全 文 ：Vol. 30 No.3
Sep. 2012
第 30卷 第 3期
2012年 9月
经 济 林 研 究
Nonwood Forest Research
收稿日期：2012-01-10
基金项目：国家自然科学基金项目（31160386）；中央高校基本科研业务 费专项资金资助项目（DL11CA02）；黑龙江省自然科学基金（C201002）。
作者简介：李 静（1988—），女，内蒙古赤峰人。硕士研究生，主要从事林木资源的研究。Tel:13895714237, E-mail: LJ1988LHT@163.com。
通讯作者：孟凡娟（1975—），女，黑龙江兰西人。副教授，主要从事林木资源的研究。
光核桃 Amygdalus mira KoehneKov. et Kost又
名西藏桃，为蔷薇科桃属植物 [1]，是国内外罕见
的珍贵野生桃资源。果实中富含糖、Vc和蛋白质
等营养成分 [2]，并且资源丰富，有较高的经济利
用价值 [3]，同时具有适应性强、耐旱、抗病、长寿、
结果力强 [4]、更新容易等优良特性，且具有较高
的育种价值。
目前，有关光核桃的研究报道多集中在实生
苗培育、嫁接技术和桃仁药理等方面 [2-4]，而对于
分子生物学方面的研究报道却较少。深入研究光
核桃的分子特性的前提步骤之一是提取其高质量
光核桃叶片 DNA提取条件的优化
李 静 1，李荣钦 2，王 超 2，孟凡娟 1
（1.东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.西藏农牧学院，西藏 林芝 860000）
摘 要：光核 桃是我国特有的蔷薇科桃属植物，具有较强的耐旱、抗病能力和更新容易等特性。提取高质量的
基因组 DNA是研究光核桃的分子特性的关键所在。为了获得高质量的光核桃基因组 DNA，利用 CTAB提取法
对其提取方法进行了优化。结果表明： CTAB提取液的最佳用 量为 700 μL，最佳裂解时间为 40 min，酚、氯仿、
异戊醇混合液（体积比为 25∶ 24∶ 1）的最佳使用次数 是 2次，氯仿、异戊醇混合液（体积比为 24∶ 1）的
最佳使用次数也是 2次，异丙醇的最佳使用体积分数为 2/3。
关键词：光核桃； 基因组 DNA；提取；优化
中图分类号：S662.1 文献标志码：A 文章编号：1003—8981(2012)03—0080—04
Optimizing on extraction conditions of DNA in Amygdalus mira leaves
LI Jing1, LI Rong-qin2, WANG Chao2, MENG Fan-juan1
(1. College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China; 2. Tibet Agricultural and
Animal Husbandry College, Linzhi 860000, Tibet, China)
Abstract: Amygdalus mira belongs to Rosaceae and Amygdabus from China, and h as strong drought tolerance, disease-
resistant, easy to update, and other characteristics. The key to researching molecular properties in A. mira is to get high-
quality genomic DNA. In order for reaching the goal, the CTAB extraction method was optimized. The results show that
the best dosage of CTAB extracts is 700 μL, the best incubation time is 40 min, the best usage frequency of the mixture
of phenol, chloroform and isoamyl alcohol (25 ∶ 24 ∶ 1) is two times, the best usage frequency of the mixture of
chloroform and isoamyl alcohol (24∶ 1) is also two times, and the best volume ratio of isopropyl alcohol is 2/3.
Key words: Amygdalus mira; genomic DNA; extraction; optimizing
的基因组 DNA，但是由于光核桃叶片中含有大量
的多糖、蛋白质、多酚和色素等物质 [5]，这在很
大程度上影响了高质量 DNA的提取。为此，在原
有 CTAB法的基础上对其提取方法进行了改良，
旨在获得高质量的光核桃基因组 DNA。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用的光核桃叶片取自西藏林芝地区的
八一镇 (29°33′ N 、94°21′ E)。
DOI:10.14067/j.cnki.1003-8981.2012.03.013
81第 30卷 经 济 林 研 究
1.2 实验方法
分别将 500、600、700、800 μL 的 CTAB 提
取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0；
20 mmol/L EDTA，pH 8.0；1.4 mol/L Nacl；1%
PVP）和 20 μL的 β-巯基乙醇加入离心管中，65
℃水浴预热 [6]。称取 0.2 g的植物叶片，放入消毒
和预冷的研钵中，迅速加入液氮将叶片研磨成白
色粉末。将粉末移入已加入提取液的离心管中，混
匀，于 65 ℃下分别水浴 20、30、40、50、60 min，
其间不时地温和混匀。然后将离心管取出后冷却，
分为 0、1、2次加入预冷的 Tris-平衡酚、氯仿、异
戊醇混合液 （体积比为 25∶ 24∶ 1) 700 μL，颠
倒混匀，12 000 rpm离心 10 min，吸取上清。加入
预冷的氯仿、异戊醇混合液（体积比为 24∶ 1）
700 μL（1或 2次），颠倒混匀，12 000 rpm离心
10 min，吸取上清。加入（1/2 或 2/3或 1倍）异丙
醇，室温沉淀 10 min，12 000 rpm离心 10 min，弃
上清。加入预冷的 70% 乙醇 500 μL洗涤沉淀，
12000 rpm离心 2 min，弃上清，重复两次。室温
气干，加入 10 μL灭菌去离子水溶解 DNA。
利用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组
DNA的质量，并用分光光度计测定其在 260 nm
和 280 nm处的紫外吸收值，用 OD260/OD280的比
值表示 DNA 样的纯度，若 OD 260/OD 280 值介
于 1. 8～ 2. 0之间，则表明 DNA纯度较好。按
照 1个 OD260值相当于 50 ng·μL-1和稀释倍数来
换算 DNA的浓度。
2 结果与分析
2.1 不同用量的 CTAB提取液提取 DNA的结果
采用不同用量的 CTAB裂解液提取光核桃基
因组 DNA，结果见表 1和图 1。
从表 1中可以看出，选用 500和 600 μL的
CTAB裂解液提取 DNA，其 OD260/OD280 值大于
2.0，纯度低；而用 700和 800 μL的 CTAB裂解液
提取 DNA，其 OD260/OD280值在 1.8～ 2.0之间，
纯度较高，当用量为 700 μL时，DNA的浓度则最
高。因此，加入 700 μL的 CTAB裂解液更适于提
取光核桃基因组 DNA。
从图 1中可以看出，700和 800 μLCTAB裂解
液提取 DNA的条带清晰且整齐，这与紫外检测结
果一致。
2.2 不同裂解时间的紫外检测结果
不同裂解时间的紫外检测结果如表 2，不同裂
解时间的电泳分析结果如图 2所示。由表 2可知，
裂解时间少于 40 min时，DNA纯度不高且浓度很
低；裂解时间在 40 min以上时，DNA纯度较高。
表 2 不同裂解时间的紫外检测结果
Table 2 Result of UV scanning of genomic DNA extracted
with different dissociation time
裂解 时间
Dissociation
time /min
OD260 OD280 OD260/OD280
DNA浓度
Concentration of
DNA / (μg·mL-1)
20 0.124 5 0.052 7 2.362 4 1 245
30 0.146 1 0.063 9 2.286 3 1 461
40 0.249 2 0.127 8 1.949 9 2 492
50 0.234 3 0.119 4 1.961 4 2 343
60 0.256 9 0.138 7 1.852 3 2 569
从图 2中可看出裂解时间在 40 min以上时所
得到条带整齐无拖尾。因此提取 DNA的最佳裂解
时间为 40 min。
2.3 不同混合液和抽提次数的紫外检测结果
以“A”代表酚、氯仿、异戊醇混合液（体积
表 1 不同用量的CTAB提取基因组DNA的紫外分析结果†
Table 1 Result of UV scanning of genomic DNA extracted
with different dosages of CTAB
CTAB用量
Dosage of
CTAB /μL
OD260 OD280 OD260/OD280
DNA浓度
Concentration of
DNA / (μg·mL-1)
500 0.188 8 0.084 0 2.247 5 1 888
600 0.231 4 0.101 7 2.274 8 2 314
700 0. 306 5 0.162 0 1.891 5 3 065
800 0.288 6 0.145 2 1.987 6 2 886
† DNA浓度 (μg ·mL-1) = OD260 * 50 ng/μL* 稀释倍数。
The concentration of DNA (μg·mL-1)= OD260 * 50 ng/μL * Diluted times.
M: DNA marker; 1: 500 μLCTAB裂解液; 2: 600 μLCTAB裂解液;
3: 700 μLCTAB裂解液; 4: 800 μLCTAB裂解液。
图 1 不同用量的CTAB裂解液提取基因组DNA的电泳
分析结果
Fig. 1 Result of electrophoresis analysis of genomic DNA
extracted with different dosages of CTAB
82 第 3期李 静，等：光核桃叶片 DNA提取条件的优化
比为 25∶ 24∶ 1），以“B”代表氯仿、异戊醇
混合液（体积比为 24∶ 1）。分别用 A和 B进行
了不同抽提次数组合进行紫外检测，结果如表 3；
使用不同次数 A和 B的电泳检测结果如图 3所示。
由表 3可知，不使用或者使用 1 次 A提取
的 DNA其纯度较低，使用 2次 A提取的 DNA其
纯度较高，使用 2次 A同时使用 2次 B所提取的
DNA不仅纯度高且浓度也较高。由图 3可看出使
用 2次 A提取的 DNA条带清晰整齐，浓度高，再
使用 2次 B所提取 DNA浓度更高，这与表 3的结
果正好一致。因此，使用 2 次 A 并且同时使用
2 次 B更适于提取光核桃基因组 DNA。
2.4 不同体积异丙醇抽提 DNA的结果
添加不同体积异丙醇抽提 DNA的紫外检测结
果如表 4，不同的异丙醇使用量的电泳检测结果如
图 4所示。
M: DNA marker; 1: 20 min; 2: 30 min; 3: 40 min; 4: 50 min; 5: 60 min.
图 2 不同裂解时间的电泳分析结果
Fig. 2 Result of electrophoresis analysis of genomic DNA
extracted from different dissociation time
(M: DNA marker; 1: 0和 2次 ; 2: 1和 1次 ; 3: 1和 2次 ; 4: 2和 1次 ; 5: 2和 2次 )
图 3 不同 A和 B使用次数的电泳检测结果
Fig. 3 Result of electrophoresis analysis of genomic DNA
extracted with different use frequencies of A and B
（M: DNA Marker; 1: 1/2倍 ; 2: 2/3倍 ; 3: 1倍）
图 4 不同的异丙醇使用量的电泳检测结果
Fig. 4 Result of electrophoresis analysis of genomic DNA
extracted with different volumes of isopropyl
alcohol
表4 添加不同体积异丙醇抽提DNA的紫外检测结果
Table 4 Result of UV scanning of genomic DNA extracted
with different volumes of isopropyl alcohol
异丙醇体积分数
Volume fraction of
isopropyl alcohol
OD260 OD280 OD260/OD280
DNA浓度
Concentration of
DNA /(μg·mL-1)
1/2 0.2343 0.1194 1.9614 2343
2/3 0.3221 0.1679 1.9183 3221
1.0 0.2492 0.1278 1.9499 2492
表 3 不同A和B抽提次数的紫外检测结果
Table 3 Result of UV scanning of genomic DNA extracted
with different use frequencies of A and B
抽提次数
Extraction
frequencies OD260 OD280 OD260/OD280
DNA浓度
Concentration
of DNA
/ (μg·mL-1)A B
0 2 0.1620 0.0725 2.2344 1620
1 1 0.1709 0.0792 2.1578 1709
1 2 0.1703 0.077 2.211688 1703
2 1 0.1998 0.101 1.9785 1998
2 2 0.2858 0.1516 1.885 2858
由表 4可知，以不同使用量的异丙醇提取的
DNA其纯度都较高，其中用 2/3倍体积异丙醇所
提取的 DNA浓度最高，且图 4的电泳结果与表 4
结果一致。因此，2/3倍体积的异丙醇最适合提取
光核桃基因组 DNA。
3 讨 论
进行分子生物学研究的前提是获得高质量的基
因组 DNA，基因组 DNA质量的优劣直接影响后续
的分子生物学实验研究。许多研究结果已表明，植
83第 30卷 经 济 林 研 究
物组织中的多糖和其它一些如酚和单宁等次生代
谢产物，给 DNA的提取带来了很大的困难 [7]。
目前基因组 DNA的提取方法有 CTAB法、
SDS法和蛋白酶 K法等种 [8]，其中 CTAB法能较
好地去除酚类和多糖物质 [9]。因此，实验采用该
方法进行了光核桃叶片 DNA的提取。
由于桃叶片中含有大量的多糖、蛋白质、多
酚和色素等物质，因此实验选取 CTAB 法提取
光核桃基因组 DNA，并在 CTAB裂解液中加入
了 1.4 mol/L 的 NaCl 以去除多糖 [10]；同时加入
了 1% 的 PVP 络合多酚物质，以防止其氧化使
DNA褐化 [11]。另外，β-巯基乙醇既可降解蛋白质，
还可抑制氧化酶的活性 [12]。使用酚、氯仿、异戊
醇混合液可有效地去除叶片中的蛋白质，再用氯
仿、异戊醇混合液去除残留的酚，以减少残留的
苯酚对 DNA质量的影响。
此外，选取叶片时，应该尽量选取幼嫩的叶片，
因为成熟的叶片中多糖、蛋白质、多酚和色素类
等物质的含量较高，不利于高质量基因组 DNA
的提取。同时，研磨叶片的充分度、研磨时间和
研磨速度也是十分重要的，叶片研磨的粗细对
最后获得的 DNA的质量有很大的影响。此外，
PVP和 β-巯基乙醇的用量也不宜过多，以免清除
不净而影响后续的实验 [13]。
参考文献：
[1] 郭其强 ,罗大庆 ,王贞红 ,等 .光核桃幼苗光合特性和保护酶
对干旱胁迫的响应 [J].西北农林科技大学学报 ,2010, 38(6):
138－ 144.
[2] 耿云芬 ,张劲峰 ,李永鹏 .光核桃实生苗培育技术 [J].育苗技
术 , 2008,(2): 20.
[3] 董国正 .西藏光核桃的调查 [J].中国林副特产 ,1991,8(3):44－
45.
[4] 钟政昌 .西藏林芝地区光核桃资源生态学研究 [D].西藏 :西
藏农牧学院 , 2008.
[5] 王富荣 ,佟兆国 ,章　镇 ,等 .野生桃幼叶 DNA提取方法的
改良研究 [J].江苏农业科学 , 2006,（5）: 66－ 69.
[6] 邹明宏 ,郭凌飞 ,曾 辉 , 等 .山竹子基因组 DNA提取及
SRAP反应体系优化 [J].经济林研究 , 2009, 27(3): 38－ 41.
[7] 常月美 .核桃总 DNA提取方法研究 [J].经济林研究 , 2005,
23(3):34－ 35.
[8] 彭学贤 .植物分子生物技术应用手册 [M].北京 :化学工业出
版社 , 2006, 13(1): 52－ 54
[9] 周 凤 ,张东旭 ,吕洪飞 . 4种金丝桃属植物基因组 DNA 提
取及 RAPD分析 [J].山西大同大学学报 ,2010,26(4): 64－ 67.
[10] Fang G, Hammar S, Grumet R. A quick and inexpensive method
for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J].
Biofeedback, 1992,13(1):52－ 56.
[11] 罗志勇 ,周 钢 ,陈汀晖 ,等 .高质量植物基因组 DNA的分
离 [J].湖南医科大学学报 , 2001,26(2): 178－ 180.
[12] 彭建营 ,束怀瑞 ,彭士琪 .一种适合枣和酸枣基因组 DNA的
提取方法 [J].河北农业大学学报 , 2000, 23(4): 46－ 48, 52.
[13] 杨 丽 ,王玉柱 , 孙浩元 ,等 .扁桃基因组 DNA的提取 [J].北
方园艺 , 2008, (2): 210－ 211.
[本文编校：赵 坤 ]