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毛叶疏花蔷薇果提取物急性经口毒性和遗传毒性



全 文 :国际药学研究杂志 2016年4月 第43卷 第2期 J Int Pharm Res,Vol.43,No.2,April,2016
野生蔷薇为蔷薇科(Rosaceae)落叶小灌木,喜
生于路旁、田边或丘陵的灌木丛中,会结出果实,人
工栽培的蔷薇多用作观赏而很少结果。近年来的
研究[1-2]表明,蔷薇果提取物具有抑制不同肿瘤细胞
生长和有效抑菌等药理活性。且由于富含大量维
生素和多种微量元素,现代工业将野生蔷薇果开发
制成果汁饮品食用[3]。随着研究的深入,其天然的
保健作用备受人们关注,但随着摄入量的增加或长
期食用,安全性的客观数据评价以及合适的功效剂
量尤为重要。因此本研究选择急性经口毒性实验
和4项遗传毒性实验,对毛叶疏花蔷薇(Rosa laxa Retz.
var. mollis Yu et Ku)果提取物的毒性进行初步评价
和筛选,为其安全性和临床应用提供实验室依据。
1 材料和方法
1. 1 试药
野生蔷薇果于 2013年 9月采集于新疆阿尔泰
山区,经本院天然药物化学教研组鉴定为蔷薇科宿
萼大叶系毛叶疏花蔷薇的新鲜果实。提取物的制
备[4]:将果实除去种子及种毛于103℃烘干研磨成粉
基金项目:湖南中医药科研计划资助项目(2013106)
作者简介(*通讯作者):杨 智,男,实验师,硕士,研究方向:中药复方及实验动物相关研究,E-mail:27196072@qq.com
作者单位:1. 410013 长沙,湖南师范大学医学院(杨 智,金 红);2. 410005 长沙,湖南省疾病预防控制中心(马 征);3. 410001 长沙,湖南
省食品药品检验研究院(马晓宁)
毛叶疏花蔷薇果提取物急性经口毒性和遗传毒性
杨 智 1*,马 征 2,金 红 1,马晓宁 3
[摘要] 目的 研究毛叶疏花蔷薇果提取物的急性经口毒性和遗传毒性。方法 急性经口毒性采用最大耐受量法;遗传
毒性采用鼠伤寒沙门菌回复突变实验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验、小鼠精子畸形实验和单细胞凝胶电泳实验等4项致
突变生物学实验进行筛选评价。结果 大鼠急性经口毒性>15.0 g/kg,小鼠急性经口毒性>20.0 g/kg;在受试剂量水平下,4项
遗传毒性实验结果均为阴性。结论 在本实验室中采用SPF级动物,遵照国际公认动物伦理和技术规范进行实验,毛叶疏花
蔷薇果提取物为无毒物,且未见明显遗传毒性。
[关键词] 毛叶疏花蔷薇果;提取物;急性经口毒性;遗传毒性
[中图分类号] R965.3 [文献标志码] A [文章编号] 1674-0440(2016)02-0314-06
DOI:10.13220/j.cnki.jipr.2016.02.021
Acute oral toxicity and genotoxicity of Rosa laxa
Retz. var. mollis Yu et Ku cynarrhodion extracts
YANG Zhi1*,MA Zheng2,JIN Hong1,MA Xiao-ning3
(1. Medical College of Hunan Normal University,Changsha 410013,China;2. Hunan Provincial Center for Disease Prevention
and Control,Changsha 410005,China;3. Hunan Institute for Food and Drug Control,Changsha 410001,China)
[Abstract] Objective To study the acute oral toxicity and genotoxicity of Rosa laxa Retz. var. mollis Yu et Ku cynarrhodion
extracts. Methods The acute oral toxicity in mice and rats(maximal tolerance dose,MTD)were observed for 14 days after adminis⁃
tration. Genetictoxicity was evaluated on Salmonella typhimurium reverse mutation assay(Ames test),in vivo mammalian erythrocyte
micronucleus assay,sperm malformation assay in mice and single cell gel electrophoresis(Comet assay). Results In acute oral toxici⁃
ty study,the behavior,clinical signs and body changes were normal in all experimental animals. LD50>15.0 g/kg(rats)and 20.0 g/kg
(mice). In the test dose range,results of the four genotoxicity tests were negative. Conclusions In accordance with internationally
recognized animal ethics and technical specifications for the experiments using SPF animals in our lab,the acute oral toxicity of R.
laxa Retz. var. mollis Yu et Ku cynarrhodion extracts is classified as nontoxic,and genotoxicity is not observed under the test condition.
[Key words] Rosa laxa Retz. var. mollis Yu et Ku cynarrhodion;extracts;acute oral toxicity;genotoxicity
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国际药学研究杂志 2016年4月 第43卷 第2期 J Int Pharm Res,Vol.43,No.2,April,2016
过筛,脱脂,以固液比 1∶20(g/ml)的 80%乙醇,在
80℃回流提取4 h,纱布滤过,对滤渣重复提取1次,
合并提取液过碱性大孔树脂柱,加乙酸乙酯超声萃
取后于旋转蒸发仪上减压蒸至浸膏状,真空冷冻干
燥后得棕色粉末,密封冷藏备用。
体外代谢活化系统S9(批号3239),上海宝录生
物科技有限公司;环磷酰胺(批号 20121103),山西
普德药业公司;小牛血清(批号 131007),浙江天杭
生物科技有限公司;9-芴酮(9- fluorenone,批号
1166),美国Aldrich Chem公司;叠氮钠(NaN3,批号
051220),上海化学试剂采购供应站;1,8-二羟蒽醌
(1,8-dihydroxyanthraquinone,批号 7238243),德国
Merck- Schuchardt 公司;丝裂霉素 C(MMC,批号
460AJE01),日本Kyowa Hakko Kogyo公司;2-氨基芴
(2-AF,批号 252361),瑞士Fluka Chemie公司;溴乙
啶(EB,批号0492),美国Sigma-Aldrich公司等。
1. 2 仪器
BBS-SSC超净工作台,济南博鑫生物技术有限
公司;FlashGo菌落计数仪,西班牙 IUL公司;AJ100
万分之一电子天平,瑞士Mettler-Toledo公司;MaxQ
420HP恒温摇床,美国Thermo公司;GHP-9160隔水
式恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;SX-
500全自动高压灭菌器,日本 Tomy公司;BX51T系
统荧光显微镜,日本Olympus公司;R-220旋转蒸发
仪,瑞士 Büchi公司;真空冷冻干燥机,美国 LAB⁃
CONCO公司;电泳仪,美国Bio-Rad公司;凝胶电泳
成像分析系统,美国Alpha Innotech公司等。
1. 3 实验动物与菌株
SPF级SD大鼠和KM种小鼠由湖南斯莱克景达
实验动物有限公司提供,生产许可证号为 SCXK
(湘)2009-0004,实验动物使用许可证号为 SYXK
(湘)2012-0005。TA97、TA98、TA100和TA102标准
测试菌株由江苏省疾控中心提供。
1. 4 急性经口毒性实验
采用最大耐受量法[5]。选体质量 180~220 g大
鼠或 18~22 g大小鼠各 20只,雌雄各半。取毛叶疏
花蔷薇果提取物50.00 g加蒸馏水至100 ml,达最大
可灌胃浓度。一日内多次给动物灌胃染毒(每次间
隔4~6 h,24 h内不超过3次,尽可能达到最大剂量,
合并作为一次剂量计算),灌胃体积分别为10 ml/kg
(大鼠,以 5.0 g/kg的剂量在 24 h内间隔 4 h灌胃 3
次,累计达15.0 g/kg)和20 ml/kg(小鼠,以10.0 g/kg的
剂量在24 h内间隔4 h灌胃2次,累计达20.0 g/kg),
首次灌胃前禁食 16 h。灌胃后连续观察 2周,记录
体质量和中毒表现及死亡情况。
1. 5 鼠伤寒沙门菌回复突变实验(Ames实验)
采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门菌组氨酸
缺陷型TA97、TA98、TA100和TA102等4株菌株,按
平板掺入法进行实验[6]。采用多氯联苯诱导的大鼠
肝微粒体酶(S9)作为体外代谢活化系统。根据预
实验结果设5个剂量,分别为80、400、2000、10000和
50000 mg/L,同时设自发回变、溶剂对照(双蒸水)和
阳性突变剂对照(TA97+S9、TA98+S9、TA100+S9采
用 100 mg/L的 2-AF;TA97-S9、TA98-S9采用 2 mg/L
的 9-芴酮;TA100-S9采用 15 mg/L的NaN3;TA102+
S9采用 500 mg/L的 1,8-二羟蒽醌;TA102-S9采用
5 mg/L的MMC)。配制时取受试物 1.25 g加双蒸水
至25 ml,为50 g/L剂量,取此液5.0 ml加双蒸水定容
至25 ml配成10 g/L,其他3个剂量如此类推配制,经
0.103 MPa,20 min灭菌后备用。实验时,在顶层琼
脂中加入0.1 ml实验菌株增菌液、0.1 ml受试物溶液
和0.5 ml 10%的S9混合液(当需要代谢活化时),混
匀后倒入底层培养基平板上。37 ℃培养48 h,计数
每皿菌落数。每个剂量设 3个平行皿,整套实验在
相同实验条件下重复1次。如果受试物的回变菌落
数超过自发回变菌落数>2倍,并有剂量-反应关系
者定为阳性。
1. 6 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定实验
采用 30 h 2次给药法[6],即 2次给药间隔 24 h,
第2次给药后6 h取材。取体质量25~30 g的小鼠进
行实验。实验设空白对照组(双蒸水)、阳性对照组
(40 mg/kg环磷酰胺)和 3个剂量组(参考人用药物
注册技术要求国际协调会(ICH)等组织颁布的相关
标准规范,结合本室小鼠急性经口毒性结果,剂量
设计分别为受试药物的1/2、1/4、1/8的半数致死量,
即低、中、高剂量分别为 2.5、5和 10 g/kg,每组 10只
动物,雌雄各半。实验前新鲜配成相应的受试液给
小鼠灌胃(灌胃体积为20 ml/kg)。末次灌胃6 h后,
颈椎脱臼处死动物,取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂
片,甲醇固定,Giemsa染色。光学显微镜下,每只动
物计数 1000个嗜多染红细胞(PCE)和正染红细胞
(NCE),微核发生率以含微核的PCE千分率计。同
时计算PCE/NCE。结果评价时,剂量组与空白对照
组比较,微核率有剂量反应关系并有统计学意义即
可确认为阳性结果;若有统计学意义但无剂量反应
关系须重复实验,结果能重复者确认为阳性。
1. 7 小鼠精子畸形检测实验
取体质量25~35 g的雄性小鼠,每组5只动物进
行实验。组别、剂量设计和结果判定同微核实验,
新鲜配成相应的受试液给小鼠灌胃,连续染毒5 d,1
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国际药学研究杂志 2016年4月 第43卷 第2期 J Int Pharm Res,Vol.43,No.2,April,2016
次/d,于首次染毒后第 35天处死动物,取副睾于生
理盐水中剪开静置,4层擦镜纸滤过后涂片,甲醇固
定,1%伊红染色。光学显微镜下,每只动物计数
1000个结构完整的精子,计算畸变精子发生率[7]。
1. 8 单细胞凝胶电泳实验(彗星实验)
微核实验中动物胸骨取材后,同时取股骨去两
端用冰冷适量磷酸盐缓冲液(PBS,临用前加10%的
DMSO)冲洗骨髓腔,制成单细胞悬液,显微镜下调整
细胞密度至108/L,放入冰盒内备用。将0.75%正常熔
点琼脂糖100 μl铺于磨砂载玻片上,加盖玻片于4 ℃
冷却固化后去掉盖玻片,再取10 μl细胞悬液与90 μl
0.75%低熔点琼脂糖混合,滴加到第一层凝胶上,加
盖玻片冷却固化。将载玻片移去盖玻片缓慢放入
裂解液中,4 °C放置1.5 h。经中和处理后将载玻片
放入电泳槽中,加电泳液覆盖,4 °C放置25 min。接
通电源 20 V,电流量 300 mA,4 °C电泳 25 min。经
中和处理后,每块载玻片滴加2 mg/L的溴乙啶20 μl
荧光染色 20 min,避光条件下用Alpha View凝胶图
像分析软件随机计数50个细胞,记录拖尾细胞数计
算拖尾阳性率,并测量尾部DNA百分含量[6-7]。
1. 9 统计学分析
各组数据用 x±s表示,采用 SPSS 18.0软件进行
单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 毛叶疏花蔷薇果提取物对大、小鼠的急性经
口毒性
以15.0和20.0 g/kg剂量的毛叶疏花蔷薇果提取
物分别给两种性别的大、小鼠灌胃后,出现活动减
少、腹泻现象,第 3天基本恢复正常,观察期 14 d内
无死亡,动物体质量增长均在正常值范围内,且与
对照动物比较,第 7天和实验末的体质量差异无统
计学意义。观察期结束后对所有动物主要脏器做
大体解剖观察,未见明显异常改变。
2. 2 毛叶疏花蔷薇果提取物对鼠伤寒沙门菌回复
突变的影响
由表 1和表 2可见,正式实验中,在 80~50 000
mg/L剂量水平,受试药物对 TA97、TA98、TA100和
TA102等4株实验菌株,加与不加S9,平行条件下实
验 2次,回变菌落数均未超过自发回变菌落数的 2
倍,亦无剂量效应关系。
2. 3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率测定结果
由表 2可见,各剂量组的PCE/NCE比值均在本
室正常值范围(0.9~1.2)内,且不少于对照组的
表1 受试药物对4株鼠伤寒沙门菌回复突变菌落数的影响
Tab.1 Effects of the test substance on bacterial reverse mutation test using four strains of salmonella typhimurium
注:**P<0.01,与自发回变组比较;x±s,n=3
**P< 0.01,compared with spontaneiuous mutation group;x±s,n=3
组别
第1次
受试药物
自发回变
溶剂对照
阳性对照
第2次
受试药物
自发回变
溶剂对照
阳性对照
剂量
(mg/L)
80
400
2000
10 000
50 000
80
400
2000
10 000
50 000
+(S9)
156±14
152±17
156±16
151±16
157±17
152±16
149±12
1341±166**
154±13
151±12
152±13
158±18
150±12
155±22
153±13
1272±254**
-(S9)
154±15
148±21
155±13
158±17
149±13
153±12
157±19
1269±192**
150±11
155±16
147±17
152±11
155±16
158±10
156±21
1268±197**
+(S9)
38±5
37±2
36±5
35±5
38±6
36±5
35±5
3224±258**
36±5
36±4
35±4
35±3
37±5
37±3
35±6
3158±225**
-(S9)
36±5
36±5
35±3
36±5
37±4
39±6
36±4
2439±130**
36±4
35±4
38±6
35±7
35±6
35±4
35±3
2410±223**
+(S9)
167±17
174±24
167±13
172±11
175±17
172±13
167±11
2248±168**
170±23
173±13
171±18
172±17
169±20
173±19
162±11
2360±230**
-(S9)
170±19
171±16
170±16
166±16
178±20
175±10
173±14
2304±221**
168±12
165±20
170±15
175±13
173±14
164±18
173±16
2224±186**
+(S9)
294±24
285±17
284±17
293±21
288±20
286±19
289±16
928±135**
289±18
295±17
294±26
294±18
290±22
288±16
294±22
933±63**
-(S9)
290±14
292±20
290±22
286±27
295±17
293±18
295±21
2289±203**
294±15
281±20
294±30
295±20
291±23
292±14
287±24
2330±298**
TA97 TA98 TA100 TA102
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国际药学研究杂志 2016年4月 第43卷 第2期 J Int Pharm Res,Vol.43,No.2,April,2016
20%,表明受试物浓度设置合理,PCE的形成没有受
到抑制。与空白对照组〔雄性小鼠微核率为(1.0±
1.0)‰,雌性为(0.8±0.4)‰〕比较,受试药物各剂量
组微核率差异均无统计学意义(P>0.05),而环磷酰
胺组雄性达到(29.0 ± 3.9)‰,雌性达到(25.6 ±
4.0)‰,差异显著有统计学意义(P<0.01)。
2. 4 精子畸形率测定结果
由表 3可见,与空白对照组畸形率为(1.98±
0.16)%,与空白对照组比较,受试药物各剂量组精
子畸形发生率均无统计学差异(P>0.05),而环磷酰
胺组畸形率达(10.48±1.07)%,差异有显著统计学意
义(P<0.01)。此外,根据 GB15193.7-2003中小鼠
精子畸形分类标准(精子畸形主要表现在头部,其
次为尾部,可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折
叠、双头、双尾等),对精子畸形构成比进行统计,结
果提示精子畸形构成比本底值稳定,结果真实可
信。
2. 5 彗星实验测定结果
由表 4可见,空白对照组雄性小鼠的拖尾率和
尾部 DNA 含量分别为(2.80 ± 1.57)%和(9.02 ±
1.88)%,雌性分别为(4.40±0.79)%和(9.41±1.79)%;
与空白对照组比较,受试药物各剂量组的彗星拖尾
率和尾部DNA含量差异均无统计学意义(P>0.05),
而环磷酰胺组雄性小鼠的拖尾率和尾部DNA含量
分别达到(44.80±8.85)%和(38.21±8.13)%;雌性分
别达到(38.80±11.56)%和(33.15±6.52)%,差异有统
计学意义(P<0.01)。
3 讨论
天然植物富含多种活性成分,黄酮类化合物就
是其中的一大类。野生蔷薇果中富含大量维生素
和黄酮类化合物[8]。其中的黄酮类物质能有效对抗
油脂的氧化[9]。此外,田莉等[2]发现,疏花蔷薇果不
同极性溶剂的提取物对变异链球菌生长和大肠杆
菌生物膜的形成均具有较好的抑制作用,其中氯仿
提取物、乙酸乙酯提取物的抑菌效果最好。Hosseini
等[10]用不同溶剂提取大马士草蔷薇中的活性成分,
其中水和乙醇提取物能有效对抗戊四唑所致的小
注:**P<0.01,与空白对照组比较;x±s,n=5
**P<0.01,compared with solvent control group;x±s,n=5
表2 受试药物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率的影响
Tab.2 Effects of the test substance on permillage of PCE in mice bone marrow erythrocytes
性别


组别
阳性对照
空白对照
受试药物
阳性对照
空白对照
受试药物
剂量(mg/kg)
40
0
2500
5000
10 000
40
0
2500
5000
10 000
PCE数(个)
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
含微核数(个)
145
5
4
5
6
128
4
4
3
5
微核率(‰)
29.0±3.9**
1.0±1.0
0.8±0.8
1.0±1.0
1.2±0.8
25.6±4.0**
0.8±0.4
0.8±0.8
0.6±0.5
1.0±0.7
PCE数(个)
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
NCE数(个)
1062
858
882
875
861
1049
859
864
870
863
PCE/NCE
0.943±0.042
1.168±0.054
1.135±0.049
1.144±0.044
1.163±0.042
0.955±0.042
1.167±0.059
1.159±0.052
1.152±0.064
1.160±0.038
表3 受试药物对小鼠精子畸形发生率的影响
Tab.3 Effects of the test substance on percentage of sperm malformation in mice
注:**P<0.01,与空白对照组比较;x±s,n=5
**P<0.01,compared with solvent control group;x±s,n=5
组别
阳性对照
空白对照
受试药物
剂量
(mg/kg)
40
0
2500
5000
10 000
受检总数
(个)
5000
5000
5000
5000
5000
畸形总数
(个)
524
99
95
102
100
精子畸形率
(%)
10.48±1.07**
1.98±0.16
1.90±0.21
2.04±0.22
2.00±0.14
无钩
24.7±2.6
22.4±5.4
27.3±5.8
24.6±3.2
22.9±3.6
香蕉形
19.6±2.6
23.2±3.5
21.3±4.4
21.4±2.6
22.9±3.2
胖头
19.9±6.0
21.2±4.8
22.0±2.8
23.2±4.4
23.0±2.1
无定形
34.0±6.2
33.2±4.2
29.5±2.9
30.8±6.4
31.2±5.7
尾折叠
0.9±0.6
0.0±0.0
0.0±0.0
0.0±0.0
0.0±0.0
双头
0.5±0.5
0.0±0.0
0.0±0.0
0.0±0.0
0.0±0.0
双尾
0.3±0.5
0.0±0.0
0.0±0.0
0.0±0.0
0.0±0.0
各类精子畸形的构成比(%)
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鼠痉挛作用。这些资料提示野生蔷薇果提取物的
诸多药理活性主要集中在黄酮类化合物。因此我
们参考外塔尼古丽·卡米力等[4]提取维药蔷薇果总
黄酮的工艺制备受试样品,研究毛叶疏花蔷薇果提
取物的安全性和药理活性。
急性毒性实验是评价药物安全性的一项重要
基础指标。实验中采用最大耐受量法在短时间内
给动物大剂量染毒,观察动物的反应。研究中,累
积灌胃最大剂量分别达到15.0和20.0 g/kg,大、小鼠
均未出现死亡情况,除了刚开始灌胃后第 1天内动
物活动减少和腹泻,之后生长良好。探究原因可能
是大剂量受试物短时间内刺激动物肠胃,使其不
适。实验末剖检存活动物,主要脏器均未发现肉眼
可见的病变。提示在本实验室条件下,短期内毛叶
疏花蔷薇果提取物对大、小鼠是安全的,不必确切求
得其半数致死量(LD50),最大耐受量均>15.0 g/kg,
属无毒物[11]。
遗传毒性筛选实验的意义在于评价受试物的
致突变性。课题组根据本室条件结合急性经口毒
性的结果,参考国际上常用的实验方法[6],从体内和
体外评价毛叶疏花蔷薇果提取物对原核和真核细
胞、生殖和体细胞的遗传毒性。Ames是检测诱变剂
实验中的首选,广泛应用于致突变化学物的初筛[12]。
鼠伤寒沙门菌组氨酸营养缺陷型菌株由于不能合
成组氨酸,故在缺乏组氨酸的培养基上仅有少数自
发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在,缺
陷型细菌会回复突变成原型,因而能生长形成菌
落,据此来判断受试物是否为致突变物。同时为增
加实验的可靠性,在检测中加入代谢活化系统处理
受试物,观察代谢活化后回变菌落数有无增加。考
虑到提取物中黄酮类物质的抑菌作用,在实验正式
开始前通过预实验来确定最高剂量。结果提示,在
本实验条件下50 g/L浓度的受试物对4株鼠伤寒沙
门菌未见明显抑菌作用;正式实验中,在加和不加
S9的条件下,平行操作 2次,Ames实验结果均为阴
性,表明其既无间接诱变活性,也无直接诱变活
性。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验是反映受试
物对哺乳动物骨髓细胞染色体损伤作用的能力,可
检测DNA的断裂和非整倍体诱变[13]。精子的形态
受到基因的控制,精子畸形实验则可判断受试物能
否造成决定精子形成的基因发生了突变,从而反映
生殖系统在外来诱变剂作用下的变异情况。此外,
遵循“3R(replacement,reduction,refinement)”原则,
体内彗星实验整合体内微核实验,作为第 2个检测
终点,检测单细胞水平的DNA链断裂情况[14]。这 3
个体内实验中,以单次最大灌胃浓度(10 g/kg)为最
高剂量向下等比设置 2个剂量进行经口染毒,结果
显示,在检测剂量水平均为阴性。
综上所述,在本实验条件下毛叶疏花蔷薇果提
取物属无毒物且未见明显遗传毒性,作为药物或保
健食品开发具有广泛的前景,值得进一步研究。
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表4 受试药物对小鼠骨髓细胞彗星实验结果的影响
Tab.4 Effects of the test substance on comet assay in mice
注:**P<0.01,与空白对照组比较;x±s,n=5
**P<0.01,compared with solvent control group;x±s,n=5
性别


组别
阳性对照
空白对照
受试药物
阳性对照
空白对照
受试药物
剂量(mg/kg)
40
0
2500
5000
10 000
40
0
2500
5000
10 000
观察细胞数(个)
250
250
250
250
250
250
250
250
250
250
拖尾细胞数(个)
112
7
6
10
8
97
11
12
8
9
拖尾率(%)
44.80±8.85**
2.80±1.57
2.40±0.54
4.00±1.96
3.20±1.12
38.80±11.56**
4.40±0.79
4.80±2.34
3.20±1.04
3.60±0.36
尾部DNA含量(%)
38.21±8.13**
9.02±1.88
8.14±2.75
11.32±3.54
9.56±1.59
33.15±6.52**
9.41±1.79
8.82±2.86
7.52±1.16
7.76±2.14
(下转第324页)
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