全 文 ：果 树 学 报 2013，30（1）: 8～15
Journal of Fruit Science
基于 SSR标记的清凉峰地区
三叶海棠遗传多样性研究
孙 萍，宗 宇，刘 晶，胡春云，滕元文 *
（浙江大学园艺系·农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室，杭州 310058）
摘 要: 【目的】评价清凉峰地区三叶海棠的遗传多样性水平，为其保护提供理论依据。 【方法】利用 10 对 SSR 引物，
对清凉峰地区的 36 份三叶海棠样品进行了遗传多样性分析， 并从中随机抽取 6，9，12，15，18，27，34 株大小不同的
样本，组成 7 个群体进行遗传多样性特征比较。 【结果】（1）10 对引物在 36 份样品中的多态性等位基因数（Na）平均值
为 7.1（5.0~10.0），有效等位基因数（Ne）平均值为 3.954（1.527～5.786），平均观察杂合度（Ho）为 0.781（0.194～1.000），
平均期望杂合度（He）为 0.699（0.345～0.827），香农多样性指数（I）平均值为 1.458（0.662～1.918）；（2）采用 UPGMA 法
构建的系统树中，很明显地将 36 份供试样品划分为两组，与用贝叶斯聚类方法得到的结果一致，对三叶海棠所有样
品进行的主成分分析进一步证实了以上结果；（3）群体样本量≥15 株时，样本量就不会对群体内遗传多样性水平、遗
传一致度及群体内等位基因数目产生明显的影响。 【结论】清凉峰地区三叶海棠的遗传多样性水平较高，其群体明显
分化为 2 个基因源，三叶海棠群体遗传多样性研究和种质收集保存中的适宜样本量为≥15 株，研究供试样品可以反
映清凉峰地区三叶海棠遗传多样性的总体水平。
关键词: 三叶海棠； SSR； 遗传多样性； 适宜样本量
中图分类号：S661．4 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2013)01－0008－08
Study on genetic diversity of Malus sieboldii in Qingliangfeng Region
based on SSR markers
SUN Ping， ZONG Yu， LIU Jing， HU Chun-yun， TENG Yuan-wen*
（The State Agricultural Ministry Key Laboratory of Horticultural Plant Growth， Development and Quality Improvement， Department of Hor-
ticulture， Zhejiang University， Hangzhou，Zhejiang 310058 China）
Abstract：【Objective】The aims of this study were to assess the genetic diversity and to provide needed in-
formation for the development of conservation strategies for Malus sieboldii in Qingliangfeng region.
【Method】Ten pairs of SSR (Simple Sequence Repeats） primers were used to evaluate genetic diversity of
36 accessions. Seven populations with different sample sizes （6， 9， 12， 15， 18， 27 and 34 plants） were
established by randomly selecting from 36 individuals， and used to compare the characteristics of genetic
diversity with one another. 【Results】（1） The results showed that mean number of polymorphic alleles
（Na） was 7.1 （5.0 to 10.0）， effective alleles （Ne）per locus was 3.954 （1.527 to 5.786）， the observed
heterozygosity（Ho）was 0.781 （0.194 to 1.000）， the expected heterozygosity （He） was 0.699 （0.345 to
0.827）， and mean Shannon s information index（I）was 1.458 （0.662 to 1.918）. （2） Based on the UPGMA
cluster analysis， 36 samples were divided into two groups， which was similar to the results based on
Bayesian clustering method and the PCA （principal component analysis）； （3） The sample size would not
significantly affect the level of genetic diversity， genetic identity and numbers of rare alleles within popu-
lation when it was not less than 15. 【Conclusions】 The results indicated that Malus sieboldii in
Qingliangfeng region had a high level of genetic diversity and displayed a highly mixed population struc-
ture which represented the two gene pools. The suitable sample sizes for collection and conservation， and
the study on genetic diversity of Malus sieboldii were not less than 15. The accessions of Malus sieboldii in
收稿日期： 2012－09－26 接受日期： 2012－11－14
基金项目： 国家自然科学基金（31071780）
作者简介： 孙萍，女，硕士，主要从事梨属植物遗传多样性的研究。 Tel: 0571-88982803，E-mail: sunpingqau@163.com
觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 0571-88982803，E-mail：ywteng@zju.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2013.01.010
引物名称 Name of primer 连锁群 Linkage group 引物序列 Primer sequence 等位基因长度 Allele size range/bp
CH02D08
CH01F02
CH03G12
CH02B10
CH01H01
Hi21e04
Hi02f06
MES122
MES17
KA14
11[14]
12[14]
1[14]
2[14]
17[14]
14[15]
15[15]
-*
-*
16[18]
F TCCAAAATGGCGTACCTCTC
R GCAGACACTCACTCACTATCTCTC
F ACCACATTAGAGCAGTTGAGG
R CTGGTTTGTTTTCCTCCAGC
F GCGCTGAAAAAGGTCAGTTT
R CAAGGATGCGCATGTATTTG
F CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAG
R CAAGTGGCTTCGGATAGTTG
F GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
R GGAGTGGGTTTGAGAAGGTT
F TGGAAACCTGTTGTGGGATT
R TGCAGAGCGGATGTAAGTTG
F TAAATACGAGTGCCTCGGTG
R GCAGTTGAAGCTGGGATTG
F AAGAAGCGAACAAGGGAA
R GCAGCCATTGGATAAGAA
F TGAGTCCACAGAACAGCACCAA
R GAGCGAACAGTCTCCAAGCAAA
F TCATTGTAGCATTTTTATTTTT
R ATGGCAAGGGAGATTATTAG
210~254
174~206
154~200
121~159
114`134
134~161
204~228
99~133
193~199
178~206
表 1 SSR 引物及扩增的长度
Table 1 SSR primer sequences and allele size
孙 萍等: 基于 SSR 标记的清凉峰地区三叶海棠遗传多样性研究
this study could reflect the whole level of genetic diversity in Qingliangfeng region.
Key words: Malus sieboldii； SSR； Genetic diversity； The suitable sample size
三叶海棠 [Malus sieboldii（Regel）Rehd.]是蔷薇
科（Rosaceae）苹果属（Malus Mill.）的多年生木本植
物，是重要的苹果砧木资源[1]。 世界地域范围内主要
分布在中国、日本和朝鲜等地。在中国三叶海棠分布
于从南到北的十多个省区[2]。位于浙江临安和安徽绩
溪交界处的清凉峰地区， 由于国家自然保护区的设
立，保存了较完整的三叶海棠的自然居群 [3]，但迄今
为止还缺乏对其遗传多样性的评价。
随着分子生物学技术的发展， 利用分子标记检
测植物的遗传多样性水平， 在其他苹果属植物如小
金海棠 [4]、变叶海棠 [5]、山荆子 [6]、新疆野苹果 [7]、观赏
海棠[8]等都得到了应用。 然而迄今为止，对三叶海棠
的研究主要集中在其作为苹果砧木的抗性生理 [1]、
营养成分和生物学特性[9]等方面。 近年来，微卫星荧
光标记技术由于其高度智能化的特点， 工作效率
高，数据准确[10]，已经广泛应用到遗传多样性的研究
中[11-12]。为此，研究运用微卫星荧光标记技术，对清凉
峰地区的 36 份三叶海棠样品的遗传多样性进行分
析，并从中随机抽取 6，9，12，15，18，27，34 株不同大
小的样本量组成 7个群体进行遗传多样性特征的比
较，以期从 DNA 水平上分析该地区三叶海棠的遗传
多样性水平， 为今后更加合理地收集和保存三叶海
棠种质资源提供参考和理论依据。
1 材料和方法
1.1 植物材料
供试的 36 份样品采自位于浙江省临安市与安
徽省绩溪县交界的清凉峰地区的三叶海棠自然居
群。于春季采集生长状况良好植株的健康幼嫩叶片，
按采集顺序编号， 放入装有变色硅胶的自封塑料袋
中，迅速干燥，带回实验室，用于 DNA 提取。 为了使
采集的样品具有代表性和避免采集植株的遗传一致
性，从居群的某一植株开始，散射状采集而且保证采
集单株之间的间隔大于 20 m。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用 CTAB法[13]从硅胶干燥的叶片
中提取总 DNA，稀释到 10~30 mg·L-1，储存在-20 ℃
备用。
1.2.2 SSR 标记 随机抽取 8 个样品的 DNA 用 62
对 SSR 引物进行扩增， 将扩增产物在 6%的聚丙烯
酰胺凝胶上 60 W 功率下电泳约 2.5 h， 电泳后银染
显色。 Bio-Rad Gel Doc 2000 凝胶成像仪 （Bio-Rad
Laboratories，Hercules，CA，USA）拍照记录。 从 62 对
SSR 引物中筛选出 17 对扩增条带清晰稳定且多态
性丰富的引物，因其中部分引物位于相同的连锁群上，
遗传距离较近， 所以对位于相同连锁群的引物进行
筛选， 选出位于不同连锁群的 10 对引物进行 SSR
扩增。 筛选出的 10 对引物包括从苹果属植物中开
发 的 7 对基因组 SSR 引物 : CH02D08、CH01F02、
CH03G12、CH02B10、CH01H01[14]、Hi21e04、Hi02f06[15]，
2 对 EST-SSR 引物 : MES122、MES17[16]及梨属中开
发的基因组 SSR 引物 KA14[17]（表 1）。 为了实现微卫
注: * 未定位。 Note: *Undetect.
1 期 9
果 树 学 报 30 卷
表 2 三叶海棠不同 SSR 位点遗传多样性特征
Table 2 The characteristics of genetic diversity of different SSR loci in Malus sieboldii
星多态性的荧光半自动检测， 对筛选好的引物进行
荧光修饰，在单向引物的 5’端加上荧光修饰基团，
荧光引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
PCR体系总体积为 15 μL， 其中包括模板 DNA
10~20 ng， 上、 下游引物各 0.4 μmol·l-1，dNTP 200
μmol·L-1， MgCl2 2.0 mmol·L-1，0.5 U Taq DNA 聚合
酶 （TaKaRa）。 PCR 反应在 Eppendorf 公司的 96 孔
Mastercycler Gradient PCR 仪上进行， 其中 CH 系列
引物的反应程序为 94 ℃预变性 2.5 min，94 ℃变性
30 s，65 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min 共 4 个循
环，每次循环后退火温度降低 1 ℃；然后 94 ℃变性
30 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min， 共 30 个循
环，最后 72℃延伸 5 min，4℃保存[19]。 KA 系列引物
的反应程序为 94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 1 min，
60℃退火 1 min，72℃延伸 2 min 共 10 个循环，每次
循环后退火温度降低 0.5℃； 然后 94℃变性 1 min，
55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min， 共 25 个循环，最
后 72℃延伸 5 min，4 ℃保存[17]。 其余引物的反应程
序是 94 ℃预变性 3 min ，94 ℃变性 40 s，55 ℃退火
40 s，72℃延伸 40 s共 35个循环， 最后 72℃延伸 6
min，4℃保存 [16]。 对 PCR产物用灭菌后的双蒸水稀
释，利用 MegaBASE 1000 测序系统（Amersham Bio-
sciences）检测并测序。
1.3 数据分析
将测序结果导入软件 Genetic Profile v 1.0（Molec-
ular Dynamics），参照峰值强度及分子内标的大小，确
定微卫星位点扩增片段的区间， 对片段大小进行统
计，对于出现多峰型的样品，重新进行 PCR 试验后
再确定其片段大小， 统计结果保存为 Excel 格式以
备后续分析。
利用遗传数据分析软件 GenAlEx 6.3[20]计算多
态性等位基因数 （Na），SSR位点的有效等位基因数
（Ne），观察杂合度（Ho），期望杂合度（He），固定指数
（F）及香农多样性指数（I）等遗传多样性指标。
使用 NTSYS pc 2.10e 软件计算样品的 Jaccard
遗传相似系数矩阵，按 UPGMA 法建立 36 个供试样
品的亲缘关系树状图；并基于样品间欧氏距离对 36
个样品进行主成分分析（PCA）并进行二维作图[21]。
使用 STRUCTURE version 2.3.3 进行贝叶斯聚
类[22]，分析群体的遗传结构并确定最佳的群体分组。
首先设定 K=1~5， 设定 Burn-in 周期为 100 000，
MCMC 的重复次数为 100 000 次， 采用混合模型和
相关等位基因频率， 对不同的 K 值进行 10 次重复
运行，然后将后缀为“_f”的结果文件压缩，上传到
“STRUCTURE HARVESTER” 网站（http://taylor0.bi-
ology.ucla.edu/ struct_harvest/）， 通过 deltaK 确定最
佳 K值[23]。
利用 POPGENE version 1.31 软件进行三叶海棠
不同大小群体量之间遗传多样性比较、 稀有等位基
因数目的计算以及聚类分析[24]。
2 结果与分析
2.1 群体内遗传多样性及遗传结构分析
2.1.1 SSR 扩增产物的多态性 10 对引物在 36 份
样品中的多态性等位基因数（Na）从 5（CH02B10 和
KA14）到 10（CH01F02），平均等位基因数为 7.1（表
2）。 每份样品每对引物产生 2个相同（单峰）或不同
（双峰）的等位基因。 有效等位基因数（Ne）从 1.527
（CH02B10）到 5.786（CH01F02），平均值为 3.954。本
研究中观察杂合度（Ho）为 0.194~1.000，平均值为
0.781。 期望杂合度（He）为 0.345~0.827，平均期望杂
合度为 0.699。 Shannon香农多样性指数（I）为 0.662
~1.918， 平均值为 1.458。 而固定指数 （F） 只有在
CH01F02、CH02B10 以及 MES17 中为正值， 其余均
为负值，说明三叶海棠群体内含有较多的杂合子。
2.1.2 聚类分析 基于 SSR 数据对 36 份供试样品
引物
Primer
等位基因数
Na
有效等位基因数
Ne
香农指数
I
观察杂合度
Ho
期望杂合度
He
固定指数
F
CH02D08
CH01F02
CH03G12
Hi21e04
CH02B10
MES122
Hi02f06
MES17
KA14
CH01H01
Mean
9
10
8
6
5
6
7
8
5
7
7.1
5.236
5.786
4.401
5.004
1.527
3.323
3.915
4.477
1.876
3.993
3.954
1.803
1.918
1.594
1.665
0.662
1.359
1.518
1.725
0.807
1.526
1.458
0.833
0.806
1.000
1.000
0.194
0.917
0.972
0.667
0.571
0.853
0.781
0.809
0.827
0.773
0.800
0.345
0.699
0.745
0.777
0.467
0.750
0.699
-0.030
0.026
-0.294
-0.250
0.436
-0.311
-0.306
0.142
-0.224
-0.138
-0.095
10
1 期
图 2 STRUCTURE 分析得出 K 的数目
Fig. 2 Modeling of number of genepools inMalus sieboldii
using STRUCTURE. L（K）（mean ± SD） and Delta K，
calculated according to Evanno et al.， plotted against the
number of modeled gene pools （K）
孙 萍等: 基于 SSR 标记的清凉峰地区三叶海棠遗传多样性研究
进行聚类分析，构建亲缘关系树状图（图 1）。 从树状
图的分析可以得出: 在阈值 0.60 处，36 份三叶海棠
样品被分成 2 组，其中 A 组包含 20 份样品，而 B 组
有 16份样品。 在阈值 0.79处，A组又被分成 3个亚
组， 样品 1、13、14、32、33 和 35， 样品 2、10、15、16、
18、19、20、22、25、26、28、31 和 36 分别聚成 1 个亚
组， 而样品 21 与 A 组的其他样品表现出较大的遗
传距离，独立成为 1 个亚组。 B 组包括 2 个亚组，样
品 3表现特殊，单独成为 1个亚组。
各供试样品间的相似系数介于 0.514~1.00，其

Coefficient
0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
10
1
13
35
14
32
33
2
18
26
15
25
22
36
28
16
31
10
19
20
21
3
4
29
9
11
5
30
24
34
7
23
17
6
8
12
27
图 1 基于遗传相似系数的 UPGMA 聚类分析
Fig. 1 The UPGMA dendrogram based on similarity coefficient
Coefficient
0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
1
3
5
4
2
3
2
8
6
5
5
2
6
8
6
1
0
9
0
1
3
4
9
9
1
5
0
4
4
7
3
7
6
8
2
7
中样品 18 与 26， 样品 22 与 36 的相似系数最大
（1.00），样品 5 与 20，3 与 19 及 3 与 20 的相似系数
最小（0.514）（数据未列出）。
2.1.3 群体遗传结构分析 将 36 个样品的 K 值设
为 1~5，进行贝叶斯遗传分析，运行 5 次重复后，发
现最适 K值为 2（图 2）。
使用 STRUCTURE 软件得到了与 UPGMA 聚类
分析相似的结果， 根据似然值的对数函数确定最佳
类群数为 K=2，当 K＞2 时，同一 K 值不同运行重复
间波动幅度非常大。
在 K=2 的情况下，将 36 份供试样品分为 2 组，
以绿色为主的 20 份供试样品视为 A 组， 以红色为
主的 16 份供试样品视为 B 组。 其中部分样品表现
为 2个基因池的混合， 样品 21、32、1、35、33 以绿色
为主体，构成 A 组中的 1 个亚组；样品 8、17 和 6 以
红色为主体，构成 B 组的第 1 亚组，由于样品 27 中
红绿的比例与其他的差别较大，可以认为是在 B 组
中独立成为第 2亚组（图 3）。
对三叶海棠所有样品进行的主成分分析， 进一
步证实了以上的结果，PCA 结果（图 4）显示，36 个
样品被明显分成 2组， 表明三叶海棠之间产生了一
定的遗传分化。在右侧的一组中可以分成 2个亚组，
其中样品 21与其他样品之间有一定的界限。左侧的
一组样品中，样品 27也表现出与其他样品之间存在
Ln
P（
K
）
LnP（K）
Delta K
0
-300
-600
-900
-1200
800
600
400
200
0
De
lta
K
1 2 3 4 5
K
A 组
B 组
11
果 树 学 报 30 卷
图 4 36 份试验材料的主成分分析
Fig. 4 Principal component analysis of 36 samples
图 3 用 STRUCTURE 计算的 K=2 时，不同样品间的分组情况
Fig. 3 Results of the model based clustering（K=2）of the different number of samples
一定的差异。
2.2 不同大小样本量群体的遗传多样性分析
2.2.1 不同大小样本量群体的遗传多样性参数比较
因供试的 36 株三叶海棠单株的聚类分析中，18
与 26 及 22 与 36 的遗传相似系数分别为 1，所以在
下面的研究中去掉了 18 及 22 号样本，从剩余的 34
株单株中，随机抽取 6，9，12，15，18，27，34 株组成具
有不同样本数量的 7个群体进行遗传多样性的比较
（表 3）。 随着样本量的增加，平均等位基因数（Na）、
有效等位基因数（Ne）、香农多样性指数（I）呈上升的
趋势。 通过比较可以看出 Control（34）与Ⅰ（6）的差
别最大，平均等位基因数（Na）分别为 7.1 和 4.1，有
效等位基因数（Ne）分别为 4.02 和 3.035，香农多样
性指数（I）分别为 1.472 和 1.169，表明样本量的大
小影响了群体的遗传多样性的分析结果。 但是在样
本量大于 15 株以后，Ne 与对照组 Control（34）的差
5 23 34 11 9 29 30 12 7 24 3 4 6 17 8 27 18 22 31 25 26 36 15 2 13 16 19 20 10 28 14 21 32 1 35 33
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0.51
0.32
0.12
-0.07
-0.26
Di
m
-2
-0.68 -0.38 -0.08 0.22 0.52
Dim-1
群体
Population
等位基因数
Na
有效等位基因数
Ne
香农指数
I
观察杂合度
Ho
期望杂合度
He
Ⅰ（6）
Ⅱ（9）
Ⅲ（12）
Ⅳ（15）
Ⅴ（18）
Ⅵ（27）
Control（34）
4.100
5.000
5.600
6.100
6.200
6.800
7.100
3.035 a
3.711 b
3.852 bc
4.090 d
4.135 d
4.040 d
4.020 d
1.169
1.367
1.410
1.476
1.479
1.475
1.472
0.883
0.853
0.839
0.770
0.769
0.787
0.774
0.628
0.690
0.693
0.716
0.712
0.704
0.703
注：表中第 3 列数据后的小写字母表示在 0.05 水平上的差异显著性。
Note: The different small letters within the third column mean significant differences at P<0.05 level.
表 3 不同大小样本量的遗传多样性参数比较
Table 3 Comparison of genetic diversity parameters among populations with different sample sizes
12
1 期
表 5 不同样本量群体内稀有等位基因数目的变化比较
Table 5 Comparison of variation of rare alleles among populations with different sample sizes
群体
Population
稀有等位基因数
No. of the rare alleles
与对照共有的稀有等位基因数
No. of the rare alleles between control and treatment
变化数（丢失数/增加数）
Change (lose or increase)
Ⅰ（6）
Ⅱ（9）
Ⅲ（12）
Ⅳ（15）
Ⅴ（18）
Ⅵ（27）
Control（34）
0
0
15
19
17
26
30
0
0
14
16
17
26
30
30/0
30/0
16/1
14/3
13/0
4/0
0/0
Ⅰ（6） Ⅱ（9） Ⅲ（12） Ⅳ（15） Ⅴ（18） Ⅵ（27） 对照Control（34）
Ⅰ（6）
Ⅱ（9）
Ⅲ（12）
Ⅳ（15）
Ⅴ（18）
Ⅵ（27）
Control（34）
- 0.969
-
0.957
0.987
-
0.898
0.961
0.968
-
0.884
0.949
0.955
0.995
-
0.936
0.974
0.978
0.987
0.987
-
0.905
0.960
0.962
0.988
0.991
0.995
-
表 4 不同大小样本量的遗传一致度比较
Table 4 Comparison of genetic distance among populations with different sample sizes
孙 萍等: 基于 SSR 标记的清凉峰地区三叶海棠遗传多样性研究
异不显著。 各群体的观察杂合度（Ho）随着样本量增
加有下降的趋势，在样本量大于 15 株以后 Ho 表现
较小的差异，而期望杂合度（He）在Ⅳ（15）中表现出
最大值（0.716）。 综合考虑各群体间的遗传多样性参
数，只要保证样本量不小于 15 株，样本量的大小就
不会对群体内遗传多样性水平产生明显的影响。
2.2.2 不同大小样本量群体的遗传一致度分析 从
各群体的遗传一致度的程度来看（表 4），与 Control
（34）的遗传一致度最大的是Ⅵ（27），遗传一致度为
0.995，最小的是Ⅰ（6），遗传一致度为 0.905。 随着样
本量的增加， 遗传一致度逐渐升高表明样本量的大
小对遗传一致度有一定的影响。当样本量大于 15株
以后，与 Control（34）遗传一致度的差异就不明显
了，所以样本取样量大于等于 15株就足以代表整个
群体的水平。
2.2.3 稀有等位基因在不同大小样本量群体内的变
化分析 稀有等位基因是指群体内其基因频率低于
5%的等位基因。群体内的遗传多样性差异很大程度
上是由于稀有等位基因结合或综合到基因型背景
中。因群体样本量的不同，会造成稀有等位基因数目
的增加或缺失，从而造成等位基因数目的变化。由表
5 可以看出，Ⅰ（6）和Ⅱ（9）的稀有等位基因数明显
的低于 Control（34），与对照共有的等位基因数随着
样本量的增加呈递增的趋势， 而其丢失数呈递减的
趋势。 样本量大于 12株以后，稀有等位基因丢失数
目的差异很小，样本量大于 18 株以后，群体本身所
有的稀有等位基因数目同与对照组 Control （34）共
有的稀有等位基因数目相等。 表明样本量的大小影
响稀有等位基因的数目， 样本量的增加可以增加稀
有等位基因的数目，从而可以影响等位基因的数目。
3 讨 论
3.1 三叶海棠群体的遗传多样性及遗传结构
本试验结果表明， 清凉峰地区三叶海棠的遗传
多样性较丰富（He=0.699，I=1.458，Ne=3.954），高于
湖北海棠 [25] [Malus hupehensis （Pamp.）Rehd.、 （He=
0.262 8， I=0.401 5， Ne=1.437 5）]、变叶海棠 [5] [Malus
toringoides （Rehd.）Hughes.（He=0.438 9，I=0.628 2，
Ne =1.81）]。 可能的原因之一是三叶海棠相比后两
者，无融合生殖能力较弱[26]，通过杂交进而获得了较
丰富的遗传变异。 与新疆野苹果 [27] [Malus sieversii
（Ledeb.）Roem（He=0.261 9，I= 0.408 2，Ne=1.425 2）]、
山荆子 [6] [Malus baccata（Linn.）Borkh.（H=0.3386，I=
0.496 1，Ne=1.602 1）]等自交不亲和的苹果属植物相
比较， 三叶海棠的遗传多样性也表现出较高的遗传
多样性水平。 在野外样品调查采集的过程中我们发
现，清凉峰地区由于设立自然保护区的缘故，三叶海
棠的分布未受到明显的人为破坏， 经过长时间的世
代更迭积累了丰富的遗传变异， 因此表现出较高水
平的遗传多样性。
STRUCTURE 的分析结果表明，所选 36 份样品
中存在 2个基因源， 部分样品表现为 2 个基因源的
13
果 树 学 报 30 卷
混合， 其中样品 27 表现的更为独特。 对三叶海棠
UPGMA 聚类分析发现 36 份样品明显分为 2 组，在
第 1 组中，样品 21 与其他样品相似系数较小，独立
成为 1个亚组，在第 2组中，样品 3独立成为 1 个亚
组。 主成分分析（PCA）同样将 36份海棠样品分成 2
组， 样品 21、27均表现出与各自所在组群的样品存
在一定的差异。 由于不同的分析方法所提供的信息
量不同导致不同的分析方法产生的结果并不完全一
致。 基于清凉峰地区三叶海棠表现出遗传结构的混
合和 2个基因源存在的事实， 清凉峰地区的三叶海
棠最适合进行就地保护， 从而最大程度地保存清凉
峰地区三叶海棠的遗传多样性水平。
3.2 三叶海棠群体遗传多样性研究中的适宜样本
量
样本量大小是影响种质遗传多样性和群体内遗
传结构分析的重要因素。 三叶海棠作为异花授粉的
植物，从理论上讲如果群体的样本量无限大，那么所
有的遗传特点全部呈现出来，但在实际的操作中，由
于人力、物力和财力多方面因素的影响，不可能采集
无限多的样本量， 而样本量过小则无法呈现出研究
对象的遗传特性； 群体内的遗传结构要得到完全的
体现， 稀有等位基因的分布与数目变化情况就要和
整个群体的保持一致。 所以找出一个适宜群体样本
量， 使得所选择的群体样本量能代表原始群体的遗
传多样性水平是至关重要的。 徐重益等 [28]在对菜薹
种质繁殖群体大小的研究发现:大于 30 株的群体能
代表 200 株整体群体的遗传多样性；班霆等 [29]在对
苜蓿遗传多样性的取样数目的研究中表明: 采用 40
个单株的 DNA混合样是较适宜的群体大小。本研究
通过随机抽样得到不同大小样本量的 7 个群体，通
过比较各群体的遗传多样性参数、 遗传一致度及不
同大小样本量群体内稀有等位基因数的变化情况，
表明只要保证样本量≥15 株，样本量的大小就不会
对群体内遗传多样性水平、 遗传一致度及群体内等
位基因数目产生明显的影响。 这与杨军等 [30]在对杜
梨实生繁殖群体的研究认为杜梨种质保存、 更新的
适宜群体量为 15株以上的研究结果相似。 因此，在
三叶海棠种质资源的遗传多样性研究中至少采集
15 株的样本量，就可以代表原始群体的遗传多样性
水平。 在迁地保护时，也应该至少有 15 株的保存量
才能保证其群体遗传多样性的完整保存。
综上所述， 浙江省临安市与安徽省交界的清凉
峰地区的三叶海棠具有较高的遗传多样性水平，群
体内也存在一定程度的遗传分化。 本研究也为三叶
海棠遗传多样性的保存提供了理论基础， 同时为我
国整个三叶海棠的遗传多样性的评价研究提供了借
鉴。
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