全 文 ：榨菜低盐腌制过程的微生物群落结构与动态分析
张 锐 吴祖芳 * 沈锡权 雷兰兰
（宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室， 生命科学与生物工程学院 宁波 315211）
摘要 采用平板菌落计数法及 PCR-SSCP（单链构象多态性）方法，分析低盐榨菜腌制过程中微生物群落结构及
数量的变化情况；对通过 SSCP 方法得到的图谱中 11 条优势条带序列进行比对，结果表明，在榨菜腌制发酵初
期，肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）为主要的优势菌群；随着腌制环境条件的变化，出现植物乳杆菌
（Lactobacillus plantarum）和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）；在腌制保存后期起主导作用的微生物为植物乳杆
菌（Lactobacillus plantarum）和 Lactobacillus versmoldensis；榨菜腌制保藏过程中 pH 值始终呈下降趋势，乳酸菌
数量经历了一个先急速上升后逐渐趋缓，并稳定在一定数量的过程。 对优化条件下制得的不同阶段的高品质低
盐腌制榨菜样品进行微生物结构及分布分析，证实了不同乳酸菌的作用。
关键词 低盐榨菜； SSCP； 群落多样性； 乳酸菌； pH
文章编号 1009-7848（2011）03-0175-06
榨菜是我国主要的腌制加工蔬菜， 属世界三
大酱腌菜之一。其传统的生产工艺中用盐量高，抑
制了具有保持蔬菜贮藏特性和高品质的乳酸菌活
性，对制品的风味、营养、安全性等品质的形成有
诸多不利 [1-2]，同时生产过程中产生的高盐废水会
造成环境的污染。然而在低盐条件下腌制，可以改
善榨菜制品的营养价值、安全性和品质[2-3]，这符合
当今世界蔬菜腌制向营养、天然、绿色方向发展的
潮流。蔬菜在低盐条件下的腌制过程，实质上是各
种微生物的作用过程， 在适合的条件下优良微生
物对保持制品的营养品质、 口感及质量安全等方
面具有十分重要的作用[3-4]。 因此了解蔬菜在自然
腌制过程中微生物群落结构及变化规律显得尤为
重要。 当前自然发酵蔬菜微生物群落变化的研究
重点是优势菌种的分离、鉴定、发酵条件和辅料的
作用[2-5]。
对榨菜腌制过程中微生物区系的研究大多采
用传统微生物培养的方法， 这种方法的缺点是需
要进行一系列繁杂的形态特征和生理生化实验。
田丰伟[5]采用传统的微生物分离培养方法，分析了
蔬菜自然发酵过程中微生物菌系的消长变化，得
到不同蔬菜、不同泡制时期的菌相组成及比例。随
着人们对微生物在分子水平的认识的不断深入，
食品微生物的分子生物学研究进入一个新阶段；
燕平梅等[6] 采用传统的分离培养和非培养的 16S
rRNA基因同源性相结合，分析发酵白菜卤中乳酸
菌的多样性，结果表明，非培养样品的乳酸菌多样
性较培养样品丰富； 而基于 16S rRNA 作为分子
标记的变性梯度凝胶电泳（DGGE）的方法，可以分
析蔬菜腌制过程中微生物群落结构， 从而获得更
全面的微生物多样性信息[7-9]。近年来，作为不依赖
于培养的基因指纹技术， 单链构象多态性（SSCP）
技术被广泛应用于调查自然生态系统和生物反应
器中的微生物多样性和群落演替分析[10-12]。同其他
分子生物学技术相比，它具有使用设备简单，只需
普通引物，后续杂交不需变性处理等优点。
本文拟通过 16S rRNA 的 PCR-SSCP 序列比
较分析与传统微生物培养验证相结合的方法，考
察低盐榨菜腌制过程中的微生物群落结构及其变
化， 了解优势微生物的组成及变化对低盐榨菜腌
制过程质量和品质维持的影响， 并为进一步研究
不同菌属在蔬菜腌制中的作用提供实验基础。
收稿日期： 2010-06-26
基金项目： 国家自然科学基金项目（31071582）；浙江省自
然科学基金项目 （Y3080231）；浙江省钱江人
才计划项目（2009R10033）
作者简介： 张锐，女，1986 年出生，硕士生
通讯作者： 吴祖芳
Vol． 11 No． 3
Jun． 2 0 1 1Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 11 卷 第 3 期
2 0 1 1 年 6 月
DOI:10.16429/j.1009-7848.2011.03.033
中 国 食 品 学 报 2011 年第 3 期
1 材料与方法
1.1 试验材料
低盐腌制榨菜汁液，参照文献[13]方法制备。
主要试剂： 聚丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯
酰胺、过硫酸胺、TEMED、甘油、Tris-碱、硼酸、二
甲苯菁、溴酚蓝、去离子甲酰胺、EDTA、乙酸、硝酸
银、氢氧化钠、甲醛、pMD-18-T载体、Ex-Taq聚合
酶、脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、琼脂糖等。
培养基：MRS固体培养基、LB 培养基、选择性
LB培养基（加 Amp+）。
1.2 主要仪器
pH 计、梯度 PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、
灭菌锅、智能生化培养箱、超净工作台、恒温水浴
锅、电泳槽、水平摇床、离心机、旋涡混合仪等。
1.3 实验方法
1.3.1 样品总 DNA 的提取 在优化的低盐条件
下腌制榨菜[13]，30 d左右基本成熟。 在腌制过程的
第 2 天、第 5 天、第 15 天、第 35 天分别取盐水样
品约 200 mL，记为样品 1～4。将盐水样品用无菌纱
布过滤，10 000 g 离心 5 min，去上清，沉淀用改进
的 SDS高盐提取法[14]提取总 DNA。
1.3.2 引物选择与 PCR 扩增 PCR 扩增采用引
物为 f 341 （5’-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）
和 r 533（5-TTACCGCGGCTGCTGGCA-3’），反向
引物 r 533 的 5’端采用磷酸标记，由上海英骏生
物技术有限公司合成并标记。 PCR 反应体系为：
10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP （2.5 mmol/L）2 μL，
正向引物（10 μmol/L）1.0 μL，反向引物（10 μmol/
L）1.0 μL，DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，MgCl2（25
mmol/L）2.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，用超纯水补足
反应总体积至 25 μL。 PCR扩增反应条件为 94℃
预变性 5 min，30 个循环 （94 ℃变性 40 s，50 ℃退
火 30s，72℃延伸 35 s），72℃最终延伸 10 min。 扩
增完毕后，取 5 μL 于 1%琼脂糖凝胶上电泳，剩余
PCR产物采用纯化试剂盒（上海生工生物公司）切
胶纯化。
1.3.3 PCR 产物的 λ 核酸外切酶处理 λ 核酸外
切酶能够专一地降解双链 DNA 中 5’磷酸标记的
链，从而使非标记的单链释放出来[15]。 60 μL 反应
体系中包括 λ 核酸外切酶 （5 U/μL， 美国 New
England Biolabs 公司）4 μL，10×buffer 6 μL，PCR
产物 50 μL。 37℃温浴 4 h，处理完毕后，72℃ 10
min灭活 λ核酸外切酶。
1.3.4 凝胶制备及 SSCP 图谱的获得 λ 核酸外
切酶处理过的样品 4 μL 与等量上样缓冲液（体积
分数 95%的去离子甲酰胺，10 mmol/L NaOH，20
mmol/L EDTA， 0.02%溴酚蓝和 0.02%二甲苯氰
FF）[16]混合均匀，98 ℃变性 10 min，迅速插入冰中
5 min， 样品全部点到 20%的聚丙烯酰胺凝胶中，
电泳。 电泳在室温下进行， 开始于 250 V 预电泳
30 min，点样后于 250 V电泳 18 h。电泳结束后，剥
胶染色[9]。
1.3.5 条带分离、 克隆及测序 特异条带采用上
海生工生物公司提供的 PAGE 凝胶 DNA 回收试
剂盒 （EZ Spin Column PAGE Gel DNA Extrac-
tion Kit）进行回收。 取 1μL 回收的 DNA 为模板，
以 f 341 和 r 533 为引物，采用同前体系和 PCR 程
序进行扩增；取 PCR 产物进行琼脂糖电泳，非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证后，对 PCR 产物切胶
纯化（纯化试剂盒，上海生工生物公司），按产品说
明书克隆进 T-载体[pMD-18-T，宝生物（大连）有
限公司]。对转化子的筛选采用蓝白斑及 PCR的方
法。 PCR 时以白斑菌落为模板，采用能与 T-载体
插入点两侧特异结合的 M13 通用引物进行检测。
每条带选取 2～3 个克隆，同样以 M13 通用引物进
行测序，测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
通过 Blast软件，将测序获得的序列与 GenBank 进
行比对。
1.3.6 微生物数量及 pH 值的测定 采用稀释平
板计数法测定各时期乳酸菌数目。 pH 测定采用
pH计。
2 结果与分析
2.1 SSCP图谱分析
4 个不同样品得到的 SSCP 电泳图谱见图 1，
从其中可以看出样品中微生物的种类和组成。 比
较这 4 个样品的条带，结果表明，不同时期盐水样
品 SSCP图谱存在一定的差异，同时也会出现一些
明显的共有条带。 图 1 中标记的条带所代表的微
生物是榨菜发酵过程中的一些优势菌种。 条带
B1、C1、D1在发酵的第 5天出现，至发酵成熟一直
存在； 条带 A1、B2、C2以及条带 A3、B4自发酵开
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第 11 卷 第 3 期
始就有，随着发酵过程的进行，其亮度逐渐减弱；
而条带 C4、D4以及条带 D2在发酵后期才出现。
2.2 条带分离、克隆及测序结果
回收图 1 中标记的条带 A1、A3、B1、B2、B4、
C1、C2、C4、D1、D2、D4。纯化的 PCR产物与载体连
接并转化后，每个条带得到大量的白斑菌落。以白
斑菌落为模板， 采用 PCR 法筛选阳性克隆。 取 2
个以上的阳性克隆用于测序分析。 测序结果提交
NCBI基因库，所得结果列于表 1。
SSCP 中的每条条带均对应于一个或几个不
同的操作分类单元 （operational taxonomic units，
OTUs）[10，17]。 分析图 1 与表 1 可以看出，榨菜腌制
过程中细菌群落大致包含以下几个 OTU： 条带
B1、C1、D1 与植物乳杆菌/短乳杆菌相似性较高，
条带 A1、B2、C2与肠膜明串珠菌/肠膜明串珠菌肠
膜亚种相似性较高 ， 条带 D2 与 Lactobacillus
versmoldensis 相似性最高， 条带 A3、B4 与弧菌属
相似性较高，条带 C4、D4 与毕赤酵母属/伊萨酵母
属相似性较高。
2.3 榨菜低盐腌制过程的微生物数量及 pH 变化
分析
为考察腌制不同阶段的乳酸菌数量及酸度变
化， 通过平板培养法测定乳酸菌数量及相应 pH
值。 从图 2 可以看出，随着发酵过程的进行，乳酸
菌数量及 pH 值也发生变化， 乳酸菌数量经历了
一个先急速增加到逐渐趋缓， 最后稳定在一定数
量的过程。 腌制第 10 天左右，乳酸菌的数量达到
最大值。 腌制初期 pH值呈下降趋势，其中腌制前
7 d pH 值下降较快，由 6.0 下降到 4.5；随后 10 d
pH 值保持在 4.5 左右； 至第 21 天 pH 值下降到
3.7 并维持这一水平 30 d。 30 d 左右，腌制发酵成
熟，此时榨菜口感嫩脆，酸度适口。
注： 泳道 1～4： 以样品 1～4 为模板的 PCR 扩增产物
经 λ-核酸外切酶处理后的样品。
图 1 榨菜腌制 4 个时期的微生物群落 SSCP 图谱
Fig.1 SSCP pattern of microbial community in
mustard tube at four periods of pickle
A12
A13
A31
弧菌属（Vibrio sp.） 95 GU371712A32
A33
B1
B11 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） 100 AB494721
B12 短乳杆菌（Lactobacillus brevis） 99 AB494718
A3
A1
A11 肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）；
肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides strain）
100
AB494730
GU470991
条带序号 最相近菌种（属） 相似性/% GenBank 登陆号
表 1 榨菜腌制液样品的细菌 SSCP 分析所得条带的相似性
Table 1 Identity of bands obtained from mustard tuber leaching liquid by SSCP analysis method
榨菜低盐腌制过程的微生物群落结构与动态分析 177
中 国 食 品 学 报 2011 年第 3 期
B22
B23
B4
B41
弧菌属 95 GU371712B42
B43
C1
C11
植物乳杆菌 100 AB494721
C12
C2
C21
肠膜明串珠菌/肠膜明串珠菌肠膜亚种 100
AB494730
GU470991
C22
C23
C4
C41 毕赤酵母属（Pichia sp.）
伊萨酵母属（Issatchenkia sp.）
100
AB536782
EF550384C42
D1
D11
植物乳杆菌
99
100
97
AB494721D12
D13
D2
D21
Lactobacillus versmoldensis 100 NR_028990
D22
D4
D41
毕赤酵母属伊萨酵母属 100
AB536782
EF550384D42
B2
B21
肠膜明串珠菌/肠膜明串珠菌肠膜亚种 100
AB494730
GU470991
条带序号 最相近菌种（属） 相似性/% GenBank 登陆号
（续表 1）
7
6
5
4
3
pH
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
时间/d 时间/d
乳
酸
菌
数
量
/1
05
个
·
m
L-
1 350
300
250
200
150
100
50
0
图 2 榨菜加工过程中 pH 值和乳酸菌数量的变化
Fig.2 The change of pH and total amounts of lactic acid bacteria during the processing of mustard tuber
2.4 微生物群落结构的功能性分析
由不同腌制时期样液的 SSCP 图谱 （图 1）可
知，肠膜明串珠菌（条带 A1）和弧菌属（条带 A3）
在发酵初期占优势，随着发酵的进行，条带逐渐减
弱。榨菜初始发酵阶段，主要是附着在新鲜榨菜上
的许多兼性和严格厌氧微生物生长繁殖。 在切割
处理以及盐的作用下， 榨菜表面渗出的汁液非常
适宜肠膜明串珠菌的生长繁殖， 其产生的二氧化
碳和酸很快使 pH 下降，阻止了其它有害微生物生
长繁殖。同时，肠膜明串珠菌可将多余的糖转化为
甘露醇和葡聚糖，而这两种物质除乳酸菌之外，其
它细菌一般不能将它们发酵[4]。肠膜明串珠菌改变
了腌制环境条件， 更适宜于其它乳酸菌按一定的
顺序生长，即起到发酵起动剂的作用。
当肠膜明串珠菌起动发酵后， 进入主发酵阶
段， 主要生长繁殖的微生物是乳杆菌和发酵性酵
母。在榨菜发酵的第 5天（图 1中 2号泳道），出现
植物乳杆菌和短乳杆菌； 发酵第 34天 （图 1中 4
（a） （b）
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第 11 卷 第 3 期
号泳道），出现 Lactobacillus versmoldensis，此阶段
植物乳杆菌快速生长繁殖、产酸，在榨菜腌制中起
主导作用。短乳杆菌能够发酵戊糖，使产品具有独
特的风味。经感官品评，产品口感脆嫩、风味浓郁。
在腌制后期，可发酵性碳水化合物全部被利用后，
因腌制环境 pH 值太低， 乳酸菌的生长繁殖受到
抑制，结果产生乳酸和乙酸。蔬菜原料的缓冲能力
和可发酵性碳水化合物的含量是控制乳酸发酵、
酵母发酵程度的重要因素[4]。
由 SSCP图谱结合乳酸菌数量测定结果，在腌
制发酵 10 d 左右，乳酸菌数量达到最高峰，随后
乳酸菌数量开始下降，进入二次发酵阶段（过酸阶
段）。此时，乳酸的积累反馈抑制了乳酸菌的生长。
这一阶段主要生长繁殖的是发酵性酵母， 这些酵
母在主发酵阶段就已开始生长繁殖，耐酸性强。低
pH 值环境可以抑制乳酸菌的生长繁殖，但只要存
在可发酵性糖，这些酵母仍可继续生长繁殖，直到
把可发酵性碳水化合物全部消耗完为止[4]。
3 讨论
在对样品 SSCP 分析前， 用大肠杆菌（E.coli）
进行预试验 。 从大肠杆菌细菌培养液中提取
DNA，PCR 产物经 λ 核酸外切酶酶切后进行 SS-
CP，结果只出现 1 条条带。 回收条带的 PCR 产物
经 λ 核酸外切酶处理后， 再进行 SSCP 时仍处于
原来的位置，进一步验证了该技术的可靠性。
DNA 提取和 PCR 扩增是 PCR-SSCP 技术的
基础，其决定后续分析的可信性。 基因组 DNA 的
质量，不单以得率和片段大小来衡量，还要看是否
影响到真实微生物群落的多样性 [18]。 PCR 扩增是
造成微生物群落真实结构与 SSCP 图谱脱离的重
要环节之一， 应尽量减少循环次数及采用合适的
退火温度， 以降低对部分微生物的无效放大作
用[11]。
由试实验研究腌制榨菜得到的菌群种类相对
文献记载 [8]的种类偏少，主要是因为由 SSCP 图谱
中条带丰度来选择检测对象，没有回收全部条带，
因此回收的部分较亮条带反映本试验条件下的优
势菌属。 另外也可能与基因组 DNA 提取方法以
及 PCR 选择性放大造成的偏差有关。文献报道的
优势乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌
属和片球菌属等。 本试验结果与杨瑞鹏等 [19]对几
种酸泡菜发酵过程中乳酸菌区系的研究结果较相
似，说明采用 SSCP技术分析榨菜发酵过程中微生
物群落结构是可行的。 通过提高 DNA 提取质量，
减少 PCR 扩增误差，并与传统微生物培养方法相
结合，可获得更全面的微生物多样性信息。
本文采用的 SSCP方法是一种快速、简易的研
究微生物群落结构的方法， 其特点是测序序列较
短，个别只确定属、科分类地位，无法精确鉴定到
“种”。另外对测序结果进行比对，出现毕赤酵母属
和伊萨酵母属， 这可能是细菌 16S 引物与真菌
18S 引物序列同源性较高造成的。 如果能结合其
它引物进行分析， 对于确定微生物分类地位将有
所帮助。
4 结论
榨菜低盐腌制过程中，pH 值始终呈下降的趋
势。平板菌落计数结果表明，乳酸菌数量经历了一
个先急速上升后逐渐趋缓， 并稳定在一定数量的
过程。 SSCP 电泳图谱分析及测序结果表明，主要
的优势菌群包括肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、短乳
杆菌、Lactobacillus versmoldensis。将 SSCP分子生
态检测方法用于腌制菜菌群结构分析及数量变化
规律分析，具有快速、准确和高通量的特点。
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Microbial Community Structure and Its Dynamic Analysis during the Processing of
Low-salinity Pickled Mustard Tuber
Zhang Rui Wu Zufang* Shen Xiquan Lei Lanlan
（Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology， Ministry of Education & Faculty of Life Science and Biotechnology，
Ningbo University， Ningbo 315211）
Abstract Microbial community structure and population changes were investigated， using plate count and single
strand conformation polymorphism （SSCP） method， during the processing of low salinity pickled mustard tuber. Through
SSCP method， 11 distinct dominant bands were obtained by sequence contrasting. The result showed that Leuconostoc
mesenteroides is the dominant microorganism in the initial stage of fermentation； Lactobacillus plantarum and Lactobacil-
lus brevis showed up accompany with the alteration of fermentation condition. At the later stage， the dominant microor-
ganism are Lactobacillus plantarum and Lactobacillus versmoldensis. The pH was descending all the time and the amounts
of lactic acid bacteria increased firstly， reached the peak then began to descend slowly till to maintain a stable quantity.
The contribution of lactic acid bacteria was confirmed by microbial community structure analysis in low-salinity pickled
mustard tuber， which is conducted by pickling under the optimize condition.
Key words low salt pickled mustard tuber； SSCP； community diversity； Lactobacillus； pH
180