全 文 ：臀果木提取物对前列腺组织
细胞凋亡的诱导作用
张莲英　张建业　李　涵　陈蔚文　胡晓燕
(山东医科大学生化教研室 ,济南 250012)
　　摘　要　臀果木提取物可诱导大鼠前列腺组织细胞凋亡。用该提取物处理大鼠 , 4d , 9d 和
14d 后取前列腺 , 用 HE染色观察细胞形态变化 , DNA 凝胶电泳和流式细胞术(FCM)定性 、定量
DNA的降解及凋亡率。结果前列腺组织出现表皮细胞萎缩;DNA 琼脂糖凝胶电泳出现“梯形”条
带;细胞凋亡率背前叶 、背侧叶和腹叶分别为 0.67%, 3.42%和 6.49%(4d), 0.32%, 7.25%和 10.
12%(9d), 0.77%, 5.43%和 7.46%(14d)。表明臀果木提取物能诱导大鼠前列腺背侧叶和腹叶细
胞凋亡。
关键词　臀果木提取物;前列腺;细胞凋亡
　　细胞凋亡是细胞受到特异刺激后 ,启动
内在“自杀”程序而引起的一种控制性死亡方
式。在正常组织细胞更新和肿瘤消退等过程
中 ,机体有能力通过凋亡清除不需要的异常
细胞[ 1] 。细胞凋亡不仅对生物个体的发育 、
成熟和维持各组织正常结构与功能有着重要
的作用 ,而且在肿瘤的发生 、免疫调节和抗肿
瘤药物治疗等方面也具有重要意义[ 2] 。
臀果木提取物也称通尿灵(PA),在临床
上用于治疗良性前列腺增生症 ,其活性成分
是非洲草药 Prunus Africana 提取物 ,属脂
质类复合物。具有抗水肿 ,抗炎活性及促进
前列腺分泌作用 。可抑制由生长因子导致的
纤维母细胞增生 ,尤其对碱性纤维细胞生长
因子(bFGF),表皮生长因子(EGF),角化细
胞生长因子(KGF)等起重要作用[ 3] 。我们
的实验表明 PA 可以诱导大鼠前列腺组织发
生细胞凋亡。
1　材　料
　　PA 油溶液　将提取物溶于芝麻油中 ,
含量为 67.5mg/ml。
动物　Wister 雄性大鼠 ,购自山东医科
大学实验动物中心 。
2　方　法
2.1　用药方法
取体重约 300g 大鼠 ,分为 4 组 , 1 组为
正常对照 ,其余 3 组分别腹腔注射通尿灵
225mg/(d.kg)体重 。4d , 9d和 14d后取前列
腺 ,其中一小部分背前叶经 10%福尔马林固
定用于HE染色 ,其余部分液氮贮存备用 。
2.2　HE染色观察细胞形态
常规石蜡包理切片 , HE 染色 ,光镜下观
察并照相 。
2.3　DNA 提取和电泳
前列腺组织的 DNA 提取按 Natasha
等[ 4]的方法略加改动。 1%琼脂糖凝胶电
泳 ,紫外透射反射仪观察并照相。
2.4　流式细胞术(FCM)观察细胞凋亡及细
胞周期变化
取前列腺各叶 ,PBS 缓冲液洗涤 3次 ,研
45
药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Biotechnology 　1999 6(1):45 ～ 48
收稿日期　1998-07-06
磨 ,500目铜网过滤 ,离心 ,70%乙醇 4℃固定
过夜 , 流式仪(FAC Scan B.D 公司)测定
DNA 荧光强度 , 散射光参数 , 激发光波长
488nm ,并用凋亡软件定量细胞凋亡数目及
细胞周期分布。
3　结　果
3.1　细胞形态学变化　
HE染色结果发现 , PA 使前列腺表皮发
生明显的萎缩 ,连续注射提取物 9d ,萎缩程
度最大 ,并出现凋亡细胞的形态改变(图 1),
而对照组未发现有类似改变。
Tab 1　Influence of cell cy cle in the rat prostate by PA
PA(days o f
injection)
0 4 9 14
Dorsal
lobe
Lateral
lobe
Ventral
lobe
Dorsal
lobe
Lateral
lobe
Ventral
lobe
Do rsal
lobe
Lateral
lobe
Ventral
lobe
Dorsal
lobe
Lateral
lobe
Ventral
lobe
Apopto sis
cells(%) 0.1 0.29 0.32 0.67 3.42 6.49 0.32 7.25 10.12 0.77 5.43 7.46
Cell cy cle
G0/ G1 90.84 90.04 84.56 82.88 90.23 83.1 84.56 85.71 72.70 87.96 84.60 75.14
Distribution
S(%) 1.72 1.94 8.02 11.7 3.90 15.13 8.02 13.35 26.95 2.36 8.77 24.42
G2/M 7.45 8.03 7.42 5.35 5.87 4.56 7.42 0.94 0.35 9.69 6.63 0.44
A:Normal(×200)　B:PA(9 days , ×200)　C:Normal(×400)　D:PA(9 day s , ×400)
Fig 1　HE staining of the rats prostate
46 　 　 　 药 物 生 物 技 术 　 　 第 6 卷第 1 期
3.2　前列腺组织 DNA 电泳　
DNA 凝胶电泳图谱显示:连续注射
PA9d的前列腺组织 DNA 呈梯形条带 ,而连
续注射4d和 14d的前列腺DNA有明显的拖
尾现象即大分子片段 DNA 的存在 ,未经处
理的前列腺组织 DNA无类似改变(图 2)。
A:Marker　B:Normal　C:4 day s(PA)
D:9 days(PA)　E:14 days(PA)
Fig 2　DNA agarose gel electropho resis
3.3　FCM 观察细胞凋亡及细胞周期变化　
FCM 的结果见表 1。在经凋亡软件分
析的 DNA 直方图上 ,实验组的前列腺背侧
叶和腹叶在 G0/G1 峰前有明显的亚二倍体
峰 ,经凋亡软件确认为凋亡峰 ,说明提取物可
诱导鼠前列腺的背侧叶和腹叶细胞凋亡 , 9d
时诱导作用最强 ,并且腹叶的凋亡率较背侧
叶高(10.12%和 7.25%)。对照组和实验组
前列腺的背前叶在 G0/G1 峰前无亚二倍体
峰即背前叶无明显的细胞凋亡 。
凋亡细胞数与 S期细胞数呈正相关 ,与
G2/M 呈负相关。
4　讨　论
DNA凝胶电泳是研究细胞凋亡的最经
典方法[ 5]我们以此方法判断 PA诱导前列腺
组织发生凋亡时 ,发现作用 9d的前列腺组织
DNA 凝胶电泳图谱可出现典型的梯形条带 。
即由约 185bp及整数倍的 DNA 片段形成的
梯形条带 ,而在 4d和 14d 时 DNA 产生大分
子片段即凝胶电泳时出现明显的拖尾现象 。
有报道提出大分子 DNA 片段的形成是比
DNA梯形更可靠的生化指标。这些大分子
DNA片段很可能是梯状物的前体。实验证
实20 ～ 50kb 的 DNA 片段的形成是细胞凋
亡的特征性指标 , PA 诱导前列腺组织细胞
凋亡时 ,DNA断裂以形成大分子的 DNA 片
段为主。
DNA凝胶电泳检测 DNA 的断裂情况 ,
虽然直观 ,但不能定量 ,我们以 FCM 法定量
分析了 DNA的断裂情况。细胞凋亡与坏死
不同 ,凋亡细胞在 DNA 直方图上表现为 G0/
G1 峰前可出现低 DNA 含量的亚二倍体峰 ,
而坏死细胞由于其 DNA 发生不规则断裂在
G0/G1 峰前可出现低 DNA含量的弥散低峰 ,
另外凋亡细胞 FSC(前向散射 ,反映细胞体积
大小)逐渐减低 ,SSC(侧向散射 ,反映细胞均
质情况)增高 ,而坏死细胞由于细胞膜通透性
改变 ,细胞肿胀 ,其 FSC和 SSC 均增高 ,因此
凋亡细胞 、坏死细胞和正常细胞在 DNA 光
散射图上分别处于 3个不同的区域[ 6] 。大鼠
前列腺在结构上分为 3 部分即背前叶 、背侧
叶和腹叶 。未经 PA 作用的正常前列腺的 3
部分在 DNA直方图上表现为 G0/G1 峰前存
在很小的低 DNA 含量弥散峰 ,说明有很少
量的坏死和/或凋亡细胞 ,而实验组中前列腺
的腹叶和背侧叶在 G0/G1 峰前有明显的二
倍体峰 。说明 PA 诱导其细胞凋亡 ,并且均
为9d时凋亡率最高 ,分别为 10.12%和 7.
25%,而背前叶与对照组相类似 。可见 PA
对前列腺组织不同的部位作用不同即诱导背
侧叶和腹叶细胞凋亡 ,但不能使背前叶发生
细胞凋亡 。
PA 是一种生长因子抑制剂 ,通过抑制
细胞生长的作用机理用于治疗前列腺增生 ,
47张莲英:臀果木提取物对前列腺组织细胞凋亡的诱导作用
从我们的实验结果看 , PA 不仅仅抑制细胞
增殖 ,还可以诱导细胞凋亡 ,其作用机制尚待
进一步研究。
参 考 文 献
1　周安宇 , 湛贻朴 , 邹万忠 , 等.地塞米松诱导大鼠
胸腺细胞凋亡.上海免疫学杂志 , 1995 , 15(2)∶
65
2　Orrenius S.Apoptosis molecular mechanisms and
implicati ons for human disease.J Int Med , 1995 ,
237(5)∶529
3　章咏裳.前列腺增生症药物治疗的进展.临床泌
尿外科杂志 , 1998 , 13(6)∶243
4　Natasha K , Isaacs J T.Activation of programmed
cell death in the rat ventral prostate after castra-
tion.Endocrinology , 1988 , 122(2)∶552
5　Wyllie A H.Glucocor ticoid-induced thymocy teapo-
ptosis is associated with endogenous endonuclease
activation.Nature , 1980 , 284(10 April)∶555
6　Huschtschal No rman R W , Wright A S , et al.I n-
dentification of apoptotic and necrotic human
leukemic cells by flow cy tometry.Exp Cell Res ,
1994 , 212(1)∶162
Apoptosis Induced by Prunus in the Rat Prostate
Zhang Lianying , Zhang Jianyi , Li Han , Chen Weiwen , Hu Xiaoyan
(Department of Biochemistry , Shan Dong Medical University , Jinan 250012)
Abstract　Prunus-t reated rats w ere given 225mg/kg daily by sc injection.After 4 ,9 and 14 days
the prostates were excised , the morphologic changes were observed by HE staining , DNA frag-
mentes and apoptotic cells were determined.The results show led Prunus treatment caused ep-
ithelial cell at rophy “ ladder” Lane in DNA agarose gel electropho res.The apoptotic cells w ere
0.67%,3.42% and 6.49%(Prunus , 4days), 0.32%, 7.25% and 10.12%(Prunus , 9 days),
0.77%,5.43% and 7.46%(Prunus , 14day s)in the dorsal , lateral and ventral lobe , respectively .
Key Words　Prunus Africana , Prostate , Apoptosis
·信　息·
采用灌注层析法大规模纯化
蜱抗凝血栓多肽的一种新工艺
采用基因工程方法已经产出了许多外源蛋白 ,
柱层析是普遍采用的提纯方法 , 但速度慢 、花费高 ,
目前 ,采用了强阳离子交换和反向灌注层析液 ,该液
具有直径为 20μm , cd 纳米颗粒。纯化来源于重组
啤酒酵母培养物的蜱抗凝血栓多肽的过程为:1.重
组 TAP 10L发酵规模工艺的开发;2.高分辨率重组
TAP的纯化;3200L 规模的纯化;4.重组 TAP 的脱
盐 、脱色和浓缩作用;5.重组 TAP 的特征分析;6.
重组 TAP 的产率。上述工艺减少了所需纯化时间 ,
并使重组 TAP 产率提高了 15%
99-A-09
48 　 　 　 药 物 生 物 技 术 　 　 第 6 卷第 1 期