全 文 :书 [收稿日期] 2016-03-16;2016-03-31修回
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目“苹果属(蔷薇科)植物杂交起源研究(31070619)”,“苹果属(蔷薇科)植物分类修订”(31170178)
[作者简介] 李玉霞(1988-),女,在读硕士,研究方向:植物分类学。E-mail:1066211648@qq.com
*通讯作者:钱关泽(1965-),男,教授,博士,硕士生导师,从事种子植物分类研究。E-mail:qianguanze@lcu.edu.cn
[文章编号]1001-3601(2016)05-0207-0081-03
台湾林檎叶片浸提液对致腐微生物的抑制效果
李玉霞,钱关泽*,李凡海,刘廷磊,刘莲芬
(聊城大学,山东 聊城252059)
[摘 要]为台湾林檎的深入研究及其开发应用提供理论依据,采用生长速率法测定江西和浙江2个地
区台湾林檎叶片浸提液对黑曲霉菌、毛霉菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果。结果表明:除江西台
湾林檎叶片浸提液对毛霉菌没有抑制效果外,2个地区台湾林檎浸提液对其他致腐微生物均有抑制作用,其
中浙江台湾林檎叶片浸提液的抑菌效果最佳,对黑曲霉、毛霉菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制率分别为
93.13%、62.4%、97.88%和100%;江西台湾林檎叶片浸提液对这4种致腐微生物的抑制率分别为38.7%、
-7.48%、99.94%和100%,对毛霉菌的菌丝生长具有促进作用。台湾林檎浸提液具有抑菌防腐的效果,但
在选择台湾林檎作为植物源天然防腐剂原料时应注意其来源地,最好进行试验确定其是否适合作为特定微
生物防腐剂的原料。
[关键词]台湾林檎;浸提液;致腐微生物;抑菌效果
[中图分类号]S685.12 [文献标识码]A
Inhibitory Efect of Malus doumeri Leaves’Extract Liquid on
Spoilage Microorganism
LI Yuxia,QIAN Guanze*,LI Fanhai,LIU Tinglei,LIU Lianfen
(Liaocheng University,Liaocheng,Shandong252059,China)
Abstract:The inhibitory effect of M.doumeri leaves’extract liquids from Jiangxi and Zhejiang
Province on Aspergilus niger,M.doumeri,Escherichiacoli and Staphylococcus aureus was determined by
the growth rate method to provide the theoretical basis for development and application of M.doumeri.
Results:Except that the M.doumeri leaves’extract liquid from Jiangxi Province has no inhibitory effect
on Mucor mucedo,M.doumeri leaves’extract liquids from Jiangxi and Zhejiang Province have the
inhibitory effect on other spoilage microorganism.The M.doumeri leaves’extract liquid from Zhejiang
Province has the better inhibitory effect.The inhibitory rate of M.doumeri leaves’extract liquid from
Zhejiang Province on Aspergilus niger,Mucor mucedo,Escherichia coli and Staphylococcus aureus is
93.13%,62.4%,97.88%and 100%respectively.The inhibitory rate of M.doumeri leaves’extract liquid
from jiangxi Province on Aspergilus niger,Mucor mucedo,Escherichia coli and Staphylococcus aureus is
38.7%,-7.48%,99.94% and 100% separately and has the promotion effect on mycelial growth of
Mucor mucedo.The extract liquid of M.doumeri has the bacteriostasis and antiseptic effect but the
essential test should be conducted when M.doumeri is selected as a raw material of natural botanical
preservatives against the specific microorganism.
Key words:Malus doumeri;extract liquid;spoilage microorganism;inhibitory effect
台湾林檎〔Malus doumeri(Bois.)Chev.〕为蔷
薇科(Rosaceae)苹果属(Malus Mil.)落叶乔木[1]。
其叶片含有多种物质,如根皮酚、根皮酸、蛋白质、氨
基酸、VC、VE、黄酮苷、黄酮类、多酚类、多元酚、甾
醇、胡萝卜苷、白杨素等[2-4]。其中黄酮、酚类、皂苷
类等物质具有抑菌、防腐和抗氧化等多种功效,可作
为生产生物防腐剂的原料[3,5-6]。目前,国内外对其
作为生物防腐剂及作用原理的研究鲜见报道。为
此,笔者以浙江和江西2个地区台湾林檎叶片浸提
液为原料,研究其对黑曲霉菌、毛霉菌、大肠杆菌和
金黄色葡萄杆菌等4种常见致腐微生物的抑制效
果,以期为台湾林檎的深入研究、开发应用和大面积
种植提供理论依据,同时为其后期抑菌防腐效果和
抑菌机理的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 台湾林檎与菌种 台湾林檎:采集于浙江
龙泉昴山和江西井冈山。真菌:黑曲霉菌(Asper-
gillus niger)和毛霉菌(Mucor),由发霉食物上分离
纯化获得,保存于聊城大学生命科学院微生物重点
实验室。细菌:大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄
色葡萄杆菌(Bacillus Subtilis),来源于聊城大学生
命科学院微生物重点实验室。
1.1.2 试剂与仪器 试剂:葡萄糖、琼脂、牛肉膏、
蛋白胨、壳聚糖、硝酸银等。仪器:SW-CJ-IF型单人
贵州农业科学 2016,44(5):81~83
Guizhou Agricultural Sciences
单面无菌超净工作台,苏州净化设备有限公司生产;
LRH-250A型生化培养箱,金坛市科析仪器有限公
司生产;MLS-3750高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗
器械厂生产。
1.2 试验方法
1.2.1 台湾林檎叶片浸提液的制备 分别称取
4g江西和浙江的台湾林檎叶片、日瓦海棠叶片粉碎
物各2份,分别加入200mL无菌水。其中,一份煮
沸10min,冷却后定容至200mL,静置24h后过
滤,弃滤渣;另一份浸泡24h后直接过滤,弃滤渣。
分别保存滤液,备用。
1.2.2 壳聚糖-Ag溶液的制备 用有效成分含量
为2%的乙酸溶液,配制壳聚糖-Ag溶液(壳聚糖∶
硝酸银为100∶1)备用。
1.2.3 培养基的制备 参照文献[7-8]的方法,配
制pH 7.4~7.6的牛肉膏蛋白胨培养基,121℃高
压湿热灭菌20min。参照文献[9]的方法,配制
PDA培养基,分装后121℃高压湿热灭菌20min。
1.2.4 培养基平板的制备 分别向灭菌后冷却至
50℃左右的24mL牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养
基中加入6mL台湾林檎叶片浸提液,充分混匀后
分别倒入已灭菌的3个培养皿中,静置使其冷却备
用。用防腐效果较好的日瓦海棠叶片浸提液和对大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制效果较好的壳聚糖-
Ag溶液替换台湾林檎叶片浸提液作为阳性对照,
空白对照加入6mL无菌水。
1.2.5 致腐微生物的分离与纯化 选取无菌水处
理后发霉的馒头、米饭和饼干分别接种到含有PDA
培养基的培养皿中,放入(25±1)℃恒温培养箱中培
养,待真菌菌落出现后及时分离到无菌处理的PDA
培养基培养皿中培养,待菌落相对纯净后,参照文献
[9]的方法进行单胞分离纯化处理,获得纯净菌落,
分别标记后保存于4℃冰箱备用。
1.2.6 致腐微生物的鉴定 查看致腐微生物的菌
落形态、颜色及生长速率等;在电子显微镜下观测致
腐微生物的菌丝和孢子的形状、长短、大小、颜色和
有无横隔等形态,参照《真菌鉴定手册》《普通真菌
学》《中国真菌志》等文献确定分离获得的真菌种属。
1.2.7 微生物接种及检测 真菌接种参照文献
[10-11]的方法,将直径为0.5cm的菌饼,长菌的一
面朝向培养基,密封、标记后置于(25±1)℃恒温培
养箱中培养,每个处理3次重复,待菌落长至合适大
小时参照文献[12]的方法测定菌落直径并拍照。细
菌接种采用划线法,用接种环蘸取少量菌种,在培养
皿上划均匀细线,密封、标记后置于(25±1)℃恒温
培养箱中培养,每处理3次重复,待菌落长至合适时
期观测菌落数量并拍照。
1.3 统计分析
试验数据用软件 Microsoft Excel进行统计、整
理,结果用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 不同处理对致腐真菌的抑制效果
从表1可知,不同处理对2种致腐真菌的抑制
效果存在一定差异,浙江台湾林檎叶片浸提液对黑
曲霉的抑制率最高,达93.13%;壳聚糖-Ag溶液的
抑制率次之,为42.17%。壳聚糖-Ag溶液对毛霉
菌的抑制率最高,达68.32%;浙江台湾林檎叶片浸
提液的抑制率次之,为62.4%。江西台湾林檎叶片
浸提液对毛霉菌的抑制率为-7.48%,说明该浸提
液对菌丝生长有促进作用;对黑曲霉菌的抑制效果
也较差,抑制率仅38.7%。表明,毛霉菌对4种制
剂的抵抗能力较强,在防治腐败变质时可采用其他
方法或增加制剂浓度等达到预期效果;浙江台湾林
檎叶片浸提液抑制真菌生长、预防发霉变质的效果
明显,具有作为天然植物防腐剂的潜力。选择江西
台湾林檎叶片浸提液作为天然植物防腐剂时最好进
行试验,以确定是否可作为特定微生物的防腐剂。
表1 不同处理对2种致腐真菌的抑制率
Table 1 Inhibitory rate of different treatments on two spoilage fungi
真菌
Fungi
处理
Treatment
菌落直径/cm
Colony diameter
抑制率/%
Inhibitory rate
黑曲霉 对照 7.71±0.08 -
Aspergilus niger 浙江台湾林檎 0.53±0.02 93.13±0.24
江西台湾林檎 4.73±0.21 38.70±3.30
日瓦海棠 5.24±0.24 32.02±2.93
壳聚糖-Ag 4.46±0.07 42.17±1.45
毛霉菌 对照 8.09±0.04 -
Mucor mucedo 浙江台湾林檎 3.04±0.04 62.40±0.60
江西台湾林檎 8.29±0.09 -7.48±0.31
日瓦海棠 6.32±0.06 18.06±0.18
壳聚糖-Ag 2.56±0.21 68.32±2.70
2.2 不同处理对致腐细菌的抑制效果
从表2看出,台湾林檎叶片浸提液和壳聚糖-
Ag溶液对2种致腐细菌的抑制效果较好,其中,浙
江、江西台湾林檎叶片浸提液对大肠杆菌的抑制率
分别为97.88%和99.94%,对金黄色葡萄球菌的抑
制率均为100%;壳聚糖-Ag溶液对2种致腐细菌
的抑制率均为100%。日瓦海棠叶片浸提液不能抑
制2种致腐细菌的生长,反而会促进大肠杆菌、金黄
色葡萄球菌的生长,抑制率分别为 -134.73%
和-291.46%。台湾林檎叶片浸提液和壳聚糖-Ag
溶液对2种致腐细菌的抑制率差异较小,但均与日
瓦海棠叶片浸提液的抑制率存在明显差异。表明,
·28·
贵 州 农 业 科 学
Guizhou Agricultural Sciences
表2 不同处理对2种致腐细菌的抑制率
Table 2 Inhibitory rate of different treatments on two spoilage bacteria
菌落
Colony
处理
Treatment
菌落数量/个
Colony number
抑制率/%
Inhibitory rate
大肠杆菌 对照 534.33±13.58 -
Escherichia coli 浙江台湾林檎 11.33±0.58 97.88±0.16
江西台湾林檎 0.33±0.58 99.94±0.11
日瓦海棠 1254.33±38.50 -134.73±1.43
壳聚糖-Ag 0.00±0.00 100.00±0.00
金黄色葡萄球菌 对照 2060.00±85.51 -
Staphylococcus aureus 浙江台湾林檎 0.00±0.00 100.00±0.00
江西台湾林檎 0.00±0.00 100.00±0.00
日瓦海棠 8054.67±226.99 -291.46±19.74
壳聚糖-Ag 0.00±0.00 100.00±0.00
浙江和江西2个地区的台湾林檎叶片浸提液对大肠
杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制功效相当,并可完全灭
杀金黄色葡萄球菌,台湾林檎叶片浸提液在抑制致
腐细菌生长、预防发霉变质方面效果明显,具有作为
天然植物防腐剂的潜力。
3 结论与讨论
试验结果表明,浙江、江西台湾林檎叶片浸提液
对黑曲霉的抑制率分别为93.13%和38.7%,对毛
霉菌的抑制率分别为62.40%和-7.48%;对大肠
杆菌的抑制率分别为97.88%和99.94%,对金黄色
葡萄球菌的抑制率均为100%。表明,除江西台湾
林檎叶片浸提液对对毛霉菌没有抑制效果外,浙江、
江西台湾林檎叶片浸提液对其他真菌和细菌的抑制
效果较好,对致腐细菌的抑制效果优于致腐真菌,具
有作为天然防腐剂的潜力。不同地区的台湾林檎叶
片浸提液对同一种微生物的抑制效果不同,同一地
区台湾林檎叶片浸提液对不同微生物的抑制效果也
不同。原因可能是台湾林檎叶片内的一些物质受到
生长环境条件影响,成分发生变化,因此在选择台湾
林檎作为植物源天然防腐剂原料时应注意其来源
地,最好进行试验确定其是否适合作为特定微生物
的防腐剂原料。
邓芳席等[13]研究表明,林檎叶浸出物对部分真
菌和细菌有抑制作用,可显著抑制金黄色葡萄球菌
(Bacilus Subtilis)、枯草杆菌(Staphylococcus aureus)、
大肠杆菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergilus ni-
ger)、黄曲霉(As.flavus)、青霉(PeniciliumSP)等致腐
微生物的生长,对猪肉、茄子和豆腐等食品具有一定
的防腐效果;黄卫文等[14]研究林檎叶提取物对小白
鼠体内的抑菌效果,结果表明,温水浸出物和乙醇提
取物具有显著的抑菌效果,主要抗菌成分为有机酸、
单宁、皂苷。本研究结果与前人的研究结果相符合,
但不同区域台湾林檎浸提液的抑菌效果差异前人研
究中未涉及,至于是否只是单纯的生长环境影响或
不同生长地区是否会造成其他影响,这些影响是否
可以遗传也有待进一步研究。浙江和江西2个地区
的台湾林檎叶片浸提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球
菌的抑制功效相当,但是否为同一种或一类物质发
生作用,还需要进一步研究证实。在供试浓度下,2
种浸提液可以完全灭杀金黄色葡萄球菌,对大肠杆
菌的作用主要是抑制其生长,不能完全杀灭,是否提
升其供试浓度可完全杀灭,还有待进一步研究。
[参 考 文 献]
[1] 李玉霞,钱关泽,李凡海.台湾林檎研究进展[J].农业
科技与装备,2015(7):27-29.
[2] 谢达平,赵肃青,曾晓雄,等.尖嘴林檎叶防霉有效成
分分析[J].林产化学与工业,1998,18(2):33-38.
[3] 卢 静,杨丰庆,夏之宁.尖嘴林檎叶的化学成分[J].
中成药,2014,36(8):1692-1696.
[4] 林叶新,李忠海.林檎叶水提物及其不同极性组分的
抑菌和清除自由基作用的研究[J].天然产物研究与
开发,2012(9):1264-1269,1287.
[5] 文 洁,周法兴.台湾林檎叶化学成分研究[J].中药
材,1998,21(11):572.
[6] 林叶新,李忠海.林檎叶防腐保鲜成分微波提取工艺
的优化研究[J].化工技术与开发,2012,41(3):
13-17.
[7] Li X D,Lei G,Juan Z,et al.Optimisation for high cel
density cultivation of Lactobacilus salivarius BBE 09-
18with response surface methodology[J].Interna-
tional Dairy Journal,2013,23(7):1-7.
[8] Lee K B,Kim H J,Lee E J.Mixed cultures of kimchi
lactic acid bacteria show increased cel density and
lactate productivity[J].African Journal of Biotechnol-
ogy,2013,12(25):4000-4005.
[9] 李凡海.康宁霉素对臭椿苗期病害致病菌抑菌机理的
研究[D].聊城:聊城大学,2015.
[10] 李凡海,王桂青.辛夷六种溶剂平行提取物对黄瓜灰
霉病菌的抑制作用[J].北方园艺,2015(2):108-111.
[11] 毕旺华,李建杰,周鲁宁.壳聚糖对真姬菌丝体生长的
影响[J].北方园艺,2015(1):142-144.
[12] 李凡海,王桂青.细辛精油和3种化学农药对茄子枯
萎病菌的抑制作用[J].农业科技与装备,2015,241
(7):10-13.
[13] 邓芳席,黄祖法.林檎叶抑菌作用的研究[J].食品科
学,1996,17(3):47-50.
[14] 黄卫文,钟海雁,魏元青.林檎叶中有效成分在小白鼠
体内的抑菌作用[J].中南林学院学报,2001,21(5):
54-57.
(责任编辑:冯 卫)
·38·
李玉霞 等 台湾林檎叶片浸提液对致腐微生物的抑制效果
LI Yuxia et al Inhibitory Effect of Malus doumeri Leaves’Extract Liquid on Spoilage Microorganism