全 文 ：北方园艺 2008(1):107 ～ 111 ·观赏园艺 ·
第一作者简介:许晓岗(1968-),男 ,江苏南京人 ,博士 ,南京林业大
学森林资源与环境学院讲师。
收稿日期:2007-09-03
垂丝海棠插穗生根与可溶性蛋白和激素变化的关系
许晓 岗1 , 王 　俊2 , 童丽丽3 , 李志 文2
(1.南京林业大学森林资源与环境学院,南京 210037;2.南京莫愁湖公园管理处 ,南京 210006;3.金陵科技学院园艺学院 ,南京 210001)
　　摘　要:利用 SDS-PADE电泳技术和酶联免疫吸附分析法 ,研究了垂丝海棠插穗切口处的可
溶性蛋白质变化和激素变化与生根的关系。结果表明:46KD、39KD、31KD、28KD、26KD、24KD等
可溶性蛋白质等与生根有关。其中 ,39KD 、26KD 、24KD是调控蛋白 ,其作用是诱导细胞的脱分化
和再分化 ,愈伤组织形成及根原基的产生有关 ,当不定根形成后即消失 ,46KD、31KD、28KD蛋白
是伴随不定根产生而新形成的蛋白 ,促进垂丝海棠插穗的生根 ,46KD蛋白是一种阻碍细胞分化
的蛋白 ,对生根不利。
关键词:垂丝海棠;可溶性蛋白;不定根;插穗
中图分类号:S 685.99;Q 946　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2008)01-0107-05
　　垂丝海棠(Malus halliana Roehne)是重要的观花及
观果树木 ,其苗木需求量逐年增加 ,如何快速繁殖大量
优质苗木已成为垂丝海棠苗木生产上急需解决的关键
问题。多年来 ,人们对海棠类的生根特性进行了在一些
细胞学水平上的研究 ,主要包括外源激素 、扦插基质 、扦
插季节等因素对扦插生根能力的影响以及扦插生根的
解剖学过程等方面。但从分子水平对垂丝海棠进行蛋
白质组分及含量变化的研究尚未见报道 ,对垂丝海棠生
根过程不同时期插穗中可溶性蛋白质变化进行了聚丙
烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[ 1] ,以及扦插生根过程中
激素变化的测定试验(ELISA),通过分析比较来研究对
生根有影响的特异蛋白 ,从分子水平上初步探索了不定
根的发端与其发育的过程中可溶性蛋白质变化的关系 ,
为垂丝海棠的苗木扦插繁殖提供理论依据。
1　试验方法
内源激素测定采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)。
可溶性蛋白质的测定试验采用十二烷基磺酸钠-聚丙
烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-PolAcrylam-
ide Gel Electrophoresis , SDS-PAGE)法。
1.1　试验材料
试验材料为 2005年 4 ～ 5月间取自南京中山植物
园实验基地的3 a生垂丝海棠的实生苗。每插穗长10～
12 cm ,保留3个芽。垂丝海棠的插穗分别用不同处理后
扦插:A 处理为 500 mg/L 的 NAA 水溶液;B处理为
500mg/L 的NAA+IBA 水溶液(2种激素含量各占一
半)。2种处理的时间均为60min。在扦插后 ,于不同时
期取插穗切口处5 cm茎段带回实验室作为待用的试验
材料[ 2] 。
1.2　试验溶液的配制和插穗切口处可溶性蛋白的提取
1.2.1　提取缓冲液的配制　0.0625 mol/L Tris-HCL
(pH 6.8),SDS 0.5%,甘油 5%,β-巯基乙醇 3%。
1.2.2　上样缓冲液的配制　0.05mol/L Tris-HCL(pH
6.8)12.5%,甘油 10%,β-巯基乙醇5%。
1.2.3　提取过程　取大约 0.5 g 的插穗切口的组织放
在研钵中 ,再加入材料重量10%的PVP(即约 0.05 g)和
少许的石英砂(PVP的作用是防止蛋白在研磨过程中被
氧化)并加入液氮进行研磨。将充分研磨过的样品转入
5mL 的离心管中 ,再加入2.5mL的提取缓冲液 ,摇匀后
在-4℃下提取 1 h。然后用10 000 rpm 离心 20min。取
上清液装入 2个 5mL 的离心管中 ,按 1/3.5加入预冷
(-20℃)的丙酮 ,即每个管中加入丙酮3.5mL。然后放
在-20℃沉淀蛋白 40 min。沉淀后以 10 000 rpm 离心
18min。将丙酮倒掉 ,离心管在-20℃的冰箱放 20 min ,
让丙酮充分挥发。用乙醇/乙醚(1/1)600μL 升溶解上
述蛋白 ,并转入 1mL 离心管。用 10 000转离心16 min ,
倒掉上清液 ,将离心管放在-20℃的冰箱内30min ,让乙
醇和乙醚充分挥发。用上样缓冲液溶解上述蛋白质 ,上
样缓冲溶液的用量按 600μL/g加入。以9 000 rpm离心
5 min。上清液放在-20℃下保存备用。
1.3　SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备
需要配制的贮存液为:30%丙烯酰胺溶液[丙烯酰
胺 N ,N -甲基双丙烯酰胺(W/V)] ,1.5mol/L Tris(pH
8.8),1.0mol/L Tris(pH 6.8),10%SDS ,10%过硫酸铵
(现用现配)。
1.4　电泳 、染色和脱色
进行 SDS-PAGE使用了 6种标准蛋白 ,分别是磷酸
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化酶 B(Rabbit phosphorylase ,分子量 97.4 KD),牛血清
蛋白(Bovine serum albumin , 66.2 KD), 兔肌动蛋白
(Rabbit action ,43KD),牛碳酸酐酶(Bovine carbonic an-
hydrase ,31 KD),胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor ,
20.1KD),鸡蛋清溶菌酶(Hen egg white ly sezyme ,
14.4KD)。
　　表 1　　　　分离胶和浓缩胶的配比
溶液成分
(胶粘度3.33%)
分离胶(20 mL)
胶浓度12%
浓缩胶(14 mL)
胶浓度5%
水 6.6 9.5
30%丙烯酰胺溶液 8.0 2.37
1.5 mol/L Tris(pH 8.8) 5.0 -
1.0 mol/L Tris(pH 6.8) - 1.75
10%SDS 0.2 0.14
10%过硫酸铵 0.2 0.14
TEMED 0.08 0.28
　　注:TEMED-N ,N :N -四甲基乙二胺。
　　电泳缓冲液的组成:25mmol/L Tris ,250mmol/ L甘
氨酸(pH 8.3)0.1%SDS在 900 mL 去离子水中溶解
15.1 g甘氨酸 、Tris 碱和 94 g 甘氨酸 ,然后加入 50 mL
10%(W/V)的电泳级 SDS贮存液 ,用去离子水定容至
1 000 mL配成5倍的贮存液。染色液的成分:0.1%考
马斯亮兰 R-250 , 50%甲醇 , 10%冰醋酸 , 40%蒸馏水。
脱色液的成分:5%甲醇 ,7%冰醋酸 ,88%蒸馏水。电泳
时间 4.5 h ,电压130～ 150V 。当溴酚兰指示剂到达电泳
槽的底部时 ,取下凝胶 ,作好标记 ,放入染色液中过夜染
色。染色后的凝胶转入脱色液中脱色2 ～ 3 d ,直到凝胶
的背景色变得很浅 ,条带清晰可见时停止脱色。
1.5　凝胶照像
电泳结束的凝胶用 UVP 凝胶成像系统 GDS7600
(Gel Documentation System)进行照像。
2　试验结果
2.1　插穗生根过程中4种内源激素的变化
经过 2种不同处理后扦插试验 ,B处理在生根率和
生根数量上总是比A处理要高许多。垂丝海棠 A处理
生根率为 34.5%,垂丝海棠B处理生根率为 91.02%。
　　表 2　　不同处理后插穗的扦插生根率
处理方式 生根插穗数 插穗总数 生根率%
A处理 158 464 34.50
B处理 436 479 91.02
对照 39 376 10.37
2.1.1　激素ZR在不同处理的垂丝海棠插穗间的变化
　ZR对细胞的延伸生长起重要作用。当插穗从母体取
下的初始阶段 ,由于ZR的供应路线被切断 ,插穗切口处
组织细胞的脱分化 ,ZR的消耗利用正常进行 ,因此其含
量逐渐下降(见图 1)。当扦插一段时间后 ,插穗自身启
动了 ZR的合成机器 ,其含量随着扦插时间的推移而不
断增加。比较垂丝海棠不同处理后 ZR的含量变化可
见 ,生根率高的 B处理中的 ZR含量在不定根产生过程
中始终维持在相对较高的水平。ZR在促进生根 ,提高
扦插生根率方面起主要作用。
图 1　插穗生根过程中ZR含量变化
　　注:标有数字的时间所代表的时间为:1-4月 6日;2-4月 13日;3-4月
20日;4-4月 27日;5-5月 4日;6-5月 11日;7-5月 18日。
2.1.2　不同处理垂丝海棠插穗在生根过程中内源激素
IAA的变化　从图 2可以看出 ,垂丝海棠生根率高的 B
处理的插穗刚从母树上取下时 IAA的含量最低 ,而生根
率相对低的A处理在扦插初期 IAA含量却较高。IAA
在 2组处理插穗生根过程中的含量和变化规律与激素
ABA大致相同。IAA是生长促进物质 ,在垂丝海棠扦
插生根过程中的含量变化规律同抑制物质 ABA相同 ,
未表现出对插穗生根的决定作用[ 3] ,说明 IAA在海棠插
穗生根时不起主要作用 ,只是协同作用。
图2　插穗生根过程中 IAA含量变化
　　注:标有数字的时间所代表的时间为:1-4月 6日;2-4月 13日;3-4月
20日;4-4月 27日;5-5月 4日;6-5月 11日;7-5月 18日。
2.1.3　激素 GA在不同处理垂丝海棠插穗中的变化　
从图3可看出:在插穗刚脱离母树后 ,垂丝海棠 A处理
的插穗中的激素 GA的含量没有太大的差别。从扦插
后大约第 14 ～ 24天 ,生根率高的 B处理的含量在升高 ,
而 A处理则增加的比较缓慢。从扦插第 21 ～ 35天 ,垂
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丝海棠 B处理插穗中的GA 含量比 A处理全面高。此
时正是根原基形成并分化的时间。由此可知 ,在根原基
分化的时期 ,GA起很重要的作用[ 4] 。
图3　插穗生根过程中 GA含量变化
　　注:标有数字的时间所代表的时间为:1-4月 6日;2-4月 13日;3-4月
20日;4-4月 27日;5-5月 4日;6-5月 11日;7-5月 18日。
2.1.4　生长抑制物脱落酸在不同处理的垂丝海棠插穗
间的变化　从图 4可见 ,ABA在海棠插穗的B处理中 ,
初始浓度以及插穗生根过程中的浓度均保持在相对较
低的水平。A处理的ABA含量相对较高。插穗的初始
ABA浓度决定着愈伤组织或不定根原基的形成 ,影响着
插穗的生根率[ 5] 。
图 4　插穗生根过程中 ABA 含量变化
　　注:标有数字的时间所代表的时间为:1-4月 6日;2-4月 13日;3-4月
20日;4-4月 27日;5-5月 4日;6-5月 11日;7-5月 18日。
2.2　不同处理后的垂丝海棠插穗生根过程中可溶性蛋
白的变化
A处理的垂丝海棠插穗生根过程中可溶性蛋白的
SDS-PAGE图谱如图5。SDS-PAGE图谱上方标有字母
M的泳道表示标准蛋白质 Marker所在的泳道;标有数
字的泳道表示各时期的可溶性蛋白质电泳结果 ,代表的
时期为:1-14月6日;2-4月 13日;3-4月 20日;4-4月 27
日;5-5月 4日;6-5月 11日;7-5月 18日。左边一列数
值(未标箭头的)是 Marker 的分子量 ,单位是 KD(千道
尔顿)。由图可知:随着时间推移 ,插穗切口处可溶性蛋
白 46KD 、39KD 、31KD、28KD 、26KD 、24KD等与生根有
关[ 6] 。
图5　垂丝海棠插穗生根过程可溶性蛋白
的 SDS-PAGE 图谱(A处理)
　　注:标有数字的时间所代表的时间为:1-4月 6日;2-4月 13日;3-4月
20日;4-4月 27日;5-5月 4日;6-5月 11日;7-5月 18日。
图6　垂丝海棠插穗生根过程可溶性蛋白
的 SDS-PAGE 图谱(B处理)
　　注:标有数字的时间所代表的时间为:1-4月 6日;2-4月 13日;3-4月
20日;4-4月 27日;5-5月 4日;6-5月 11日;7-5月 18日。
　　在 2种处理后的插穗切口中 ,39KD、26KD、24KD的
变化相似 ,在 4月 6日 ,4月 13日含量都较高 ,到了 4月
20日后急剧下降 ,且一直保持在较低的水平。显然 ,这3
种蛋白含量的下降与细胞的脱分化和再分化 ,根原基的
产生有关[ 7] 。28KD 、31KD、46KD蛋白亚基在 2种处理
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中均是新生成的 ,28KD 、31KD蛋白均在 4月 13日左右
出现并持续到5月18日都存在。从4月13日到4月20
日左右是愈伤组织中产生不定根原基的时期 ,需要合成
新的功能蛋白;该时期新生成的这 2种蛋白与该过程呈
明显的一致性关系。而 46KD蛋白亚基在 5月 11日开
始产生 ,此时是不定根伸长生长的时期[ 8] ,46KD蛋白质
与根系的伸长生长有关。可见 ,控制愈伤组织分化出不
定根原始体的基因在很早的 4月 6日就开始启动 ,产生
相应的功能蛋白和停止或降低一些蛋白的合成[ 9] 。
3　分析与讨论
3.1　不同处理后插穗生根过程中可溶性蛋白质的分析
为了更准确的分析垂丝海棠插穗中可溶性蛋白在
生根过程中的作用 ,将 2种不同的处理结果进行比较:A
处理产生了大量的愈伤组织 ,但生根率很低(34.05%);
处理 B的生根率很高(91.02%)。见图 7和图8。
图 7　垂丝海棠插穗生根外部形态特征(A 处理)
图 8　垂丝海棠插穗生根外部形态特征(B处理)
　　从图 5和图6中可以看出:与处理 B相比 ,在处理 B
中39KD和24KD 2种蛋白亚基初期含量较高 ,后来在
生根的过程中含量急剧下降。这 2种蛋白是生根中有
影响作用的 2种蛋白。对生根可能的作用方式是:它们
作为生根过程的执行者 ,其大部分被用来参与生根有关
的合成过程[ 10] ,使相关的蛋白亚基 28KD开始产生;同
时它们本身的含量由于消耗而急剧降低。
28KD蛋白在处理B中出现的时间(4月13日)比A
处理出现的时间(4月20日)早。相反 ,46KD蛋白在处
理 B中在 5月 11日和 5月 18日才有少量产生 ,而在处
理 A中出现的时间比较早 ,在 4月 20日就有少量产生。
出现这种情况的原因可能是由于 IBA诱发某种基因提
前开启对 28KD的表达 ,而且“遏制”或“遮蔽”了对46KD
的启动[ 11] 。这2种蛋白亚基对插穗生根的作用可能是
相反的 ,46KD蛋白可能是一种阻碍愈伤组织细胞再分
化的蛋白 ,而28KD蛋白亚基促进愈伤组织细胞的再分
化。当 28KD蛋白出现的比46KD早时 ,28KD蛋白的促
进作用是主要的;当 46KD蛋白出现的早时 ,标志着细胞
开始老化 ,分化受阻[ 12] 。
3.2　插穗切口处可溶性蛋白与激素的分析比较
分析插穗生根过程中的内源激素 、DNA与 RNA含
量和可溶性蛋白质的变化可知 ,对插穗生根有影响的内
源激素是 ABA 、GA和 ZR ,与生根有关的可溶性蛋白是
46KD 、39KD、28KD 、24KD。通过分析生根率高的 B处
理插穗切口的内源激素和可溶性蛋白质变化发现 ,39KD
和 24KD蛋白质在扦插初期含量较高 ,因此这 2种蛋白
质是扦插母树自身合成的 ,到 4月 20日 ,愈伤组织和不
定根分化后 ,2种蛋白质消失。而 ZR的含量在扦插的
初期也较高 ,且在 4种内源激素中对生根起重要的促进
作用。由此可以推断 ,39KD和 24KD可能影响激素 ZR
的含量的变化[ 13] 。当 39KD和 24KD与 ZR相互作用
时 ,被激活的39KD和24KD或者调节细胞的生长分化
或者调节其它功能的开启。在此过程中 ,39KD和 24KD
由于被激活执行相应的功能而被消耗掉 ,此时正是根原
始体开始发端时期;因此 ,它们在 4月 20日以后消失。
插穗生根过程中新合成的 28KD蛋白质在 4月 13
日出现(见图5和图 6),而GA 的量在4月 27日急剧增
加。这 2种物质对生根都起促进作用 ,由此推得 28KD
蛋白可能与合成GA基因的过程有关[ 14] 。28KD产生后
影响GA基因 ,使之合成量增加 ,以调节根原基的分化。
阻碍生根的46KD蛋白质大约在 5月11日产生(见
图 5和图 6),但此时 ABA 的含量也在大量增加 ,DNA
和 RNA的含量也迅速下降。46KD蛋白质也可能是影
响 ABA含量变化的蛋白 ,对 ABA 量的增加起促进作
用。
3.3　存在问题
3.3.1　虽然 SDS-PAGE对一定分子量范围内的可溶性
蛋白质有很高的分辨率 ,但要确切地找出与生根有关的
蛋白质还应进行双向SDS-PAGE来验证[ 15] 。
3.3.2　植物的内源激素作为生长发育的调节物质 ,通过
与受体结合 ,使受体被激活 ,引发细胞的生理功能发生
变化。如果被激活的受体在细胞核内 ,就可能作用于核
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酸 ,从而引起某些基因的开启和关闭[ 16] 。激素及其受体
要靠基因的转录合成。而可溶性蛋白可能是受体 ,也可
能是基因的调控蛋白[ 17] 。试验所分析的几种激素与几
种可溶性蛋白的关系 ,应进一步进行证明[ 18] 。
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Studies on Changes of Soluble Proteins in the Cuttings
Rooting of Malus halliana Roehne
XU Xiao-gang1 ,WANG Jun2 , TONG Li-li3 , LI Zhi-wen2
(1.Faculty of Forest Resources and Environment , Nanjing Forestry University , Nanjing 210037 , China;2.Management Depantment of Nan-
jing Mochou Lake Park , Nanjing 210006 , China;3.Co1lege of Hor ticulture Department , Jinling Institute of Technology , Nanjing 210001 , China)
Abstract:By applying the techniques of SDS-PAGE &ELISA , this thesis researched explored the relationship between
rooting and the variances of both soluble proteins and endogenous plant hormones in the process of Malus hallianas cut-
ting.The experiment results showed that:during the cutting procedure , the soluble proteins of 46KD、39KD 、31KD、
28KD 、26KD 、24KD were related to the rooting.The soluble proteins in 46KD 、39KD 、31KD、28KD controlled the callus
growing and adventitious root primordium differentiation , furthermore , they disappear when the cuttings generated ad-
ventitious roots.While the rooting proceeded , some new kinds of soluble proteins , like 46 KD 、31 KD 、28 KD , which
were good for promoting new adventitious roots had been generated. It seemed that the soluble protein 46KD in the
cuttings had some disadvantages to the adventitious root primordium differentiation of the cuttings rooting.
Keywords:Malus halliana;Soluble proteins;Adventitious root;Cut tings
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