物减少[12]。本研究基
本反应体系：2.5 μL 10*Buffer，2.2 μL dNTP，0.5 μL
2.0U TaqDNA聚合酶，50ng DNA，0.4 μL primer，
dd H2O 补充至 25 μL，Mg2+ 浓度设置了 5个浓度
梯度（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L）。结果见
图 4：当Mg2+浓度当Mg2+浓度为 1.0 mmol/L时，
未见条带；1.5~3.0 mmo1/L之间均能扩增出较亮、
较好的条带，在 2.5 mmo1/L 浓度时条带最清晰。
综合考虑，本试验Mg2+最适宜浓度为 2.5 mmol/L。

M: SM0321 Marker
图 4. Mg2+浓度对 RAPD扩增的影响
Fig.4 Effect of Mg2+ concentration on RAPD results
2.5 Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是扩增反应的关键因素，基本
反应体系：2.5 μL 10*Buffer, 2.2 μL dNTP, 2.5 μL
1.8 mmol/LMgCl2 , 50 ng DNA, 0.4 μL primer, dd
H2O 补充至 25 μL，T aq DNA聚合酶浓度从高到低
共设置 5个梯度:0.010，0.020，0.040，0.060，0.070
U/μL即总酶量为 5个梯度:0.25，0.50，1.00，1.50，
1.75 U。实验结果表明(图 5)：Taq DNA聚合酶具有
很高的活性，即使在低浓度下(0.25 U)也有扩增结
果，只是条带稍少且不稳定；在高浓度(1.75 U)下带
型丰富，出现模糊现象，而且非特异性产物增多；
1.50 U扩增出的条带多且清晰，故 1.5 UTaqDNA聚
合酶量最合适。

M: SM0321 Marker
图 5 Taq DNA聚合酶浓度对扩增带型的影响
Fig.5 Effect of Taq polymerase concentration on
amplification results
2.6 反应程序对 RAPD扩增的影响
图 6显示，第 1~9泳道都出现了条带，但条带
不多且亮度比较弱，背景比较模糊，第 10~12和第
16~18 泳道背景适宜，但部分条带比较弱且亮度不
够，相比之下 13~15泳道的条带多且清晰，这 3个
泳道中 15 泳道的条带最多且背景最清晰、亮度适
宜。综合考虑，第 15 泳道的反应程序为最佳的反
应程序。即预扩增时退火温度为 36 ℃；扩增时退
火温度为 40 ℃，延伸时间为 60 s。

图 6 反应程序对扩增的影响
Fig.6 Effect of the reaction programmes on RAPD
amp1ification
注: 1~9延伸时间 75 s，10~18延伸时间 60 s，1~3和 10~12预扩增
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时退火温度为 34 ℃，4~6和 13~15预扩增时退火温度为 36 ℃，7~9和
16~18预扩增时退火温度为 38 ℃，1、4、7、10、13、16扩增时退火温
度为 36 ℃，2、5、8、11、14、17扩增时退火温度为 38 ℃，3、6、9、
12、15、18扩增时退火温度为 40 ℃。M: SM0321 Marker
2.7 优化的 PCR反应体系扩增结果的稳定性
采用优化后的 RAPD 扩增体系对不同株个体
DNA进行进行扩增，图 7的扩增结果表明，该体系
在这 11 株个体材料中均能扩增出清晰的带型，扩
增出的条带较亮，条带数量适宜，且主带清晰，其
中 8号为用于 RAPD条件优化的实验样品。

M: SM0321 Marker
图 7 S30引物扩增的 DNA片段图谱
Fig.7 The PCR amplification pattern with primer S30
3 讨论
RAPD标记的稳定性和可重复性，一直是受人
们关注，这种随机扩增容易受到其反应体系中各成
分含量的影响，所以在进行 RAPD分析之前，完全
有必要对各因子的反应条件进行优化[13]。模板DNA
浓度的轻微变化不影响扩增产物的带型，但扩增的
强度略有不同，总体来说 DNA 浓度可允许在一定
范围内变动[14]。本文发现蛇莓的模板 DNA 用量在
12.5~62.5 ng 的范围内均能获得扩增条带，用量在
50 ng时为最佳；随机引物与模板 DNA的量之间有
一种协同作用，当随机引物达到一定的浓度时，出
现随机引物争夺模板 DNA 的情况，因此必须选择
合适的引物浓度。本试验设定的引物浓度的范围相
对于范惠玲等人[15]所设定的筛选范围更小，确定最
佳引物浓度为 0.4 μmol/L；Mg2+与 dNTPs的比例应
适当，否则会使扩增产物单链化或扩增产物减少导
致扩增失败。张秀英等[16]得出 Mg2+较小变动可导
致扩增产物较大差异，因此确定Mg2+的浓度也是很
关键的；Taq 聚合酶在实验期间不可随意更换，本
研究结果发现不同的酶得出的条带数量和大小均
有差异，严奉坤等人（2007）也得出类似结论[17]。
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