全 文 ：三叶海棠叶中水溶性总糖含量的测定
肖美凤 1，吴 萍 1*，陈 慧 1，刘 芳 1，文礼章 2
（1.湖南中医药大学药学院中药现代化重点实验室，湖南 长沙 410208；
2．湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128）
〔摘要〕 目的 测定三叶海棠叶中的水溶性总糖含量。 方法 三叶海棠叶的水提液经酸水解-乙酸乙酯萃取后，采用
试样空白的蒽酮-硫酸比色法，以葡萄糖为对照品进行总糖含量测定。结果 葡萄糖在 7～35 μg/mL 范围内，吸光度与浓
度的线性关系良好（r=0.998 1，n=6），平均回收率为 94.1%，RSD=1.0%(n=6)；3 批三叶海棠叶中的水溶性总糖平均含量
为 13.1%。结论 利用酸水解-乙酸乙酯萃取的差示光谱法(△A 法)消除了试样基体有色和脂溶性物质的干扰，使显色后
的吸收峰明显改善，结果可靠，重复性好；为三叶海棠叶中水溶性总糖的含量测定提供了一种可行的方法。
〔关键词〕 三叶海棠叶；水溶性总糖；蒽酮-硫酸比色法；差示光谱法；含量测定
〔中图分类号〕R284.1 〔文献标识码〕B 〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2013.05.017.062.03
Determination of the water-soluble total sugars
in Malussieboldii
XIAO Mei-feng1， WU ping1, CHEN Hui1, LIU Fang1, WEN Li-zhang2
(1． Key Laboratory of Hunan Traditional Chinese Medicine modernization， School of Pharmacy，
Hunan University of CM， Changsha， 410208, China；
2． College of Bio-safety Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan
410128, China)
〔Abstract〕 Objective To determine the water -soluble total sugars in water extract from
Malussieboldii． Methods The total sugars in water extract of Malussieboldii after acid hydrolysis and
extracted with ethyl acetate were determined with the anthrone -sulfuric colorimetry in which
the glucose was used as standard reference． Results The concentration of glucose showed a good
linearity with absorbance in the range of 7～35 μg/mL at 620 nm （r=0.998 1， n=6）． The average
water soluble total sugars of three shipments of Malussieboldii was 13.1%, the average recovery was
94.1%, and RSD was 1.0 %(n=6)． Conclusion The method can improve the absorption peak re-
markably with differential spectrophotometry (△A method) to eliminate the colored matrix and or-
ganic interference，which can provide a reliable and repeatable method for determination of the wa-
ter-soluble total sugars in Malussieboldii extractions．
〔Key words〕 Malussieboldii； the water -soluble total sugars； anthrone -sulfu-
ric colorimetry； differential spectrophotometry； content determination
〔收稿日期〕2012－11－26
〔基金项目〕湖南中医药科技局资助项目（201161）；湖南省科学技术厅科研条件创新专项一般项目（2012TT2012）；湖南省中药学重点学科资助
（湘教发[2011]76 号）。
〔作者简介〕肖美凤（1978-），女，湖南祁东人，讲师，主要从事中药有效成分及药物分离分析研究。
〔通讯作者〕* 吴 萍，女，副教授，硕士研究生导师，E-mail：hnwuping@yahoo.com.cn。
三叶海棠叶饲喂米缟螟 Aglossa dimidiata 幼
虫，然后取其排泄物可作药用或茶用，在我国湖南、
广西一带民间已流传数百年之久。 当地称之为 “虫
茶”，学名为三叶海棠虫酿茶(简称三叶虫茶)[1]。 文献
记载三叶虫茶是我国的土特产，是热带、亚热带地区
高温作业人员的重要饮料，能清热祛湿、健脾胃、顺
2013 年 5 月第 33 卷第 5 期
May． 2013 Vol． 33 No． 5
湖 南 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Hunan Univ． of CM62
气化痰、解毒消肿；对溃疡性结肠炎和高血压有一定
的疗效 [2-3]。 三叶虫茶中含有多糖、黄酮、皂苷、微量
元素、粗蛋白等多类化学成分，其中白杨素苷和总糖
的测定已有文献报道 [4-6]，而中药成分复杂，有的多
糖也具有抗溃疡作用， 目前三叶海棠叶中多糖的测
定未见报道。 本文采用蒽酮-硫酸比色法对三叶海
棠叶中水溶性总糖进行了含量测定， 为开发三叶海
棠这一野生植物资源提供了化学基础， 同时为进一
步研究三叶虫茶的多种药理机制提供参考。
1 仪器与试药
1．1 仪器
UV-2450 紫外可见分光光度仪 (日本岛津)；电
热恒温鼓风干燥箱 （上海一恒科技有限公司）；HH
数显恒温水浴锅 (金坛市金域国胜实验仪器厂 )；
AE200S电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有
限公司]；SK3300H 超声仪 (上海科导超声仪器有限
公司)。
1．2 试药
三叶海棠叶（Mvalussieboldii Rvehd，蔷薇科苹
果属植物， 湖南农业大学文礼章教授鉴定和提供）；
葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测
定用，批号 110833-200302），蒽酮、α-萘酚、浓硫酸、
乙酸乙酯均为分析纯；水为重蒸馏水。
蒽酮-硫酸试液：蒽酮 50 mg，加水 25 mL，再加
75 mL 浓硫酸，边加边搅拌，置于棕色试剂瓶中，冷
却至室温备用。 α-萘酚试液：α-萘酚 1 g，加 75%乙
醇至 10 mL。
2 方法与结果
2.1 总糖的检查
取三叶海棠叶粉末（过 40目筛，下同）的热水提
取液 1 mL，加 α-萘酚试液 2～3 滴，摇匀，沿试管壁
缓缓加入 0.5 mL浓硫酸，在试样液与硫酸的界面产
生紫红色环，此液经振摇后颜色变深并发热，冷却后
加水稀释，有暗紫色沉淀析出，说明有多糖存在。
2.2 对照品溶液的制备[7]
精密称取 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品
0.875 0 g，置于 250 mL量瓶中，加水使溶解并稀释
至刻度，摇匀，即得(葡萄糖浓度为 3.50 mg/mL)。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 供试品溶液 A 精密称取三叶海棠叶粉末约
0.50 g，置于 250 mL的圆底烧瓶中，加水 50 mL，称
定质量，90 ℃水浴回流 1 h，冷却，再称定质量，加
水补足减失的质量， 摇匀， 滤过， 精密量取续滤液
5 mL于 100 mL量瓶中稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3.2 供试品溶液 B 精密量取供试品溶液 A
40 mL，于 100 mL圆底烧瓶中，加入 2 mL浓硫酸，称
定质量，90 ℃水浴回流 1 h，冷却，再称定质量，加水
补足减失的质量， 摇匀， 滤过， 精密量取续滤液
10 mL，用等体积乙酸乙酯萃取 3次，分取水层，即得。
2.4 空白溶液和测定波长的选择
精密量取同一供试品溶液 （A 或 B）1.0 mL 2
份（其中 1 份为试样空白，1 份为样品），分别置于具
塞的 10 mL 的刻度管中，在冰水浴中缓慢精密加入
蒽酮-硫酸试液 4 mL， 试样空白中缓慢精密加入
75%硫酸溶液 4 mL，摇匀，放置 20 min，于 90 ℃水
浴中加热 25 min，然后常水冷却至室温，以试样空
白为参比，于 580～660 nm 波长之间扫描样品。 测
得供试品溶液 B 显 色 后 的 最 大 吸 收 波 长 在
620 nm， 而供试品溶液 A 显色后的在 580～660 nm
波长间未见明显的吸收峰，见图 1。
用对照品溶液同上操作， 分别以试剂空白和对
照品空白为参比， 测得对照品显色后的最大吸收波
长为(620±2)nm，而且使用试剂空白和对照品空白为
参比，测得同一对照品其吸收曲线重迭，见图 1，故
选 620 nm 为测定波长， 标准曲线制备时可采用试
剂空白为参比，即不必按差示光谱法(△A法)操作。
2.5 标准曲线的制备和线性关系的考察
精密量取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL对照品溶液，
分别置于 50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，再
分别精密量取 40 mL，置于 100 mL 的圆底烧瓶中，
加入 2 mL浓硫酸， 称定质量，90 ℃水浴回流 1 h，
冷却，再称定质量，加水补足减失的质量，摇匀，滤
（nm）
1.供试品溶液 A； 2.对照品； 3.供试品溶液 B
图 1 三叶海棠叶总糖显色后的吸收曲线图
肖美凤，等 三叶海棠叶中水溶性总糖含量的测定第 5 期 63
过，用等体积乙酸乙酯萃取 3 次，分取水层，各精密
量取 1.0 mL 2 份，按照“2.4”项下方法进行显色和
以试剂空白为参比在 620 nm 处测定吸光度。 以吸
光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标作图，得回归直
线方程为：
Y=0.036 9X-0.019， r=0.998 1(n=6)
结果表明， 葡萄糖在 7～35 μg/mL 范围内具有
较好的线性关系。
2.6 稳定性试验
精密量取供试品溶液 B 溶液 1.0 mL 2 份，按
“2.4” 项下方法显色后， 分别于 0、20、30、40、50、
60 min时，以试样空白为参比，于 620 nm 处测定各
吸光度，RSD为 1.2％（n=6），表明显色产物在 1 h 内
基本稳定。
2.7 重复性试验[8]
精密称取三叶海棠叶粉末约 0.50 g，共 5 份，按
“2.3.2”项下方法制备供试品溶液 B，按“2.4”项下方
法进行显色，以试样空白为参比，于 620 nm 处测定
吸光度。结果表明三叶海棠叶水溶性总糖为 12.2%，
RSD为 0.8%（n=5）。
2.8 加样回收试验
精密称取已知含量的三叶海棠叶样品粉末约
0.25 g， 共 6 份， 分别加入 9 mL 对照品溶液，按
“2.3.2”项下“供试品溶液 B”方法制备样品溶液。 精
密量取样品溶液，按“2.7”项下方法测定吸光度，计
算三叶海棠叶中水溶性总糖的平均回收率， 结果见
表 1。
2.9 三叶海棠叶中水溶性总糖的测定
分别精密称取 3 批三叶海棠叶样品粉末各约
0.50 g，各批平行 3 份，按“2.3.2”项下方法制备供试
品溶液 B，按“2.7”项下方法测定吸光度。 计算得各
批样品中水溶性总糖含量分别为 12.2%、11.9%、
12.8%， 其 RSD 分别为 0.9%、1.3%、1.5%（均为 n=
3）。 3批样品中水溶性总糖平均含量为 12.3%（经回
收率校正后为 13.1%）。
3 讨论
三叶海棠叶中水溶性总糖的测定参考三叶虫茶
水溶性总糖的蒽酮-硫酸比色法（差示光谱法）测定
时[5]，按供试液 A 制备提取后比色，不能消除试样基
体有色和脂溶性物质的干扰， 其吸收曲线中峰型不
明显， 而供试液 B 中提取液经酸水解-乙酸乙酯萃
取后，再用差示光谱法测定，其峰型明显，且最大吸
收峰在 620 nm附近，与对照品的基本一致，见图 1。
由此可见， 三叶虫茶水溶性总糖的测定不能用试剂
空白消除试样基体有色和脂溶性物质的干扰， 但用
试样空白(差示光谱法)可行，而三叶海棠叶中总糖
的测定则需用经酸水解-乙酸乙酯萃取的差示光谱
法才行。
汤灿辉等 [5]测得三叶虫茶中水溶性总糖含量为
9.67%（由 9.52%经回收率校正后得出），而 3 批三叶
海棠叶中水溶性总糖平均含量约为 13.1%（经回收
率校正后），比前者高出约 35.5%。 这些结果表明米
缟螟幼虫消化了一部分水溶性糖和某些对蒽酮-硫
酸比色法[8]有干扰的成分。 同时表明，不同样品中的
干扰物质不同，其水溶性总糖的测定方法也不同。
植物中的多糖可能也具有抗溃疡作用 [9]，而研
究表明三叶虫茶的水提取物具有抗大鼠结肠性溃疡
作用[3]。 本实验对三叶海棠叶中总糖的含量进行了
测定， 为三叶虫茶的抗溃疡性结肠炎作用机制研究
提供依据， 但对其糖类成分的组成及生理活性还有
待于进一步研究。
参考文献：
[1] 文礼章，郭海明．三叶虫茶的生物安全性及其主要化学成分分析
[J]．湖南农业大学学报，1996，22(6)：574-579．
[2] 伍菊英．三叶虫茶治疗溃疡性结肠炎 31 例疗效观察[J]．湖南中医
学院学报，1997，17(3)：27-28．
[3] 许光明，文礼章，林 艳，等．三叶虫茶提取物抗大鼠抗溃疡结肠
炎初步研究[J]．中华现代中西医杂志，2007，5(3)：161-163．
[4] 刘平安，许光明，汤灿辉，等．三叶虫茶中化学成分含量的测定[J]．
中国药房， 2009，20（9）：676-679.
[5] 汤灿辉，彭新君，文礼章，等．蒽酮-硫酸比色法测定三叶虫茶中总
糖的含量[J]．湖南中医药大学学报，2008，28（5）：38-40.
[6] 许光明，彭新君，肖美凤，等．三叶虫茶中白杨素苷的鉴定及定量
分析[J]．中国实验方剂学杂志，2008，14(7)：12-16．
[7] 黄伟坤，陈 培，王 翔．食品检验与分析[M]．北京：中国轻工业出
版社，1989：25-33.
[8] 骆苏芳，许重远，陈 英.比色法测定参芪含片中总皂苷的-含量
[J].中国医院用药评价与分析，2010，10（5）：448-449.
[9] 杨 明， 王晓娟. 树舌多糖抗溃疡作用 [J]． 中药药理与临床，
2004，20(6)：11-13.
表 1 叶海棠叶水解液中总糖的回收率测定 （n=6）
编号
1
2
3
4
5
6
称取量
（g）
0.250 8
0.231 6
0.242 3
0.239 5
0.237 1
0.242 5
原有量
（mg）
30.60
28.26
29.56
29.22
28.92
29.58
加入量
（mg）
31.59
31.59
31.59
31.59
31.59
31.59
测得量
（mg）
60.67
58.14
58.78
58.79
58.65
59.40
回收
率（%）
95.2
94.6
92.5
93.6
94.1
94.4
平均回
收率（%）
94.1
RSD
（%）
1.0
（本文编辑 杨 瑛）
湖南中医药大学学报 2013 年第 33 卷64