全 文 ：　 2006年 10月第 25卷　第 5期
绵阳师范学院学报
Journa l o fM ianyang Norm al University
O c.t , 2006
Vo .l 25　No. 5　
收稿日期:2006-07-18
基金项目:四川省教厅重点项目(2005A175);绵阳师范学院重点课题(MA2005002)
作者简介:刘思曼(1964 -　),女 ,讲师 ,主要从事天然产物有效成分分离与检测的研究。
RP -HPLC法测定翻白草中山奈酚 、槲皮素的含量
刘思曼 ,边清泉
(绵阳师范学院化学与化学工程系 ,四川绵阳　621000)
摘　要:目的:建立翻白草中山奈酚 、槲皮素含量的高效液相色谱测定方法;方法:采用 D iam onsilTM C18柱(4. 6
mm ×150 mm , 5μm), 以 M eOH - 0. 3%H3PO4(4:6, t /v)为流动相 , 365 nm波长 ,流速为 1. 0 m L.m in- 1;结果:待测组
分与其它组分分离良好 (R>1. 5), 2组分平均回收率分别为 99. 2%, RSD=0. 6%;99. 1%, RSD=2. 4%;结论:该
方法操作简单 、易行 ,重现性好 , 可为该原料药及制剂的质控提供参考。
关键词:HPLC;翻白草;山奈酚;槲皮素
中图分类号:R927.2　　文献标识码:A　　文章编号:1672-612x(2006)05-0037-03
0　引言
翻白草 (Potern tilla d iscolor Bge. )为蔷薇科多年
生草本植物 ,又名鸡腿儿 ,鸡脚草 ,千锤打 ,天青地
白 。民间以全草入药 ,主要功效清热除湿 ,凉血止
血 ,解毒消肿 ,降糖降脂效果 [ 1, 2] 。翻白草含多种有
效成分 ,其中山奈酚具有止咳祛痰和消炎作用 ,槲皮
素的抑菌作用最强 ,最低抑菌浓度分别为 59×10-6
和 37×10- 6[ 1] 。近年医学研究报道:槲皮素有抑制
非酶糖化的作用 ,通过抑制蛋白质糖化来抑制醛糖
还原酶活性 ,产生降糖作用 [ 3, 4] 。为促进翻白草药
用资源的开发和拓展应用领域 ,对其主要活性成分
山奈酚和槲皮素建立定量方法十分必要 ,而且目前
尚无文献报道翻白草中山奈酚 、槲皮素的同时检测
方法 ,本实验通过测定技术参数的优化 ,建立一种可
供以翻白草为原料的制药企业原料选择和质控的有
效方法 。
1　药品和仪器
日本岛津 LC - 20AT高效液相色谱仪 ,二极管
阵列检测器 (DAD), CLASS -VP V5. 0色谱数据处
理工作站 , CTD - 6A色谱柱温箱 , SZ - 93型自动双
重纯水蒸馏器 , KQ - 25DE型医用数控超声波清洗
器 。
山奈酚对照品 (sigma公司),槲皮素对照品(中
国药品生物制品检定所 ,纯度 99. 9%)。翻白草药
材购于绵阳天诚大药房 ,经成都天然产物研究所黄
铭研究员鉴定为中药翻白草 (Poten tilla discolor
Bge. )。甲醇为色谱纯 ,水为重蒸水 ,其他试剂均为
分析纯。
2　色谱条件
色谱柱为 D iamonsilTM C18(4. 6 mm ×150 mm ,
5μm);流动相:MeOH - 0. 3%H3 PO4 (4:6 , v /v);流
速:1. 0 mL m in-1;检测波长:365 nm;柱温:30℃;
进样量为 10μL;理论板数按山奈酚 、槲皮素峰计算
均大于 4000;分离度大于 1. 5;灵敏度为 0. 050
AUFS。
3　方法与结果
(1)对照品溶液的制备精密称取经 P2O 5干燥的
山奈酚 、槲皮素对照品 ,分别为 14.4和 8.2 mg,置
于 100 mL容量瓶 ,加甲醇 90mL,超声溶解 ,冷却至
室温后甲醇定溶至刻度 ,摇匀。精密吸取混合液
2.5 mL,置于 10 mL容量瓶中 ,甲醇稀释至刻度 ,摇
匀 , 即得。山奈酚和槲皮素混标浓度分别为
36.0μg.mL- 1、20.5μg.mL - 1.。
(2)供试品溶液的制备精密称取干燥粉碎的翻
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DOI牶牨牥牣牨牰牪牱牰牤j牣cnki牣cn牭牨牠牨牰牱牥牤g牣牪牥牥牰牣牥牭牣牥牨牪
白草粉末(70目 )0.50 g,加入石油醚 (60 - 90℃)50
mL,超声 20m in,过滤 ,弃去石油醚 ,药渣挥干 。药
渣精密加甲醇 50mL称定质量 ,水浴回流 2 h,补足
减失的甲醇质量 ,摇匀 ,用 0.46μm的聚丙烯微孔滤
膜过滤 ,取续滤液作为供试品溶液。
(3)线性关系的考察精密吸取对照品混标溶液
1.0、2.0、3.0、5.0、7.0mL,置于 10mL容量瓶中 ,加
流动相稀释至刻度 ,摇匀 ,分别精确进样 10μL,重复
进样(n=3),按色谱条件项下行色谱 ,测定山奈酚 、
槲皮素的峰面积 。分别以对照品进样量 X(μg)为
横坐标 ,峰面积 Y(A)为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,山
奈酚的线性范围 0.036 - 0.25μg。回归方程 y =
2682.4x - 20.20,相关系数 r=0.9998。槲皮素的线
性范围 0.021 - 0.14μg。回归方程 y =6539.6x -
321.41,相关系数 r=0.9996。
(4)精密度试验取混合对照品溶液 ,重复进样 5
次 ,每次 10μL,测定峰面积积分值 ,结果山奈酚 RSD
=1.26%,槲皮素 RSD =2.13%.
(5)稳定性试验取 3.1项下对照品溶液 ,分别
在制备后每隔 3h进样 10μL,连续按 2项下色谱条
件测定 5 次 , 其峰面积的结果:山奈酚 RSD =
0.32%,槲皮素 RSD=0.68%,表明在 12h内基本稳
定 。
(6)重现性试验取同批样品粉末 5份 ,按 3.2
项下制备样品溶液 ,重复测定 ,计算山奈酚和槲皮素
峰面积积分值的 RSD(n =5),分别为 0.44%和
1.02%。
　　(7)回收率试验精密称取同批样品 6份 ,其中 5
份分别加入对照品 ,另一份作为测定本底值样品。
各份均依制样方法 、测定方法分析 ,重复进样 3次 ,
求平均回收率 。结果见表 1、2。
表 1　山奈酚回收率测定结果(n=3)
本底估
(μg g- 1)
加入量
(μg g -1)
测得总量
(μg g- 1)
回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%)
13. 90 12.24 26. 06 99. 4
13. 90 12.24 26. 01 98. 9
13. 90 12.24 26. 12 99. 8 99. 2 0. 6
13. 90 12.24 26. 10 99. 7
13. 90 12.24 25. 94 98. 4
表 2　槲皮素回收率测定结果(n=3)
本底估
(μg g - 1)
加入量
(μg g- 1)
测得总量
(μg g - 1)
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
10.2 9.60 19.6 97. 9
10.2 9.60 20.1 103. 1
10.2 9.60 19.7 98. 9 99. 1 2. 4
10.2 9.60 19.5 96. 9
10.2 9.60 19.7 98. 9
　　(8)样品测定分别精密吸取 3.1、3.2项下制备
的对照品溶液与供试品溶液 10μL,注入高效液相色
谱仪 ,按 2项下条件测定 ,记录山奈酚 、槲皮素峰面
积积分值 ,代入回归方程计算含量 。结果山奈酚和
槲皮素分别 1.22 mg g -1 、0.56 mg g- 1。对照品
和样品的色谱图见图 1。
图 1　对照品和样品 HPLC色谱图
A、对照品;B、样品;b、山奈酚;a、槲皮素
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4　讨论
(1)黄酮类化合物中酚羟基易电离 ,组分峰易
产生拖尾 ,加入 H3 PO 4调整 pH至弱酸性 ,组分峰形
对称性良好 ,但 H3 PO4对 SOD柱填料有一定损害 ,
为保持柱性能稳定 ,延长柱寿命 ,本实验中采取在确
保组分峰形良好的前提下降低 H3 PO 4用量。
(2)供试品溶液制备条件的确定翻白草含有酯
类物质 ,此类物质通过石油醚的萃取可有效除去 ,避
免造成测定时组分峰分离度下降及降低反相柱使用
寿命。 (3)检测波长的选择山奈酚 、槲皮素对照品
以甲醇为溶剂的紫外扫描图谱表明 ,两组分的最大
吸收波长分别为 365 nm、 265 nm和 368 nm、 254
nm ,在 368 nm处其它不明物组分有一定吸收 ,将对
测定产生干扰 ,导致测定结果产生误差 。同时也兼
顾各组分的检测灵敏度 ,确定最佳检测波长为 365
nm。
(4)流动相的优化在含量测定时 ,我们曾采用
MeOH - H2O(35∶65)、MeOH -H2O - CH3 CN -
HA c(30 ∶57 ∶10∶3)作为流动相 [ 5 ～ 7] ,但前者待测
组分峰形较差 ,有拖尾现象 ,后者待测组分与其它组
分峰的分离度偏小 ,且操作复杂 ,成本高 。最后采用
了 MeOH -0.3%H3 PO4(4∶6, v /v),结果待测组分
峰分离效果好 ,保留时间适宜 ,简便易行 。
参考文献:
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Determ ination of the Conten t ofKaempferol and Quercetin
in Herba Potentillae D isco loris by RP -HPLC
LIU Si-m an, B IAN Q ing-quan
(Depa rtment of Chem istry and Chem ical Eng ineering, M ianyang Norma lUniversity,
M ianyang, S ichuan　621000)
Abstract:A im:Employ ing the me thod of RP -HPLC to de term ine the con tent of K aempfero l and querce tin
in Herba Po tentillae D isco loris. M e thod:w ith a co lumn DiamonsilTMC18(4. 6mm ×150 mm , 5μm)and a mobile
phase ofM eOH - 0. 3%, H3PO4(4:6, t /v), the de tec tion w aveleng th be ing 365 nm , velocity o f flow being 1. 0
mL m in -1. Conclusion:N ice effect of separation is obta ined(R>1. 5), the average rate o f recove ry respectively
being 98. 9%, 96. 2%, and the RSD respective ly be ing 1. 62%, 1. 76. Its a simp le and re liab le w ay thatm ay
provide the re ference fo r the quality contro l o f th is raw materialmedicine and preparation.
Key words:HPLC , Herba Po tentillae discoloris, K aempfero l, Que rcetin
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刘思曼 ,边清泉 RP -HPLC法测定翻白草中山奈酚 、槲皮素的含量