全 文 ：山荆子 CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建
刘晓丹 徐亚维 叶 飞 于晓明
（吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林 132101）
摘要 利用 RT-PCR 技术从山荆子 cDNA 中克隆 CBF 基因，ORF 全长 756 bp，编码 252 个氨基酸；其氨基酸序列含典型的 CBF 基因
蛋白保守的序列 AP2/EREB DNA 结合域及 CBF 家族蛋白特征短多肽序列（PKK/RPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR）；与 Genebank 上收录的几
种植物 CBF 基因进行氨基酸同源性比对，结果发现山荆子 CBF 转录因子 MbCBF 和苹果 CBF/DREB1 基因的氨基酸序列相似性为 98%；与
梅树 CBF 相似性为 67%；进一步构建了植物表达载体，为利用 CBF 基因提高植物抗逆性奠定基础。
关键词 山荆子；CBF 转录因子；克隆；序列分析；表达载体
中图分类号 Q789 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）22-0139-03
Cloning，Sequence Analysis and Plant Expression Vector Construction of CBF Transcription Factor from Malus baccata
LIU Xiao-dan XU Ya-wei YE Fei YU Xiao-ming
（College of Bio-engineering，University of Agriculture S&T of Jilin，Jilin Jilin 132101）
Abstract The CBF transcription factors were cloned by RT-PCR technique from the plants of Malus baccata.The full-length of open reading
frame （ORF） was 756 bp，encoding 252 amino acids；The amino acids sequence owned the characteristics of CBF protein ，which contained an
AP2/EREB DNA binding domain and two special short amino acids sequences；The amino acids sequences of MbCBF had highly homologous with CBF
genes of other plants included in Genebank，reached 98% with Malus domestica，and 67% with Prunus mume respectively；Then we connected the gene
into the plant expression vector PBI121，which laid the foundation for the utilization of CBF genes to improve plant stress tolerance.
Key words Malus baccata；CBF transcription factor；clone；sequence analysis；plant expression vector
低温在很大程度上限制了植物生长、发育及其地理分
布，例如许多重要作物和水果（水稻、玉米、番茄、香蕉等），
在低温非冰冻条件下（0~12 ℃）就会受到损害，产量下降，严
重的甚至绝收 [1]。如何有效提高植物抗寒性成为目前亟待解
决的问题。CBF（C-repeat binding factor）转录因子的发现为
基因工程改良植物抗逆性提供了一种全新的途径。CBF 基
因是一类对植物多个抗逆基因表达起调控作用的植物特有
的转录因子，能识别并结合逆境胁迫应答相关基因启动子
区域的 CTR/DRE（C-repeat dehydration-responsive element）
顺式作用元件，启动下游抗逆基因的表达，从而增强植物的
抗逆性 [2]。CBF 基因的表达水平在植物抗寒性差异中起着至
关重要的作用。
该文以抗寒性较强的山荆子（Malus baccata）为试验材
料，从该植物中分离并克隆 CBF同源基因，对其进行序列分
析，并进一步构建了植物表达载体。一方面，为在分子水平
上深入理解植物的抗寒机制奠定基础，另一方面，为人们
通过基因工程手段进行植物抗寒育种研究提供了新的候选
基因。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用山荆子新鲜材料采自吉林农业科技学院院内；
大肠杆菌菌株 DH5α 和植物表达载体 pBI121 由吉林农业
科技学院生物工程学院生物专业实验室保存与提供；克隆
载体 pMD-18 vector 购自大连宝生物公司；限制性内切酶、
Taq 酶及其他工具酶、DNA Maker DL2000 为大连宝生物产
品 ；T4DNA 连接酶和 TRizol Reagent 购自 Invitrogen 公司 ；
DNA 凝胶回收纯化试剂盒、DNA 纯化试剂盒、DEPC 等为上
海生工产品。
1.2 试验方法
1.2.1 山荆子 CBF 转录因子（MbCBF）的克隆。取 4 ℃低温
胁迫处理 2 h 的幼嫩顶芽 ，采用 TRizol 法提取山荆子总
RNA。根据 GenBnak 已发表的山荆子 CBF 基因（EF582842）
序列设计特异性引物，MbF：GGATCCGCAGCAGAACAGATGA；
MbR：GAGCTCGGGGATGATGAATAGAC 分别含限制性内切
酶 BamH I和 Sac I的酶切位点，以 M-MLV 反转录试剂盒反
转录产物 cDNA为模板，进行 RT-PCR 扩增 CBF 基因全长，
PCR 反应条件为：94 ℃预变性 8 min，然后 94 ℃ 30sec，56 ℃
30sec，72 ℃ 60sec，30 个循环，72 ℃后延伸 8 min。反应结束
后，取 6 μL 产物进行浓度为 1%琼脂糖凝胶电泳检测。从琼
脂糖凝胶中回收目的片段的 PCR 产物连 pMD-18 vector，转
化 DH5α 大肠杆菌感受态细胞。过夜培养，挑取单菌落进行
培养，然后 BamH I 和 Sac I 双酶切验证重组子，阳性重组子
送上海生工进行测序。
1.2.2 山荆子 CBF 转录因子序列分析 。使用 NCBI 上的
BLAST、ORF Finder 服务器对克隆出的 CBF 转录因子进行
核酸、氨基酸同源序列搜索及保守域、开放阅读框（ORF）预
测，利用 ExPASy 提供的 ProtParam 软件预测 MbCBF 蛋白的
分子量、等电点。并采用 DNAMAN 和 MEGA 软件对其进行
氨基酸序列比对和系统进化分析。
1.2.3 植物表达载体 pBI121-MbCBF 的构建。使用 BamH I
和 Sac I 同时对含有目的基因的重组克隆质粒和表达载体
pBI121进行双酶切，回收酶切产物使用 T4DNA 连接酶进行
过夜连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 ，进行菌液
PCR验证后，进一步双酶切验证。
2 结果与分析
2.1 山荆子 CBF转录因子（MbCBF）的克隆
使用所设计的特异性引物对山荆子 cDNA 进行 RT-
PCR 扩增，得到了约 800 bp 的产物（图 1）。胶回收后，连 T
基金项目 吉林农业科技学院青年教师科研基金资助项目（2012126）。
作者简介 刘晓丹（1981-），女，吉林吉林人，讲师，从事基因工程教学
与研究工作。
收稿日期 2013-10-14
林业科学现代农业科技 2013年第 22 期
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林业科学 现代农业科技 2013年第 22期
1 2 3 M
图 1 MbCBF 基因 RT-PCR产物电泳图
注：M：Marker DL2000；1-3：RT-PCR 产物。
载体进行转化感受态细胞，筛选阳性克隆，对重组克隆载体
pMD-MbCBF 进一步进行双酶切（BamH I 和 Sac I）验证（图
2），酶切出的目的条带长度与 PCR 结果相吻合，初步判定已
经将 MbCBF 亚克隆到 T 载体上。送上海生工公司测序，测
得长为 861 bp 的目的片段。
2.2 山荆子 CBF转录因子序列分析
对 RT-PCR 测序结果进行比对分析， 该片段包含完整
的 ORF 区域，长含有 756 bp，编码 252 个氨基酸，等电点 pI
为 5.01，预测分子量为 27.79KD。Blastp比对结果（图 3）表明，
克隆片段的氨基酸酸序列与已登录的 CBF/DREB 基因的氨
基酸序列具有较高相似性，其中与同为蔷薇科苹果属的苹果
（Malus domestica）相似性最高，为 98%，与梅树（Prunus mume）
的相似性为 67％，与矮扁桃（Prunus tenella）、桃（Prunus persica）
的相似性分别为 65％和 64％。进一步分析表明 MbCBF 转
录因子属于 AP2 家族，具有保守的 AP2/EREB DNA 结合结
构域，同时在 AP2 结构域两边各含有一段 CBF 家族蛋白特
征短多肽序列 ，即 PKK/RPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR（图
3），符合 CBF 家族蛋白的特征 [3]。序列分析和相似性分析证
明所克隆的片段为山荆子 CBF 转录因子。
利用 MEGA4.1 软件对包括山荆子 CBF 转录因子
（MbCBF）在内的 11个物种 CBF蛋白氨基酸序列构建了系统
进化树（图 4），山荆子 CBF 转录因子 MbCBF 与苹果（Malus
domestica）和月季（Rosa hybrid cultivar）属于同一小分支中，
又与桃属和杏属的梅聚为蔷薇科的一大分支。分析结果表
明，MbCBF 的进化基本和植物分类学的进化规律一致，并具
有明显的种属特征；同时，进化图也在一定程度上解释了山
荆子 CBF 转录因子与其他物种的亲缘关系。
2.3 植物表达载体 pBI121-MbCBF 的构建
根据 pBI121 载体及 PCR 产物均具有 BamH I 和 Sac I 2
种酶的酶切位点的特点。用 BamH I 和 Sac I 进行双酶切。从
酶切电泳检测的结果（图 5）来看，酶切出一条约 800 bp 小
注：方框内分别为 CBF 家族蛋白特征序列‘PKK/RPAGRxKFxETRHP’
和‘DSAWR’；下划线部分的序列为 AP2/EREB DNA 结合结构域 ；
不同植物来源 CBF 转录因子蛋白登录号 ：Malus domestica（AGL
07696.1），Prunuspersica（AGL07693.1），Prunustenella（HQ908653.1），
Prunus mume（ADF43033.1）。
图 3 山荆子 CBF转录因子推导的氨基酸序列比对分析
Malus domeatica（AGL07696.1）
Malus baccata
Oryza sativa（AAG59619.1）
Rosa hybrid cultivar（ACI42859）
Prunus avium（BAC20184）
Prunus mira（AFUS4606.1）
Prunus tenellav（HQ908653.1）
Prunus mume（ADF43033.1）
Prunus persica（AGL07693.1）
Theobroma cacao（EOY24622）
Ricinus communis（XP002509702）
100
100
100
93
99
注：节点上的数值表示 Bootstrap 验证中基于 1 000次重复该节点可信
度的百分比；桃（Prunus persica），矮扁桃（Prunus tenella），光核桃
（Prunus mira），梅（Prunus mume），山桃（Prunus davidiana），甜樱桃
（Prunus avium），月季（Rosa hybrid cultivar），苹果（Malus domestica），
蓖麻（Ricinus communis），水稻（Oryza sativa）。
图 4 山荆子 CBF转录因子推导的氨基酸序列与其他物种
系统进化树
M 1 2
图 2 pMD-MbCBF 重组克隆载体酶切验证
注：M：Marker DL2000；1：pMD-MbCBF 重组克隆载体；
2：重组克隆载体双酶切验证。
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片段，与 MbCBF 基因长度一致，证明重组质粒中含有正确
的目的基因并且具有正确的读码框和向位，可用于后续的
植物遗传转化和抗寒性研究。
3 讨论
自 Stockinger et al[4]（1997）首次从拟南芥 cDNA 文库中
克隆 AtCBF1 以来，CBF/DREB 转录因子基因的克隆得到了
较大的发展，已经陆续从各种植物中克隆出 CBF/DREB 基
因如盐角草 SbDREB2A，毛白杨 PtCBF5，梅 PmCBF1 等 [5-7]，
这些基因不同程度的响应非生物逆境胁迫而表达；已克隆
且在低温诱导下表达 CBF 基因的植物有以下几种如拟南
芥、水稻、大豆、小麦、海棠、桦木、杨树、桉树、葡萄、甜樱桃、
越橘等[8]。
该研究中克隆获得山荆子 CBF基因（MbCBF）的全长序
列，MbCBF 编码的氨基酸序列含有高度保守的 AP2/EREB
结构域，该结构域中含有 60 个氨基酸，这与 Dubouzet et al[9]
和 Yamaguchi et al[10]所得到拟南芥与水稻 CBF 的特点一致。
与其他 CBF 转录因子类似，MbCBF 具备反式作用因子的典
型特征：即它的 N 末端有一段核定位信号，信号序列“PKK/
RPAGRxKFxETRHP”，C 末端有一段酸性活化区域 [11]，属于
A-1 类转录因子。值得注意的是，MbCBF 的 AP2/EREB 结构
域以外的氨基酸序列与其他植物来源 CBF氨基酸序列同源
性较差，这与前人的研究结果相同 [10]。
植物对低温、干旱和高盐等逆境胁迫的耐性受多个基
因控制，因此抗逆性的强弱往往不受单基因控制，往往和多
个因素有关。而激活一系列依赖 DRE/CRT 顺式作用元件，
在信号传导和诱导下游多个抗逆功能基因表达中起到关键
作用。研究者们通过转基因手段获得到了许多抗性增强的
转 CBF 基因植株。过量表达棉花 GmDREB1，GmDREB2 和
GmDREB3 可以增强转基因拟南芥植株的抗旱、抗低温和抗
高盐性 [12-14]，在水稻中过量表达 AtDREB1A[15]和在烟草中过
量表达 AhDREB1、GhDREB1[16-17]均能增强植物抗逆性。该研
究在克隆了 MbCBF 的基础上，成功构建了植物表达载体，
对于进一步探讨植物的抗逆机制及利用该机制进行抗逆新
品种的培育有重要意义 [18-22]。
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M 1 2
注：M：Marker DL2000；1：重组克隆载体双酶切验证；
2：pBI-MbCBF 重组克隆载体
图 5 重组表达载体 pBI-MbCBF 酶切验证
刘晓丹等：山荆子 CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建
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