全 文 ：第 3 5卷第 3期 江　苏　林　业　科　技 Vol.3 5No.3
2 0 0 8年 6 月 JournalofJiangsuForestryScience＆Technology Jun.2 0 0 8
文章编号:1001-7380(2008)03-0010-05
红檵木组织培养玻璃化苗发生原因初探＊
尹　恒 1 ,唐前瑞 1 ,桂克印 2 ,陈　丽1 ,吴莉英1
(1.湖南农业大学园艺园林学院 ,湖南 长沙 410128;2.吉首大学城乡资源与规划学院 ,湖南 张家界 427000)
摘要:通过在培养基中加入不同质量浓度 6-BA、NAA、蔗糖 、琼脂 、活性碳并进行正交试验 , 得出影响红檵木玻璃化
苗发生的因素及其影响力大小顺序为 6-BA>活性碳 >琼脂 >NAA>蔗糖。 6-BA的质量浓度大于 2 mg/L, 会大大
增加玻璃化苗的产生。考虑到增殖率 , 应适当加入少量活性碳或聚乙烯醇。此外 ,减少继代次数 , 选择中部节段作
为外植体 , 也有利于玻璃化率的降低。
关键词:红檵木;玻璃化;6-BA;聚乙烯醇
中图分类号:S687　　文献标识码:A
Apreliminarystudyonthetissueculturetoovercomethevitrificationof
LoropetalumchinenseOlivervarrubrumYieh
YINHeng1 , TANGQian-rui1 , GUIKe-yin2 , CHENLi1 , WULi-ying1
(1.ColegeofHorticultureandLandscapeArchitecture, HANU, Changsha410128, China;
2.FacultyofUrbanandRuralResourcesandlandcapeArchitectureJishoucolege, Zhangjiajie427000, China)
Abstract:EfectofnaturalsubstancesonthevitrificationofplantletsofLoropetalumchinenseOlivervarrubrumYiehwas
studiedbyanorthogonaldesignexperiment.Theresultsshowedthat:6-benzyladenine>activatedcarbon>agaragar>NAA
>sugar.AndalsoaddstoadequatePVA, choosemidtwigmightreducethevitrificationrate.
Keywords:LoropetalumchinenseOlivervarrubrumYieh;Vitrificatio;6-Benzyladenine;Polyvinylalcohol
　　红檵木 (LoropetalumchinenseOlivervarrubrum
Yieh)又称红桎木 、红花檵木 、红檵花 ,系金缕梅科
(Hamamelidaceae)金缕梅亚科檵木属木本植物 [ 1] ,
为湖南特有的珍稀观赏树种。花叶俱美 ,四季景象
变化丰富 ,是园林应用最为广泛的彩叶植物 。据报
道 ,在红檵木离体快繁体系的建立过程中玻璃化现
象普遍存在 [ 2-3] ,严重影响了红檵木高效再生体系
的建立 。本文针对红檵木组织培养中出现的玻璃化
现象 ,从研究培养基组成成分 、外植体取材部位和继
代次数几个不同方面找寻玻璃化的影响因素 ,旨在
解决红檵木组织培养过程中的玻璃化现象 ,为红檵
木规模化生产提供参考 ,为种质离体保存提供前提 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
供试材料为红檵木无菌苗 。
1.2　试验方法
1.2.1　材料的获得　供试材料为从湖南农业大学花
卉基地采集的红檵木当年生茎段 ,以自上而下第 2节
段腋芽为外植体 ,经流水冲洗 40 min, 2%的次氯酸钠
液消毒 4min,再用 0.1%的 HgCl2消毒 10 min,然后
用无菌水冲洗 3 ～ 4遍 ,进行离体培养获得无菌试管
苗。初始培养基为 MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.05
mg/L+蔗糖 3%+琼脂 0.8%[ 3] ,培养温度为 22 ℃左
右 ,光照度为 2 000 lx,每天光照 12 h。培养 30d后 ,
接种到相同培养基中进行继代培养 ,继代 2次。
1.2.2　培养基组成成分的设计　将上述继代 2次
的试管苗分别转移到下述培养基中。
(1)MS培养基中加入 6-BA的质量浓度分别为
0, 0.5, 1.0, 2.0 , 3.0 mg/L;KT的质量浓度分别为
0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0mg/L,比较不同细胞分裂素类
物质对红檵木试管苗玻璃化的影响。
＊ 收稿日期:2008-04-15
作者简介:尹　恒(1984-),女 ,回族 ,湖南长沙人 ,在读硕士研究生 ,研究方向:园林植物遗传育种。
(2)在 MS培养基中加入 IAA的质量浓度分别
为 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 mg/L;NAA的质量浓度分别
为 0 , 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 mg/L,比较不同细胞生长素
类物质对红檵木试管苗玻璃化的影响 。
(3)培养基中加入聚乙烯醇(PVA)的质量浓度
分别为 0, 1.0, 2.0, 3.0g/L,比较不同质量浓度的 6-
BA, KT对红檵木试管苗玻璃化的影响 。
(4)采用 5因素 4水平正交设计试验方案(见
表 1),因素及水平:蔗糖质量分数(2%, 3%, 4%,
6%)、琼脂含量(0.6%, 0.8%, 1.0%, 1.2%)、6-BA
(0, 0.5 , 1.0, 2.0 mg/L)、NAA(0 , 0.05, 0.1, 0.5
mg/L),活性碳(0 , 0.1%, 0.2%, 0.3%),比较不同
成分对红檵木试管苗玻璃化的综合影响。
表 1　正交培养设计方案 L16(45)
处理 蔗糖 /% 琼脂 /% BA/(mg/L)
NAA/
(mg/L) 活性碳 /%
D1 2 0.6 0 0 0
D2 2 0.8 0.5 0.05 0.1
D3 2 1.0 1.0 0.10 0.2
D4 2 1.2 2.0 0.50 0.3
D5 3 0.6 0.5 0.10 0.3
D6 3 0.8 0 0.50 0.2
D7 3 1.0 2.0 0.05 0.1
D8 3 1.2 1.0 0 0
D9 4 0.6 1.0 0.50 0.1
D10 4 0.8 2.0 0.10 0
D11 4 1.0 0 0.05 0.3
D12 4 1.2 0.5 0 0.2
D13 5 0.6 2.0 0.05 0.2
D14 5 0.8 1.0 0 0.3
D15 5 1.0 0.5 0.50 0
D16 5 1.2 0 0.10 0.1
1.2.3　不同取材部位的外植体对玻璃化苗发生的
影响　以 MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.05 mg/L为
基本培养基 ,蔗糖含量为 3%,琼脂用量为 0.8%,相
同条件下继代 2次的红檵木 ,剔除玻璃苗 ,选择生长
健壮的无菌苗 ,取材分别为 0.5 ～ 1.0cm茎尖 、自上
而下节段 、茎段基部 ,分别接种在培养基 MS+6-BA
1.0mg/L+IBA0.05mg/L中 ,培养 30 d,观察试管
苗的生长状况 ,以茎叶半透明状作为玻璃化的依据 ,
统计增殖率 、玻璃化率 。
1.2.4　继代次数对红檵木试管苗玻璃化的影响　以
MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L为基本培养基 ,
蔗糖含量为 3%,琼脂比例为 0.8%,相同条件下继代
2, 4, 6次后 ,统计试管苗褐化率和玻璃化率。
2　结果与分析
2.1　不同细胞分裂素类物质及其质量浓度对红檵
木试管苗玻璃化的影响
据报道 ,培养基中的细胞分裂素类物质易导致
玻璃苗产生[ 4-9] ,但不同种类及其质量浓度对不同
植物玻璃化的影响是有差异的。培养基中分别添加
不同质量浓度的 6-BA、KT,对红檵木玻璃化苗的发
生率进行了测定 ,结果(见表 2)表明:当 6-BA质量
浓度为 0.5 mg/L,增殖系数和玻璃化率最低 , 为
1.67和 3.3%,随着 6-BA质量浓度升高 ,增殖系数
和玻璃化率也逐渐升高 ,当 6-BA质量浓度为 3.0
mg/L时 ,增殖系数和玻璃化率最高 ,分别为 2.79和
44.8%。加入 KT的培养基 ,其增殖系数与玻璃化
率与 KT质量浓度亦呈正相关 , KT质量浓度为 3.0
mg/L时 ,增殖系数和玻璃化率最大 ,分别为 2.70和
30%,低于 6-BA为 3.0 mg/L时的玻璃化率 。
表 2　6-BA, KT质量浓度对红檵木试管苗玻璃化的影响
类别 质量浓度/(mg/L)
接种总
数 /个
增殖
系数
玻璃苗
数 /个
玻璃
化率 /%
6-BA
0.5 30 1.67 1 3.3c
1.0 30 2.30 2 6.70c
2.0 30 2.50 12 40.0a
3.0 29 2.79 13 44.8a
KT
0.5 29 1.41 0 0c
1.0 28 1.75 2 7.1c
2.0 31 2.26 8 25.8b
3.0 30 2.70 9 30.0b
CK 0 29 0.86 0 0c
　　表中小写字母表示差异显著水平 α=0.05。
2.2　不同细胞生长素类物质及其质量浓度对红檵
木试管苗玻璃化的影响
细胞生长素类物质可以诱导培养物内源细胞分裂
素质量浓度升高[ 10] ,培养基中分别添加不同质量浓度
IAA、NAA,对红檵木玻璃化苗的发生率进行了测定 ,结
果(见表 3)表明:随着 IAA、NAA质量浓度升高 ,增殖
系数和玻璃化率也逐渐升高。当 NAA为 1.5 mg/L
时 ,增殖系数和玻璃化率最高 ,分别为 1.77和 6.7%。
11第 3期 尹　恒等:红檵木组织培养玻璃化苗发生原因初探
表 3　IAA、NAA对红檵木试管苗玻璃化的影响
类别 质量浓度 /(mg/L)
接种总
数 /个
增殖
系数
玻璃苗
数 /个
玻璃化
率 /%
IAA
0.1 30 0.90 0 0d
0.5 29 1.07 0 0d
1.0 28 1.39 1 3.6c
1.5 30 1.67 2 6.7b
NAA
0.1 31 0.97 1 3.2c
0.5 30 1.10 0 3.3c
1.0 30 1.27 2 6.7b
1.5 30 1.77 2 13.3a
CK 0 29 0.86 0 0d
　　表中小写字母表示差异显著水平 α=0.05。
2.3　聚乙烯醇 (PVA)对红檵木试管苗玻璃化的
影响
随着聚乙烯醇质量浓度的增加 ,玻璃化发生率
呈减少的趋势 (见表 4)。当 PVA质量浓度为 21
g/L时 ,玻璃化率降低至 3.3%,说明聚乙烯醇对玻
璃化的预防有一定的效果 。但增殖率又与聚乙烯醇
呈负相关 ,且质量浓度为 1g/L时 ,出现了试管苗的
生根现象 ,抑制了红檵木的正常分化和生长 。
表 4　不同聚乙烯醇(PVA)质量浓度对红檵木试管苗玻璃
化的影响
PVA
/(g/L)
接种总
数 /个
增殖
系数
玻璃苗
数 /个
玻璃化
率 /%
1 27 1.11 3 11.1b
2 30 0.77 1 3.3c
3 30 0.53 1 3.3c
CK 30 2.07 7 23.3a
　　表中小写字母表示差异显著水平 α=0.05。
2.4　不同含量蔗糖 、琼脂 、6-BA、NAA及活性碳对
红檵木试管苗玻璃化的综合影响
处理 D10和 D7的玻璃化率最大 , 分别为
14.1%和 13.78%,而处理 D11、D16的玻璃化程度
极显著低于其他处理 ,但增殖系数较低 , 分别为
1.75和 1.14(见表 5)。可见 ,过高的活性碳在降低
玻璃化苗产生的同时 ,也抑制了试管苗的生长。
表 5　不同处理组合对红檵木试管苗玻璃化综合影响
处理 蔗糖 /% 琼脂 /% BA/(mg/L) NAA/(mg/L) 活性碳 /% 增殖系数 玻璃化率 /%
D1 2 0.6 0 0 0 1.31 7.73B
D2 2 0.8 0.5 0.05 0.1 1.11 3.34CDE
D3 2 1.0 1.0 0.10 0.2 1.25 7.41B
D4 2 1.2 2.0 0.50 0.3 1.34 6.43BC
D5 3 0.6 0.5 0.10 0.3 1.09 4.28BCD
D6 3 0.8 0 0.50 0.2 1.52 3.42CDE
D7 3 1.0 2.0 0.05 0.1 1.67 13.78A
D8 3 1.2 1.0 0 0 2.57 4.22BCD
D9 4 0.6 1.0 0.50 0.1 1.83 4.66BCD
D10 4 0.8 2.0 0.10 0 2.95 14.10A
D11 4 1.0 0 0.05 0.3 1.75 0E
D12 4 1.2 0.5 0 0.2 1.23 2.22DE
D13 5 0.6 2.0 0.05 0.2 0.71 5.50BCD
D14 5 0.8 1.0 0 0.3 1.82 4.49BCD
D15 5 1.0 0.5 0.50 0 2.39 7.47B
D16 5 1.2 0 0.10 0.1 1.14 0E
　　表中大写字母表示差异显著水平 α=0.01。
　　方差分析(F检验)(见表 6)显示 , F值越大 ,产
生玻璃化苗的可能性越大 。结果表明:6-BA>活性
碳 >琼脂 >NAA>蔗糖 ,达到极显著 ,而蔗糖对玻璃
化苗的产生影响则不显著。
表 6　玻璃化率的正交设计方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 显著水平
区组 5.311 8 2 2.655 89
蔗糖浓度 32.672 4 3 10.890 81 3.489 97 0.027 68
琼脂 103.782 7 3 34.594 24 11.085 76 0.000 05
6-BA 343.275 6 3 114.425 2 36.667 65 0
NAA 99.512 3 3 33.170 77 10.629 6 0.000 06
活性碳 143.103 5 3 47.701 16 15.285 88 0
误差 93.618 09 30 3.120 6
总和 821.276 4
12 江　苏　林　业　科　技 第 35卷
　　对 6-BA、活性碳 、琼脂 、NAA分别进行各水平
间差异显著性 SSR检验 ,结果见表 7, 8, 9, 10。
表 7　6-BA各质量浓度间差异显著性 SSR检验
处理 质量浓度 /(mg/L) 均值 5%显著水平 1%显著水平
4 2.0 9.949 17 a A
3 1.0 5.195 b B
2 0.5 4.328 33 b BC
1 0 2.786 67 c C
　　表 7表明:6-BA的 4个质量浓度中 , 0.5 mg/L
和 1.0 mg/L在 0.5水平上差异不显著 , 0和 0.5
mg/L在 0.01水平上不显著 , 0.05水平上差异显
著 。所以 , 6-BA浓度为 2 mg/L时 ,组织培养苗玻璃
化率达到最高值 。
表 8　活性碳各含量间差异显著性 SSR检验
处理 　含量 /% 均值 5%显著水平 1%显著水平
1 0 8.380 83 a A
2 0.1 5.442 5 ab B
3 0.2 4.637 5 bc B
4 0.3 3.798 33 c B
　　表 8表明:活性碳的 4个含量中 ,含量为 0的组
织培养苗玻璃化率极显著高于对照 ,含量为 0.3%
时 ,组织培养苗玻璃化率最低 。但过高含量的活性
碳会减少培养基中的水分 ,进而影响增殖率 。所以
活性碳的含量应控制在 0.1%以内 。
表 9　琼脂各含量间差异显著性 SSR检验
处理 含量 /% 均值 5%显著水平 1%显著水平
3 1.0 7.164 17 a A
2 0.8 6.334 17 ab A
1 0.6 5.540 83 b A
4 1.2 3.22 c B
　　表 9检验结果表明:当琼脂含量增加到 1.2%
时 ,组织培养苗玻璃化率达到最低值 ,具有极显著差
异 。而含量 0.6%与 0.8%, 0.8%与 1.0%水平之间
无显著差异 。
表 10　NAA各质量浓度间差异显著性 SSR检验
处理 质量浓度 /(mg/L) 均值 5%显著水平 1%显著水平
1 0.00 7.055 a A
3 0.10 6.446 67 ab A
4 0.50 5.492 5 b A
2 0.05 3.265 c B
　　表 10检验结果表明:质量浓度为 0.05 mg/L的
NAA在 0.01水平上差异极显著。过高或过低质量
浓度的 NAA,都会提高玻璃化苗的发生率 。
2.5　不同取材部位的外植体对玻璃化苗发生的
影响
茎尖外植体与基部节段外植体的玻璃化苗差异
很大 。基部节段的外植体玻璃化率为 0,中部节段
分别为 12.9%和 13.3%,茎尖外植体的玻璃化率最
高 ,达 34.5%(见表 11)。这一结果表明 ,茎尖外植
体最容易诱导产生玻璃化苗 。
表 11　不同取材部位的外植体对玻璃化苗发生的影响
外植体
材料
接种总
数 /个 增殖系数
玻璃苗
数 /个
玻璃化
率 /%
茎尖 29 3.10 10 34.5a
第 1节段 31 2.26 4 12.9b
第 2节段 30 1.70 4 13.3b
基部节段 30 1.07 0 0c
　　表中小写字母表示差异显著水平 α=0.05。
2.6　继代次数对红檵木试管苗玻璃化的影响
随着继代次数的增加 ,玻璃化现象明显加剧 ,且
褐化率也不断增加 ,继代次数为第 6代时 ,玻璃化率
和褐化率达到最大值 ,分别为 46.7%和 40.0%(见
图 1)。
图 1　继代次数对红檵木试管苗玻璃化 、褐化的影响
3　小　结
对于 6-BA和 KT, 6-BA对红檵木试管苗玻璃化
有明显促进作用 ,如果质量浓度控制在 0.5 ～ 1.0
mg/L之间 ,可明显控制玻璃化苗的产生 ,又有利于
增殖。 NAA对红檵木玻璃化苗的产生效应大
于 IAA。
适宜质量浓度的聚乙烯醇可以达到抑制红檵木
试管苗玻璃化的作用。这与张胜珍等[ 11]在培养基
中添加聚乙烯醇可抑制菘蓝组培苗玻璃化的结果相
同。因为聚乙烯醇是一种水分胁迫剂 ,而在培养基
13第 3期 尹　恒等:红檵木组织培养玻璃化苗发生原因初探
中加入了聚乙烯醇 ,可改善培养基的透气性 ,这也很
好地解释了出现生根现象的原因。但聚乙烯醇含量
过高 ,增殖率会降低 ,应综合考虑 PVA的正负效果 ,
酌量添加。
对于茎尖 、第 2及 3节段 、基部节段 3个不同材
料为外植体材料 ,结果表明茎尖最易出现玻璃化 ,第
2, 3节段次之 ,基部节段没有玻璃化现象。这与周
菊华等 [ 8] 、吴若箐等[ 12]的结果不一致。茎尖材料幼
嫩体积小 ,与培养基表面接触面大 ,长期处于较高水
分的环境 ,玻璃苗发生机率大[ 13] 。
结果还表明 ,琼脂 、活性碳含量也影响红檵木玻
璃苗的发生 ,蔗糖含量对红檵木玻璃化的影响不大 。
故培养基中加入少量活性碳 ,适当提高琼脂含量 ,可
以降低玻璃苗的发生 。
参考文献:
[ 1] 　中国植物志编辑委员会.湖南植物志 [ M] .长沙:湖南科技出
版社 , 2000.
[ 2] 　彭尽晖.檵木芽变生物学特性及离体培养研究 [ D] .长沙:湖
南农业大学 , 2004.
[ 3] 　李　琦.红檵木组织培养及其对叶色影响的研究 [ D] .成都:
四川农业大学 , 2006.
[ 4] 　李　瑶 ,王利华 ,叶鸣明 ,等.影响香石竹试管苗玻璃化的因素
[ J] .植物生理学通讯 , 1997, 33(4):256-258.
[ 5] 　卜学贤 ,陈维伦.试管植物的玻璃化现象 [ J] .植物生理学通
讯 , 1987(5):13-18.
[ 6] 　梁海曼 ,周菊华.试管苗玻璃化现象的生理生化和机理探讨
[ J] .武汉植物学研究 , 1994, 12(3):281-288.
[ 7] 　张翠玉 ,廖 晴.月季试管苗玻璃化原因及控制方法研究 [ J].
新疆农业科学 , 1991(2):76-78.
[ 8] 　周菊华 ,林证明 ,梁海曼.控制瑞香试管苗玻璃化的研究 [ J].
园艺学报 , 1990, 17(3):229-232.
[ 9] 　KeversC, CoumansM, Coumans-GillesMF, etal., Physiological
andbiochemicaleventsleadingtovitrificationofplantsculturedin
vitro[ J] .PhysiolPlant, 1984, (61):69-74
[ 10] LeshemP.Theefectsofgrowthregulatorsonvitrificationinmelon
andcarnation[ J] .AnnBot, 1988(62):271-276.
[ 11] 张胜珍 ,客绍英 ,祝维芳 ,等.聚乙烯醇对菘蓝组培苗玻璃化现
象发生的影响 [ J] .唐山师范学院学报 , 2007, 9(29):5, 36-38
[ 12] 吴若箐 , 尤华明 , 彭东辉.香石竹组培苗玻璃化控制的研究
[ J] .福建林学院学报 , 1995, 15(4):360-363.
[ 13] 秦静远.植物及植物生理 [ M].北京:化学工业出版社 , 2004.
(上接第 9页)
　　经综合评价和选择 ,初选出生长表现良好的柳
树无性系 9个 ,其中 SH24、D1、JS12、J172(对照)等
4个无性系生长表现突出 ,前 3个无性系平均苗高
年生长量为 271.3cm,高出对照 10.4cm。选择这 3
个无性系和生长好的 9个无性系进行试验 ,其所获
得的苗高 、地径的苗期遗传增益分别为 8.1%,
11.8%和 10.5%, 14.8%。
3　结论与讨论
(1)45个柳树无性系间的苗期生长表现出无性
系间的显著差异 ,且具有较高的变异水平 ,苗高和地
径的遗传方差在表型方差中分别占 73%和 72.9%,
苗高的广义遗传力为 73%, 遗传变异系数为
7.78%,地径广义遗传力为 72.2%, 遗传变异系数
为 9.3%。广义遗传力和遗传变异系数都较高 ,从
中进行苗期选择 ,会取得较大的遗传改良效果 。
(2)经综合评价并初选出的 9个无性系 ,可用
于多点造林试验 , 据此估算的苗高遗传增益为
8.1%,地径的遗传增益为 10.5%。
(3)试验对照品种为 J172,系全国重点推广良
种 ,早期速生。本试验对照标准高 ,可以保证试验结
果的可靠性。
(4)生长量是苗期选择的重要指标 ,并非惟一
指标 。本研究仅从苗高 、地径 2个指标对柳树无性
系进行分析选择并不全面。但为选择速生丰产柳树
良种 ,该试验结果可提供一定依据 。
参考文献:
[ 1] 　涂忠虞 ,黄敏仁.旱柳 、垂柳 、白柳和爆竹柳的遗传改良 [ M] //
阔叶树遗传改良.北京:科学技术文献出版社 , 1991:142-166.
[ 2] 　周永学 ,苏晓华.引种欧洲黑杨无性系苗期生长测定与选择
[ J] .西北农林科技大学学报:自然科学版 , 2004, 32(10):
102-106.
[ 3] 　马育华.植物育种的数量遗传学基础 [ M] .南京:江苏科学技
术出版社 , 1980.
[ 4] 　王明庥 ,黄敏仁.黑杨派无性系研究:Ⅰ苗期选择 [ J].南京林
业大学学报 , 1987, 11(2):1-12.
14 江　苏　林　业　科　技 第 35卷