全 文 ：山 东 农 业 科 学 2013，45(9):9 ～ 11 Shandong Agricultural Sciences
收稿日期:2013 －04 －26
基金项目:河南省科技攻关项目(090080021023)
作者简介:郜旭芳(1982 －) ，女，讲师，硕士，主要从事林业技术科研和教学工作。E － mail:xufang601@ 163. com
欧李 SＲAP反应体系的建立与优化
郜旭芳，时军霞
(河南林业职业学院，河南 洛阳 471002)
摘 要:采用正交试验设计，对影响欧李 SＲAP反应体系的 5 个因素(模板 DNA、Mg2 +、dNTPs、引物和 Taq
DNA聚合酶)、4 个水平进行优化。结果表明，适合欧李的 SＲAP反应体系为:2. 50 mmol /L Mg2 +，0. 25 mmol /L
dNTPs，0. 60 μmol /L引物，Taq DNA聚合酶 0. 50 U，1. 00 ng /μl 模板 DNA，总体积为 20 μl。优化体系的建立
为今后利用 SＲAP标记技术对欧李进行种质遗传多样性评价、指纹图谱构建、基因组分析、分子标记辅助育种
和遗传改良等研究奠定了基础。
关键词:欧李;SＲAP;正交设计;优化
中图分类号:S662． 502． 3 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2013)09 －0009 －03
Construction and Optimization of SＲAP Ｒeaction System
for Cerasus humilis
Gao Xufang，Shi Junxia
(Henan Forestry Vocational College，Luoyang 471002，China)
Abstract Using orthogonal test，5 influencing factors (template DNA，Mg2 +，dNTPs，primers and Taq
DNA polymerase)with 4 levels of SＲAP reaction system for Cerasus humilis were optimized． The results
showed that the optimum SＲAP reaction system was 2． 50 mmol /L Mg2 +，0． 25 mmol /L dNTPs，0． 60 μmol /L
primers，0． 50 U Taq DNA polymerase and 1． 00 ng /μl template DNA with total volume of 20 μl． The con-
struction of optimum system laid the foundation for using SＲAP technique in genetic diversity evaluation，fin-
gerprint construction，genome analysis，molecular marker － assisted breeding and genetic improvement of
Cerasus humilis in the future．
Key words Cerasus humilis;SＲAP;Orthogonal design;Optimization
欧李［Cerasus humilis (Bge. )Sok.］因其含钙
量很高，又称钙果，为蔷薇科(Ｒosaceae)樱桃属
(Cerasus)多年生落叶小灌木。欧李种质资源丰
富，主要分布在我国东北、华北、西北干旱地区，是
我国所特有的世界上最矮小的木本果树［1］。分
子标记技术的快速发展为在 DNA 水平上评估欧
李种质的遗传多样性提供了更准确、更高效的方
法［2］。但由于欧李资源分布较为广泛，并有部分
野生种的存在［3，4］，给其种群关系划分带来了困
难，影响了资源的开发与利用。SＲAP 技术自诞
生以来，已被国内外学者广泛应用于植物遗传资
源分析、遗传连锁图谱的构建、品种鉴定等研究领
域［5，6］，但迄今尚未见在欧李上应用的报道。为
此，笔者应用正交设计法，对影响 PCＲ 扩增的模
板 DNA、Mg2 +、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度
等因素进行优化，并检测该优化体系的适用性，以
期应用于欧李品种的分子鉴定、分子进化、系统发
育和遗传关系分析等研究。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为怀柔汤河口采摘的野生欧李幼嫩
叶片，液氮处理后，保存于 － 20℃冰箱备用。
1. 2 试验方法
DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2013.09.033
1. 2. 1 基因组 DNA提取 采用改良的 CTAB 方
法提取 DNA［7］，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA的质量。 － 20℃保存备用。
1. 2. 2 正交设计 采用 L16(4
5)正交试验设计，
对 SＲAP反应体系中的模板 DNA、Mg2 +、dNTPs、
引物、Taq DNA聚合酶浓度进行正交组合方案筛
选(表 1、表 2)。SＲAP引物由英骏生物技术有限
公司合成，所用引物为:正向引物 me2:5 －
TGAGTCCAAACCGGAGC － 3，反向引物 em1:
5 － GACTGCGTACGAATTAAT －3［8］。
表 1 欧李 SＲAP反应体系优化的因素与水平
水平
因素
模板 DNA
(ng /μl)
Mg2 +
(mmol /L)
dNTPs
(mmol /L)
引物
(μmol /L)
Taq聚合酶
(U)
1 1. 00 1. 50 0. 25 0. 40 0. 50
2 1. 50 2. 00 0. 30 0. 50 1. 00
3 2. 00 2. 50 0. 35 0. 60 1. 50
4 2. 50 3. 00 0. 40 0. 70 2. 00
表 2 欧李 SＲAP － PCＲ反应
因素水平 L16(4
5)正交试验设计
编号
因素
模板 DNA
(ng /μl)
Mg2 +
(mmol /L)
dNTPs
(mmol /L)
引物
(μmol /L)
Taq聚合酶
(U)
1 1. 00 1. 50 0. 25 0. 40 0. 50
2 1. 00 2. 00 0. 30 0. 50 1. 00
3 1. 00 2. 50 0. 35 0. 60 1. 50
4 1. 00 3. 00 0. 40 0. 70 2. 00
5 1. 50 1. 50 0. 30 0. 60 2. 00
6 1. 50 2. 00 0. 25 0. 70 1. 50
7 1. 50 2. 50 0. 40 0. 40 1. 00
8 1. 50 3. 00 0. 35 0. 50 0. 50
9 2. 00 1. 50 0. 35 0. 70 1. 00
10 2. 00 2. 00 0. 40 0. 60 0. 50
11 2. 00 2. 50 0. 25 0. 50 2. 00
12 2. 00 3. 00 0. 30 0. 40 1. 50
13 2. 50 1. 50 0. 40 0. 60 1. 50
14 2. 50 2. 00 0. 35 0. 40 2. 00
15 2. 50 2. 50 0. 30 0. 70 0. 50
16 2. 50 3. 00 0. 25 0. 50 1. 00
1. 2. 3 PCＲ 扩增 反应体系为 20 μl，扩增程序
为:94℃预变性 5 min;94℃变性 1 min，35℃复性
1 min，72℃延伸 1 min，5 个循环;94℃变性 1 min，
50℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，35 个循环;72℃
延伸 5 min。PCＲ 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳分
离，经溴化乙锭(EB)染色后于凝胶成像系统采集
图像。
1. 2. 4 反应体系稳定性检测 选用筛选出的引
物对不同的野生欧李材料进行 SＲAP 扩增，检测
优化体系的稳定性。
2 结果与分析
2. 1 欧李 SＲAP正交反应体系优化
正交试验设计 SＲAP － PCＲ 反应体系选取
me2 /em1 为引物，以野生欧李基因组 DNA为模板
进行扩增，结果见图 1。
M:DL 2000;1 ～ 16:表 2 处编号
图 1 SＲAP － PCＲ正交试验设计 L16(4
5)电泳结果
模板 DNA含量是保证扩增的前提，样本量过
多会增加非特异性扩增，太少时无扩增条带［9］。
由图 1 可知，模板 DNA含量在 1. 00 ng /μl时效果
最好。Taq酶对扩增结果有明显的影响，低浓度
Taq酶会降低 PCＲ 扩增效率，较弱的条带可能会
消失，对试验结果真实性、可靠性会产生很大影
响;浓度过高时扩增产物容易重叠或产生较多的
非特异性扩增条带［10］。由扩增结果(图 1)可以
看出，Taq酶用量为 0. 50 U 时最佳。原则上以最
低浓度引物产生的结果为好，本试验引物的浓度
在 0. 60 μmol /L 时为最佳水平［11］。dNTPs 浓度
高时，会显著增加错误渗入率，且能与 Mg2 +结合，
降低游离 Mg2 + 的浓度。本试验 dNTPs 浓度为
0. 25 mmol /L时较适宜。Mg2 +是 Taq 聚合酶的激
活剂，可以与引物、模板 DNA及 dNTPs相结合，进
而影响引物与模板结合效率和产物特异性［12］。
经分析，最终确定 2. 50 mmol /L 为 Mg2 + 最佳浓
度。综上，最优反应体系为:Mg2 + 2. 50 mmol /L，
dNTPs 0. 25 mmol /L，引物 0. 60 μmol /L，Taq DNA
聚合酶 0. 50 U，模板 DNA 1. 00 ng /μl，总体积为
20 μl。
2. 2 优化体系验证
选用筛选出的引物组合 me2 /em1 和优化的
反应体系对不同欧李野生植物材料进行扩增。由
图 2 可知，扩增出的条带清晰、多态性强、稳定性
好，说明该正交体系适宜欧李 SＲAP － PCＲ扩增。
01 山 东 农 业 科 学 第 45 卷
1 ～ 11:不同野生欧李样品
图 2 11 种野生欧李 SＲAP优化体系扩增结果
3 讨论
SＲAP作为一种新型的分子标记，具有操作
简单、稳定、高效等特点，适用于遗传图谱构建、基
因定位、基因克隆等遗传操作，目前，已在小麦、水
稻、牡丹、西瓜、苹果、棉花、柑橘、樱桃、葡萄、柿等
植物中应用［13 ～ 15］。SＲAP － PCＲ扩增一般需要参
考 Li 和 Quiros 的固定程序［16］，但其扩增结果受
到反应条件、扩增程序及不同物种的影响［17］，所
以，SＲAP在不同的物种上应用需要进行反应体
系的优化。目前，在欧李分子标记的研究中尚未
见 SＲAP应用的报道，因此，探索适合该物种的最
佳 SＲAP － PCＲ反应体系至关重要。
试验结果表明，欧李 SＲAP － PCＲ扩增的最佳
反应体系为 2. 50 mmol /L Mg2 +，0. 25 mmol /L
dNTPs，0. 60 μmol /L 引物，Taq DNA 聚合酶 0. 50
U，1. 00 ng /μl模板 DNA，总体积为 20 μl。本试
验优化的 SＲAP － PCＲ 反应体系稳定可靠、扩增
结果多态性好，不仅适用于欧李基因组 DNA 的
SＲAP － PCＲ扩增，也为 SＲAP 技术在欧李种质资
源鉴定和遗传多样性分析等方面的研究奠定了基
础。
参 考 文 献:
［1］ 张 红 . 中国矮生樱组遗传多样性研究及欧李优系 S基因
型鉴定［D］. 泰安:山东农业大学，2008.
［2］ 关录凡，王 鑫，王秋玉 . 利用 ISSＲ分子标记检测欧李不
同品种间的差异［J］. 森林工程，2009，25(3) :17 － 22.
［3］ 刘 明，杜俊杰 . 欧李种质资源的分布与品种性状表现
［J］. 落叶果树，2010，3:18 － 20.
［4］ 王有信，何卫军，李向东，等 . 欧李种质资源分布及种群
分类特性研究［J］. 山西果树，2005，6:35 － 38.
［5］ 张 飞，王炜勇，张 智，等 . 光萼荷属植物 SＲAP － PCＲ
反应体系建立与引物筛选［J］. 中国农学通报，2012，28
(10) :173 － 178.
［6］ Xue D W，Feng S G，Zhao H Y，et al. The linkage maps of
Dendrobium species based on ＲAPD and SＲAP mankers［J］.
Journal of Genetics and Genomics，2010，37(3) :197 － 204.
［7］ 高 峻，蔡 新，许明辉 . 云南茶树 DNA提取和 ＲAPD分
子标记初探［J］. 云南农业大学学报，2000，15(2) :126 －
127.
［8］ 李仁伟 . 大菊品种遗传多样性及基于 SＲAP标记的分类研
究［D］. 北京:北京林业大学，2011.
［9］ 邹小云，邹晓芬，陈伦林，等 . 花生 SＲAP － PCＲ反应体系
的正交设计优化［J］. 分子植物育种，2010，8(4) :822 －
826.
［10］ 郭凌飞，邹明宏，杜丽清，等 . 均匀设计优化澳洲坚果
SＲAP反应体系［J］. 果树学报，2008，25(2) :250 － 253.
［11］ 杨 琦，张鲁刚 . 大白菜 SＲAP 反应体系的建立与优化
［J］. 西北农业学报，2007，16(3) :119 － 123.
［12］ 任海霞，宫志远，李 瑾，等 . 平菇 ＲAPD － PCＲ 反应体
系优化研究［J］. 山东农业科学，2009，3:43 － 46.
［13］ Guo D L，Luo Z Ｒ. Genetic relationships of some PCNA per-
simmons(Diospyros kaki Thunb. )from China and Japan re-
vealed by SＲAP analysis［J］. Genet. Ｒes. Crop Evol. ，2006，
53(8) :1597 － 1603.
［14］ 柳李旺，龚义侵，黄 浩，等 . 新型分子标记———SＲAP与
TＲAP及其应用［J］. 遗传，2004，26(5) :777 － 781.
［15］ 王振国，张海英，于广建，等 . 黄瓜 SＲAP 反应体系的正
交设计优化［J］. 华北农学报，2007，22(4) :112 － 115.
［16］ 蔡元保，杨祥燕，黄明忠，等 . 莲雾 SＲAP 反应体系的优
化及其应用［J］. 中国农学通报，2011，27(22) :214 － 218.
［17］ 霍雨猛，缪 军，杨妍妍，等 . 洋葱 SＲAP － PCＲ体系的优
化研究［J］. 山东农业科学，2011，4:9 － 11.
11第 9 期 郜旭芳等:欧李 SＲAP反应体系的建立与优化