全 文 ：新疆农业科学 2015，52(9) :1600 － 1606
Xinjiang Agricultural Sciences
doi:10． 6048 / j． issn． 1001 － 4330． 2015． 09. 005
基于 ISSＲ分子标记分析新疆
野杏遗传多样性
曹 倩，廖 康，刘 娟，孙 琪，刘 欢，冯贝贝
(新疆农业大学特色果树研究中心，乌鲁木齐 830052)
摘 要:【目的】通过 ISSＲ分析标记技术，分析新疆野杏种质资源的遗传多样性，为该资源的利用和保护提供
理论依据和技术支持。【方法】利用 ISSＲ分子标记对新疆伊犁霍城县大西沟的 61 份野杏单株进行遗传多样
性分析。【结果】用 21 条引物对样品进行 PCＲ扩增，共扩增出 437 条条带，其中多态性条带 408 条，多态性条
带比率为 92． 46%。通过软件计算出有效等位基因数(Ne)、Nei’s 基因多样性指数(H)和 Shannon 信息多样
性指数(I)分别为 1． 577 5、0． 334 1、0． 499 0。引物平均多样性信息指数(PIC)为 0． 91。说明野杏的遗传多样
性较为丰富。利用 NTSYS － PC2． 1 软件进行 UPGMA聚类，各个样品间的遗传相似系数在 0． 62 ～ 0． 95。【结
论】新疆霍城大西沟的野杏具有丰富的遗传多样性，遗传多态性比率达到 90%以上，引物平均多样性信息指
数(PIC)较高，接近 1。61 份野杏单株间的遗传相似度较高，亲缘关系较近。
关键词:野杏;遗传多样性;ISSＲ
中图分类号:S58;S188 文献标识码:A 文章编号:1001 － 4330(2015)09 － 1600 － 07
收稿日期:2014 － 12 － 21
基金项目:国家公益性行业科研专项“新疆特色林果提质增效关键技术研究与示范”(201304701) ;新疆维吾尔自治区科技计划项目“新
疆特色果树高效安全生产关键技术集成与示范”(201130102) ;新疆维吾尔自治区果树重点学科基金
作者简介:曹倩(1989 －) ，女，新疆人，硕士研究生，研究方向为果树种质资源学，(E － mail)caoqian0510@ 163． com
通讯作者:廖康(1962 －) ，男，四川梓橦人，教授，博士生导师，研究方向为果树资源及栽培生理，(E － mail)liaokang01@ 163． com
0 引 言
【研究意义】杏原产于我国，起源中心(基因
中心或多样化中心)在新疆［1 － 2］，种质资源极为丰
富。杏属野生种大致分布于 E133° ～ 70°和 N52°
～ 30°的亚洲温带地区［3］。新疆野生杏(Armenia-
ca vulgaris Lam)属蔷薇科(Ｒosaceae) ，杏属(Ar-
meniace Mill．)植物［4］，被认为是世界栽培杏的原
生起源种群，曾对世界栽培杏的驯化起过决定性
的作用［5］。它抗旱、抗寒，具有很强的适应性，广
泛分布于新疆伊犁、塔城等山区，主要用于栽培杏
的砧木，在育种上具有重要利用价值。霍城县大
西沟是新疆野生果树的重要分布地区，分布有大
量的野杏、野生樱桃李、野苹果、野山楂等，其中野
杏是该区域的主要种类，常与野苹果、野山楂等伴
生，分布范围广、数量多。近年来由于人为因素对
野果林环境的破坏，使得野杏等资源的自然繁衍
受阻，数量不断减少，研究该区域野杏资源的多样
性，为新疆野杏种质保护和利用提供理论依据。
【前人研究进展】ISSＲ 分子标记技术作为品种鉴
别、亲缘关系和分类的手段之一［6］，已经在芒
果［7］，枣［8］、李［9 － 10］、葡萄［11］、柑桔［12］、核桃［13］、
梨［14］等果树新品种鉴定及遗传多样性中得到应
用。ISSＲ即简单重复序列间扩增(inter － simple
sequence repeat) ，是一种新型的分子标记技术，
1994 年由加拿大蒙特利尔大学 Zietkiewice［15］等
提出。它集合了随机引物扩增多态 DNA(random
amplified polymorphic DNA，ＲAPD)和简单重复序
列(simple sequence repeat，SSＲ)标记技术的优
点，与以前分子标记相比，更能够提供多的基因组
DNA信息并且多态性高，稳定性强。【本研究切
入点】在国内外研究中对新疆野杏遗传多样性的
9 期 曹倩等:基于 ISSＲ分子标记分析新疆野杏遗传多样性
报道很少。研究采用 ISSＲ 分子标记技术对新疆
野杏进行多样性探讨。【拟解决的关键问题】采
集新疆霍城县大西沟各区域野杏单株材料，利用
分子标记技术中 ISSＲ 标记揭示新疆野杏的遗传
多样性。
1 材料与方法
1． 1 材 料
供试 61 份野杏材料取自新疆伊犁地区霍城
县大西沟。2014 年 5 月中旬，从野杏新梢上摘取
幼嫩叶片，放置在有硅胶袋中干燥带回实验室，用
液氮迅速磨样后置于 － 80℃冰箱保存备用。采样
时，沿大西沟河沟由低海拔至高海拔在野杏分布
区随机选取，采样间隔距离 100 m 以上。采样区
域海拔 1 025． 9 ～ 1 204． 9 m，N44°23 ＇20． 360 ～
44°26＇16． 919，E80°45＇41． 618 ～ 80°47＇05． 715。
1． 2 方 法
1． 2． 1 缓冲液配制
CTAB提取缓冲液的配制:采用改良的 CTAB
法［16 － 17］。
1． 2． 2 DNA提取
1． 2． 2． 1 将冷冻干燥样品用液氮研磨成粉末，转
移到离心管，加入 750 mL 65℃预热的 CTAB提取
液，65℃保温 45 min以上，间或轻摇混匀;再加入
12 μL β －巯基乙醇，将其混匀，放置于热浴锅中
45 min，每 9 min摇晃一次，冷却。
1． 2． 2． 2 在 4℃的离心机中，12 000 r /min，15
min，取上清。
1． 2． 2． 3 取得的上清中加入 750 μL氯仿异戊醇
(24∶ 1) ，然后缓慢倒管 15 min，再离心 15 min，12
000 r /min，取上清 600 μL，加入 5 M NaAC 150
μL，冰浴 20 min．
1． 2． 2． 4 加入 600 μL氯仿异戊醇(24∶ 1) ，缓慢
倒管 15 min，再离心 15 min，12 000 r /min，取上清
400 μL，加入 3 M NaAC 40 μL，加入 800 μL预冷
的无水乙醇，放入 － 20℃冰箱 30 min，再离心 15
min，12 000 r /min，弃上清。
1． 2． 2． 5 用 75%预冷的乙醇 500 μL 洗涤一次，
离心，再用预冷的无水乙醇 700 μL 洗涤两次，弃
上清。
1． 2． 2． 6 离心管倒扣晾干。
1． 2． 2． 7 灭菌水 50 μL溶解，4℃保存或 － 20℃。
1． 2． 2． 8 取 4 μL DNA 样液，加入 1 μL 上样缓
冲液，充分混匀后用 0． 8%的琼脂糖凝胶电泳检
测基因组 DNA的完整程度。
1． 2. 3 ISSＲ分析
1. 2. 3. 1 引物选取
引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供
的 100 条 ISSＲ引物，选择 21 条电泳条带清晰，重
复性及多态性高的 ISSＲ引物，由北京六合华大基
因科技股份有限公司合成，分别是 UBC807、808、
811、813、822、823、825、826、836、841、843、844、
845、850、853、854、859、876、881。
1. 2. 3. 2 PCＲ扩增和优化体系
基本反应体系参照刘威生等［18］的杏 ISSＲ 反
应体系优化，最终确定试验的 PCＲ反应体积为 20
μL，内含 1 × PCＲ反应缓冲液:双蒸水 14． 2 μL ，
10 × Buffer(含 Mg2 +)2 μL;1． 6 μL dNTP，1 μmol /
L引物，0． 2 μL TaqDNA 聚合酶(Promega) ，1 μL
DNA。
1. 2. 3. 3 PCＲ扩增条件
预变性 94℃5 min，变形 94℃45 s，退火 52℃
1 min，延伸 72℃ 1． 5 min，40 个循环，后延伸 72℃
5 min。Pause 4℃，10 min。
1. 2. 3. 4 PCＲ 扩增产物检测
PCＲ产物用 2%琼脂糖凝胶电泳分析，1 ×
TAE，电压 120 V /cm，电泳 40 min 左右。EB 染
色，紫外投射仪照相。
1． 3 数据统计
根据拍照所得的电泳图，以清晰可见的条带
为标准，对于同一引物的扩增产物，在相同迁移位
置上出现的条带记为 1 个位点并记为 1，无条带
记为 0，将数据录入 Excel 建立 1、0 矩阵。用
POPGENE32 软件进行遗传多样性分析，用 NT-
SYSps软件中的 SIMQUAL 程序计算出遗传相似
系数，获得相似系数矩阵，再用其中的 SAHN程序
和 UPGMA法进行聚类分析，最后通过 Tree － plot
程序生成聚类图［19］。计算不同引物的多态性百
分比和等位位点信息含量多样性指数 PIC。
2 结果与分析
2. 1 大西沟野杏 ISSＲ遗传多态性分析
扩增产物通过高浓度的琼脂糖凝胶电泳检
测，拍得电泳图清晰，多态性较好。在所有电泳图
1061
新疆农业科学 52 卷
中，以引物为 UBC807 的 ISSＲ － PCＲ 部分图谱为 例，清楚的反应出电泳凝胶结果。图 1
图 1 引物 UBC807 在部分大西沟野杏材料中 ISSＲ － PCＲ扩增
Fig． 1 Amplification profiles for partial individuals of Daxigou using UBC807
21 条引物共检测出 437 个位点，其中多态性
位点 408 个，占总位数的 93． 36%。每条引物可
扩增出 11 ～ 29 个多态性位点，平均每条引物产生
19． 43 个，多态性比率达到 92． 46%，引物平均多
样性信息指数(PIC)为 0． 91。其中引物 UBC835
检测出的多态性位点数最高，获得了 29 个扩增位
点并全部具有多态性并且该引物的多样性信息指
数(PIC)也是最高，达到 0． 94。多态性相对较低
的引物有 UBC836 和 UBC843，分别为 72． 22%、
76． 92%。说明 ISSＲ 能检测到较多的遗传位点，
能获得多态性较好的 PCＲ 结果。61 个野杏单株
的遗传多样性较为丰富。表 1
表 1 ISSＲ引物扩增结果及多态性
Table 1 Amplification results and polymorphism of ISSＲ primers used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Primer
sequences
退火温度(℃)
Annealing
temperature
扩增总带数
Total bands
多态性带数
Polymorphic
bands
多态性(%)
Polymorphism
percentage
引物多态性信息量
PIC polymorphism
information content
UBC807 (AG)8 T 56 23 22 95． 65 0． 93
UBC808 (AG)8 C 59 25 24 96 0． 91
UBC811 (GA)8 C 59 24 24 100 0． 91
UBC813 (CT)8 T 49 13 11 84． 62 0． 85
UBC822 (TC)8A 48 17 14 84． 35 0． 89
UBC823 (TC)8 C 55 24 23 95． 83 0． 9
UBC825 (AC)7ATA 58 24 24 100 0． 93
UBC826 (AC)8 C 52 18 13 72． 22 0． 89
UBC834 (AG)8YT 51 17 16 94． 12 0． 88
UBC835 (AG)8YC 53 29 29 100 0． 94
UBC836 (AG)8YA 54 21 19 90． 48 0． 92
UBC841 (GA)8YC 56 19 17 89． 47 0． 92
UBC843 (CT)8ＲA 53 13 10 76． 92 0． 87
UBC844 (CT)8ＲC 57 23 23 100 0． 92
UBC845 (CT)8ＲG 49 20 17 85 0． 92
UBC850 (GT)8YC 59 24 22 91． 67 0． 93
UBC853 (TC)8ＲT 51 19 17 89． 47 0． 9
UBC854 (TC)8ＲG 55 16 16 100 0． 87
UBC859 (TG)8ＲC 53 18 18 100 0． 91
UBC876 (GATA)2(GACA)2 49 24 23 95． 83 0． 92
UBC881 GGGT(GGGGT)2G 56 26 26 100 0． 92
合计 Total － － 437 408 － －
平均数 Mean － － 20． 81 19． 43 92． 46 0． 91
2． 2 遗传多样性分析
根据 POPGENE32 软件的计算结果，61 个野
杏单株的平均有效等位基因数(Ne)为 1． 577 5，
Nei’s基因多样性指数(H)为 0． 334 1，Shannon信
息多样性指数(I)为 0． 499 0。各位点遗传多样性
程度存在较大差别，Nei 遗传多样性指数大小从
2061
9 期 曹倩等:基于 ISSＲ分子标记分析新疆野杏遗传多样性
0． 032 2 到 0． 499 9，标准误(SD)为 0． 155 2。
Shannon信息多样性指数最大值为 0． 693，最小值
为 0． 083 6，标准误(SD)为 0． 197 2。结果表明，
随机选野杏单株间具有丰富的遗传变异。
2． 3 聚类分析
利用 21 个 ISSＲ 引物共产生 437 条条带，计
算试验材料之间的遗传相似系数(GS)。61 份野
杏单株的相似系数在 0． 62 ～ 0． 95，说明所选取的
野生杏单株在分子水平上具有较大的差异，其遗
传多样性较为丰富，平均值为 0． 78。27 号和 28
号的相似系数最大，为 0． 95，表明这两个单株的
亲缘关系最近，遗传相似程度是最高的。
试验结果数据以 0、1 的形式记入 EXCEL中，
再利用 NTSYS － PC2． 1 软件进行数据转换分析，
根据 ISSＲ 标记计算的遗传相似系数矩阵，对 61
个单株进行 UPGMA聚类分析，结果表明，在相似
系数约 0． 74 处，61 份材料可分为 4 大类，第一类
中有 24 份，1 － 4、7 － 15、17、19 － 28 号;第二类有
54 － 61 号;第三类为 29 － 49、51 － 53 号;第四类
为 5、6、16、18 和 50 号。各大类里的野杏单株间
相似系数也各有差异，但是可以看出各个单株在
相似系数 0． 62 处聚为一类。图 2
图 2 61 个野杏株系 ISSＲ聚类
Fig． 2 ISSＲ cluster analysis chart
for 61 materials of wild apricot
3 讨 论
遗传多样性是生物多样性的基础，是重要的
生物资源［20］。研究选用 21 条 ISSＲ 引物 PCＲ 扩
增共产生了 437 条扩增带，其中有 408 条具有多
态性，61 份野杏多态性位点平均比率为 92. 46%，
而东北地区的西伯利亚杏的多态性比率为
76. 74%［21］，多态位点百分率是衡量物种遗传变
异水平高低的一个重要指标，是度量遗传多样性
的重要参数［22］。谢佳等［23］的研究中，对 92 份杏
种质资源利用 ISSＲ 分子标记进行遗传多样性分
析，多态性比率为 96． 5%，冯晨静等［24］14 份杏种
质的 ISSＲ分析中，其多态性位点比率为 90%，研
究得出新疆霍城县大西沟野杏的多态性比率为
92. 46%，大西沟野杏长期处于自然实生繁殖状
态，有 较 高 的 遗 传 多 样 性，与 Carlos S 等
(2003)［25］、Spiegel S等(2004)［26］认为“伊犁野杏
种群蕴涵着丰富的遗传多样性种质”的结论相一
致。
通过 POPGENE32 软件对 61 份野杏的遗传
多样性进行分析，遗传多样性指数(多态性百分
率、Nei’s 基因多样性指数、Shannon 信息多样性
指数)综合显示野杏遗传变异较高，大西沟野杏
具有丰富的遗传多样性。
ISSＲ标记技术所产生的 0、1 矩阵数据，通过
NTSYS － PC2． 1 软件对 61 个野杏株系进行 UPG-
MA法聚类分析，得出遗传相似系数(GS)在 0． 62
～ 0． 95，若以相似系数 0． 74 为阀值，61 份野杏株
系可分为 4 大组。在相似系数 0． 62 处 61 份野杏
单株聚为一类。该 61 份野杏的亲缘关系较近，野
杏 27 号和 28 号的相似系数都为 0． 95，表明这两
个单株的亲缘关系最近。艾呈祥等［27］也提出来
源地相同的物种其亲缘关系较为密切。
4 结 论
利用 ISSＲ分子标记技术对新疆伊犁地区霍
城县大西沟的野杏进行遗传多样性分析。用 21
条引物对 61 份野杏单株进行 PCＲ 扩增，扩增结
果显示，多态性比率达到 92. 46%;从软件的分析
结果显示，有效等位基因数(Ne)、Nei’s 基因多样
性指数(H)和 Shannon 信息多样性指数(I)分别
为 1. 577 5、0. 334 1、0. 499 0;引物平均多样性信
息指数(PIC)也较高，说明野杏具有丰富的遗传
多样性。ISSＲ标记聚类分析中，各单株间的相似
遗传系数在 0. 62 ～ 0. 95，表现出较大的遗传差异
性。大西沟野杏的遗传相似度较高，其亲缘关系
较近。
3061
新疆农业科学 52 卷
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新疆农业科学 52 卷
Analysis of Daxigou Wild Apricot Genetic Diversity in
Xinjiang Based on ISSＲ Molecular Markers
CAO Qian，LIAO Kang，LIU Juan，SUN Qi，LIU Huan，FENG Bei － bei
(Ｒesearch Center of Featured Fruit Trees，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)
Abstract:【Objective】Through the analysis of ISSＲ markers，this project aims to analyze the genetic diversity
of Xinjiang wild apricot germplasm resources and provide theoretical basis for utilization and protection of the
resources and technical support．【Method】Using ISSＲ markers，analysis of 61 samples of Daxigou wild apricot
plant of genetic diversity．【Ｒesult】The selection of 21 primers for PCＲ amplification of samples，a total of 437
amplified bands，of which 408 bands were polymorphic，percentage of polymorphic bands was 92. 46% ．
Through the software to calculate the effective number of alleles (Ne) ，Nei ＇s gene diversity index (H)and
Shannon information diversity index (I)were 1． 577 5，0． 334 1，0． 499 0． On average，primer information di-
versity index (PIC)was 0． 91，showing that the genetic diversity of wild apricot was relatively rich． By using
the NTSYS － PC2． 1 software，UPGMA clustering，various sample of the genetic similarity coefficient was be-
tween 0． 62 － 0． 95． Eventually．【Conclusion】Xinjiang wild apricot had very abundant genetic diversity，and
genetic polymorphism ratio reached over ninety percent． On average，the primer information diversity index
(PIC)was higher，close to 1． 61 copies of wild apricot genetic relationship were closer．
Key words:wild apricot;genetic diversity;ISSＲ
Fund project:Supported by Special Fund for Agro － scientific Ｒesearch in the Public Interest of China(201304701) ;Science and technology plan
projects of the Xinjiang Uygur Autonomous Ｒegion － Key technology integration and demonstration of high efficiency and safety production of Xin-
jiang characteristic fruit trees(201130102) ;Key Discipline Fund of Pomology of Xinjiang Uygur Autonomous Ｒegion．
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