全 文 ：SUZHOU UNIVERSITY JOURNAL OF MEDICAL SCIENCE 2009；29(5)
基金项目：苏州大学校级大学生创新实验计划项目（57315858）
收稿日期：2009-05-27 作者简介：陆 叶（1974-），女，黑龙江林甸人，讲师，在读医学博士，研究方向为中药质量标准。
·药 学·
鼠麴草基因组 DNA的提取方法及随机扩增多态性 DNA
分析
陆 叶 1， 张 卫 2， 梁 慧 2， 刘春宇 1
（苏州大学药学院 1.中药鉴定研究室， 2.中药专业 2005级, 江苏苏州 215123）
摘要：目的 以鼠麴草的叶为材料，研究鼠麴草 DNA的提取方法及对其进行随机扩增多态性 DNA (RAPD)的分
析。 方法 采用略改进的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、高盐低 pH法、木本法和十二烷基硫酸钠（SDS）法分别提
取鼠麴草叶的基因组 DNA。 通过 RAPD分析所提取的 DNA，比较所用的提取方法。 结果 CTAB法得到 DNA的 A260/
A280为 1.937，浓度为 992.25 μg/ml，优于其他 3种方法。 结论 CTAB法是 4种方法中最佳的方法。
关键词： 鼠麴草； 基因组 DNA； 随机扩增多态性 DNA分析
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1673-0399（2009）05-0898-03
Extraction of Genomic DNA from Gnaphalium Affine D. Don and
Random Amplified Polymorphism DNA Analysis
LU Ye1， ZHANG Wei2， LIANG Hui2， LIU Chun-yu1
(1.Dept of Authentication of Chinese Medicines, 2. Chinese Medicines Class of 2005 Grade，
Pharmaceutical School, Soochow University, Jiangsu Suzhou 215123, China)
Abstract： Objective To study the methods for extraction of genomic DNA from leaves of
Gnaphalium affine D.Don and to analyse its random amplified polymorphism DNA (RAPD) Methods
Little improved cetyltrimethyle ammonium bromide (CTAB) method， woody method， low pH medium
with high salt and sodium dodecyl sulfate (SDS） method were used to extract genomic DNA from leaves
of Gnaphalium affine D. Don． The isolated DNA samples were able to could be used directly by RAPD
analysis and then we were able to compare the four methods． Results The CTAB method was the best
with comparing with yield and quality of four extraction methods， Its A260/A280 ratio and concentration
were 1.937 and 992.25 μg/ml respectively． Conclusion CTAB methods is considered to be a optimal
technique among the four methods ．
Key words： Gnaphalium affine D. Don； genic DNA； random amplified polymorphism DNA
鼠麴草为菊科植物鼠麴草 （Gnaphalium affine
D.Don）的干燥全草，最早收载于 1977版药典中。 主
产于江苏、浙江、上海等地，性味甘、平,无毒[1]，具有
止咳化痰﹑平喘﹑降血压﹑祛风湿等功效[2]。 近年来报
道了一些鼠麴草的化学成分和药理活性等方面的
研究。 对于分子方面的鉴别研究未见报道。 我们以
鼠麴草的鲜叶作为基因组 DNA提取的材料， 分别
采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyle ammo-
nium bromide, CTAB）法、木本法、高盐低 pH法和十
二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）法提取
其总的基因组 DNA， 以期从中筛选出提取高纯度、
高产率 DNA的方法， 并初步进行随机扩增多态性
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苏州大学学报(医学版)2009；29(5)
DNA （random amplified polymorphism DNA, RAPD）
分析。
1 材料与方法
1.1 材料
2008年 4～5月于苏州大学独墅湖校区内采集
鼠麴草的嫩叶 (经苏州大学药学院刘春宇教授鉴
定)，然后用 70%乙醇擦拭材料的表面，自然晾干，放
置于-70℃冰箱中冷冻保存备用。
1.2 方法
1.2.1 鼠麴草基因组 DNA的提取 （1）CTAB法[3]：
取材料 200 mg，加一定量的 PVP共研，研成细粉状
（以下 3种方法同）。提取缓冲液为 0.7 mol/L NaCl、
50 mmol/L Tris (pH8)、10 mmol/L EDTA (pH8.0) 和
1% PVP、1%CTAB， 用无水乙醇室温放置 2 min沉
淀， 沉淀自然干燥后， 将 DNA沉淀溶于 100 μl的
TE缓冲液中（以下 3种方法同）。 于-20℃下保存备
用。 （2）木本法[4]：提取缓冲液和细胞裂解液中均未
加 β-巯基乙醇。 （3）高盐低 pH法[5]：纯化用的 2.5
mol/L NaAc的 pH改为 5.2。 （4）SDS法[5]：提取缓冲
液为 100 mmol/L Tris. Cl（pH 8.0）、50 mmol/L EDTA
（pH8.0）、500 mmol/L NaCl及少量 PVP， 未加 β-巯
基乙醇和非水溶性的 PVP； 纯化改用 5mol/L NaAc
（pH5.2）。
1.2.2 DNA 质量检测 （1）基因组 DNA 电泳检
测： 取 10 μl基因组 DNA加入适量的上样缓冲液，
用 0.5×TAE、1%琼脂糖凝胶电泳，以 10 V/cm稳定电
压电泳 20 min左右， 然后在紫外线透射仪上观察、
拍照。（2）基因组 DNA浓度测定：DU730核酸蛋白分
析仪检测 DNA质量和浓度:将提取的 DNA用 TE稀
释 50倍，然后在 260 nm和 280 nm波长下分别测吸
光度（A）值。 （3）RAPD 分析：①PCR 50 μl 反应体
系：模板 DNA X μl（10~50 ng），引物（100 μmol/L）
(引物序列见表 1)2 μl，2×Taq Master Mix 20 μl，无核
酸酶的水 28－X μl， 总体积 50 μl。 ②PCR反应条
件：94℃预变性 3 min，94℃变性 45 s，40℃复性 45
s，72℃延伸 2 min，共 26个循环，72℃延伸 10 min，
-20℃条件下保存。
2 结果
2.1 不同方法提取的鼠麴草基因组DNA电泳检测
基因组 DNA电泳检测表明，4种方法均能提取
较高质量的基因组 DNA（见图 1）。
2.2 不同方法提取的鼠麴草 DNA纯度及浓度分析
4种方法中，CTAB法较木本法、高盐低 pH法、
SDS法提取的 DNA产率及质量略好（见表 2）。
2.3 不同方法提取的鼠麴草 DNA的 RAPD分析
先用 CTAB法提取的样品筛选 10个随机引物,
然后再用多态性好的引物去扩增其他样品。 10个引
物中除 6、8引物外，均能扩增出 3条以上的条带且
清晰。 对于基因组提取过程中 RNA的残留，对 PCR
扩增基本无影响（见图 2）。 10个引物中筛选出 9号
引物用于所有样品的 RAPD分析（见图 3）。
3 讨论
由图 2可知，筛选的 10个随机引物中，除 6、8
外均对 CTAB法提取的材料能扩增出 3条以上的条
带并较清晰。 其中 1、2、3、9、10号引物较好，再分别
用这 5个引物进行对所有样品进行 PCR扩增，发现
9号引物对所有样品的 RAPD-PCR扩增的条带多且
较清晰， 且对 4种方法提取的 DNA扩增的条带一
致， 表明 9号引物对于鼠麴草的 RAPD分析较好，
（随机引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）
注：样品 5、6用 RNaseA酶 65℃消化 20 min；表中数据
均为 3次测定的平均值
编 号 序列(5’→3’)
1 GGGTAACGCC
2 CAGGCCCTTC
3 AATCGGGCTG
4 GTGACGTAGG
5 AGGGGTCTTG
6 CAAACGTCGG
7 TCGGCGATAG
8 CAGCACCCAC
9 ACTCAGCCAC
10 TGCCGAGCTG
表 1 随机引物序列及编号
表 2 样品 DNA的质量和浓度（x±s）
样 品 方法 A260/A280 DNA浓度(μg/ml)
1 CTAB法 1.937±0.011 992.25±0.44
2 木本法 1.914±0.012 699.30±0.65
3 高盐低 pH法 2.240±0.021 487.34±0.61
4 SDS法 2.163±0.023 661.42±0.57
5 高盐低 pH法 1.956±0.014 871.60±0.97
6 SDS法 1.847±0.013 1035.10±1.64
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1：CTAB法；2：木本法；3：高盐低
pH法；4：SDS法(其中 3和 4未去
除 RNA)；M：marker
图 1 鼠麴草基因组 DNA电泳图
1~10：10个随机引物对 CTAB法提取样品 DNA的
PCR扩增结果； 11、12：表 2中样品 5、6的 PCR扩
增结果；M：marker
图 2 不同方法提取基因组的 RAPD分析
可用于下一步种间的多态性分析及亲缘关系研究
等。
对于高盐低 pH 法和 SDS 提取法， 我们也用
RNaseA酶在 65℃消化 20 min以去除 RNA，并对比
消化 RNA前后的 RAPD-PCR扩增结果，发现 RNA
的存在对 RAPD扩增无影响。 这和王培训等[6]的观
点一致。 但王培训还认为用高盐低 pH 法得到的
DNA往往不能直接用于 PCR反应， 本实验未对这
种方法提取的基因组 DNA进行稀释。
DNA模板浓度对 RAPD结果的影响， 王培训
等[6]认为模板的浓度 5~50 ng/50 μl体系最佳，高浓
度 DNA影响 RAPD的重复性。 我们在对模板的量
中进行筛选时，发现 5~10 ng/50 μl体系中的模板的
量就可以扩增出清晰稳定的条带。
参考文献：
[1] 江苏新医学院.中药大辞典 [M] . 上海：上海科学技术出
版社，1986：2501-2502.
[2] 和积鉴.昆明种子植物要览[M]. 昆明：云南大学出版社，
1990：452.
[3] 严奉坤，许 兴，魏玉清，等. 枸杞基因组 DNA提取及指
纹图谱分析[J]. 时珍国医国药，2007，18（1）：46-48.
[4] 罗 禹，王天志，杨 兵，等. 川芎 DNA提取方法的研究
[J]. 华西药学杂志,2007，22（2）：124-126.
[5] 戴思兰，陈俊愉，高荣孚，等. DNA提纯方法对 9种菊属
植物 RAPD的影响[J].园艺学报,1996，23（2）：169-174.
[6] 王培训， 周 联， 赖小平. 分子生物学技术与中药鉴别
[M].西安：世界图书出版公司西安公司,2002：171-175.
1 2 3 4 M
4 000
3 000
2 000
1 200
800
500
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
23 130
9 416
6 557
4 361
2 322
2 027
564
M 1 2 3 4
4 000
3 000
2 000
1 200
800
500
200
M：marker；1：CTAB法；2：木本法；
3：高盐低 pH法；4：SDS法
图 3 9号引物对 4种方法提取的
样品 RAPD-PCR扩增结果
bp
bp
机制，减少脂肪分解，发挥减轻机体 IR 的作用，但
其具体机制尚待进一步研究。
参考文献：
[1] 徐广琦，冯玉艳.代谢综合征与心血管疾病研究进展[J].
中华中西医学杂志，2006，4（8）：8-9.
[2] 茅彩萍，顾振纶，曹 莉，等. 葛根素对 AGEs诱导 CAM
新生血管生成影响的实验研究[J]. 中国药理学通报，
2005，21（4）：420-423.
[3] 曹 莉，顾振纶，茅彩萍. 葛根素对糖尿病小鼠胰岛素抵
抗的影响[J]. 中草药，2006，37（6）：901-904.
[4] 曹 莉，茅彩萍，顾振纶. 葛根素对高脂饮食大鼠胰岛素
敏感性的影响[J]. 中国药理学通报，2007，23（12）：1598-
1601.
[5] 田爱平， 郭赛珊， 申竹芳. 高脂饲料与胰岛素抵抗模型
[J]. 中国药理学通报，2006，22(3)：267－269．
[6] 向红丁. 关注胰岛素抵抗与代谢综合征 [J]. 中国糖尿病
杂志，2009，17（1）：4-5.
[7] Wojtaszewski JF, Jorgensen SB, Frosig C, et al. Insulin
signaling: effect of prior exercise [J]. Acts Physiology
Scand， 2003，178（4）：321-328.
[8] Cohen PG. Aromatase, adiposity, aging and disease: the
hypogonadal -metabolic -atherogenic -disease and aging
connection[J]. Med Hypotheses，2001，56(6):702-708.
[9] 肖 玲，吴国亭，韩玉麒. 高血压病患者血清瘦素含量与
IR水平的相关性研究[J]. 同济大学学报:医学版，2004，
25（6）：480-483.
[10] Ma Y, Toth B, Keeton AB, et al. Mechanisms of
hemorrhage-induced hepatic insulin resistance: role of
tumor necrosis factor-α[J]. Endocrinology, 2004, 145(11):
5168-5176.
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