全 文 ：书垂盆草提取物对马兜铃酸致大鼠肾小管上皮细胞损伤的改善作用
陆 红1，陈必成2，胡丽萍1，洪炜龙2，林成成2，白永恒2
(温州医科大学附属第一医院 1． 医学检验中心，2． 外科实验室，浙江 温州 325000)
摘要:目的 研究马兜铃酸( AA)致肾小管上皮细胞损伤的分子机制及垂盆草提取物( SSBE)对 AA损伤
的干预机制。方法 将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞 NＲK-52E加入 AA 1，5，10，50 和 100 mg·L －1 ;或
AA 10 mg·L －1 + SSBE 10，50，100，500 和 1000 mg·L －1，培养 24 h后，采用倒置相差显微镜观察细胞形
态变化; Hoechst 33258 染色和流式细胞仪检测 NＲK-52E细胞凋亡; ELISA 和免疫细胞荧光染色检测巨噬
细胞移动抑制因子 ( MIF) 的表达; 实时荧光定量 ＲT-PCＲ 和 Western 蛋白质印迹法检测凋亡相关基因
c-Myc和 p53 mＲNA和蛋白的表达。结果 随着 AA浓度的增加，NＲK-52E细胞损伤愈加明显。与正常对
照组相比，AA 10 和 50 mg·kg －1诱导细胞凋亡，并促进了 c-Myc 和 p53 明显表达( P ＜ 0． 05 ) ; AA 10 和
50 mg·kg －1损伤肾小管上皮细胞后，MIF的分泌和表达量明显增加( P ＜0． 05) 。与 AA 10 mg·L －1组相比，
SSBE 1000 mg·L －1不仅减轻了 AA 所致的损伤，而且明显下调了 MIF 的表达 ( P ＜0． 05) 。同时，SSBE
1000 mg·L －1也明显抑制了 c-Myc 和 p53 的表达( P ＜0． 05) 。结论 AA 损伤肾小管上皮细胞，诱导细胞
凋亡，并促进 MIF的表达，进而影响炎症应激反应过程中巨噬细胞的浸润和活化。SSBE 的干预可明显降
低 AA所致的损伤，这可能与 MIF的表达下调有关。
关键词:垂盆草; 植物提取物; 马兜铃酸; 巨噬细胞; 巨噬细胞游走抑制因子; 细胞凋亡
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:1000-3002(2013)06-0988-07
DOI:10． 3867 / j． issn． 1000-3002． 2013． 06． 012
马兜铃酸性肾病是因服用马兜铃酸(aristolo-
chic acid，AA)类中草药，如马兜铃、天仙藤和关木
通等引起的一类特殊的肾小管间质损害，进而发生
急性或慢性肾功能衰竭［1］。有研究显示，在 AA 诱
导小管间质损害早期，包括巨噬细胞在内的多种炎
症细胞会在损伤部位浸润、聚集和活化，参与肾小管
的损伤过程。抑制损伤局部的炎症反应，可以有效
地抵抗 AA所致的肾小管间质损害［2］。最近研究显
示，来自于景天科景天属多年生草本植物———垂盆
草，其 提 取 物 (Sedum sarmentosum Bunge
extract，SSBE)具有抑制肝炎性渗出作用［3］。然
而，对于 AA所致的肾小管间质炎症反应，SSBE 是
否同样也具有抑制作用，目前尚不清楚。本研究从
体外实验角度，探讨 AA 对大鼠肾小管上皮细胞
NＲK-52E的损伤及 SSBE的调节作用。
基金项目:浙江省自然科学基金(LQ12H050001) ;浙
江省自然科学基金(LY12H050004) ;温州市科技计划项目
(Y20110028) ;温州市科技计划项目(Y20110072)
作者简介:陆 红(1980 －) ，女，主管技师，主要从事
炎症分子机制及干预研究;白永恒(1979 －) ，男，博士，主
要从事肿瘤和肾、肝、胰纤维化研究。
通讯作者:白永恒，E-mail:greatsailor@163． com，
Tel: (0577)88069338
1 材料与方法
1． 1 试剂及仪器
马兜铃酸Ⅰ，批号:A5512，购自美国 Sigma 公
司，纯度 97%，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配成
2 g·L －1原溶液;垂盆草提取物，批号:20101017，购
自安徽宣城百草植物工贸公司，规格 50 ∶ 1，用
DMSO溶解，配成 100 g·L －1原溶液;DMEM细胞培
养液，购自美国 Hyclone 公司;胎牛血清，购自杭州
四季青生物公司;胰蛋白酶和 TＲIzol 提取液，购自
美国 Gibco公司;巨噬细胞移动抑制因子(migra-
tion inhibitory factor，MIF)ELISA 检测试剂盒，购
自上海西唐生物公司;Hoechst 33258，购自碧云天
公司;AnnexinⅤ /PI 凋亡检测试剂盒，购自联科生
物公司;兔抗鼠 β-actin，P53 和 c-Myc 抗体，购自
Bioworld公司;MIF 抗体，购自美国 Santa Cruz 公
司;荧光素(FITC)标记山羊抗兔 IgG，购自北京康
位生物公司;ＲT-PCＲ 试剂，购自美国 Promega 公
司。MYCYCLEＲ梯度 PCＲ 仪，美国 Bio-Ｒod 公司
产品;7500 定量 PCＲ 仪，美国 Applied Biosystems
公司产品;Varioskan Flash 全波长多功能扫描仪，
美国 Thermo Scientific 公司产品;DM4000 B LED
荧光正置显微镜，德国 Leica公司产品。
·889· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 12 月第 27 卷第 6 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 6，Dec 2013
1． 2 细胞分组给药和细胞形态学的观察
大鼠肾小管上皮细胞系 NＲK-52E，购自中科院上
海生命科学研究院细胞资源中心。NＲK-52E 细胞置
于5%胎牛血清的 DMEM培养液，37℃，5%CO2 培养
箱内培养。实验时，将细胞按适当浓度接种于六孔板
中，待细胞70% ～80%融合时，换成无血清 DMEM培
养液并开始正式实验。实验分成 3组，分别为① 正常
对照组:细胞不加 SSBE和 AA，只加溶剂;② AA组:
细胞中分别加入 AA 1，10 和100 mg·L －1;③ SSBE
组:细胞中同时加入 AA 10 mg·L －1和 SSBE 10，100
和1000 mg·L －1。按分组方案，加入相应药物，置37℃
和5%CO2 的培养箱中培养 24 h后，用倒置相差显微
镜观察细胞形态学变化。
1． 3 Hoechst 33258 染色法观察 NＲK-52E细胞的凋
亡和坏死
将预处理的洁净盖玻片置于六孔板内，接种细
胞培养过夜，当细胞密度达到 70% ～80%时，相应
加入 AA 和 SSBE 作用 24 h，吸尽培养液，加入
0． 5 ml的固定液，固定 10 min。然后去固定液，用
PBS洗 2 次，每次 3 min，吸尽液体，加入0． 5 ml
Hoechst 33258 染色液，染色 5 min，去染色液，用
PBS洗两次，每次 3 min，吸尽液体。滴加抗荧光淬
灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，荧光
显微镜观察核染色情况。
1． 4 AnnexinⅤ/PI双染流式细胞仪检测凋亡细胞
收集细胞于 10 ml 的离心管中，用孵育缓冲液
洗 1 次，100 × g 离心 5min。用 100 μl 的标记溶液
重悬细胞，室温下避光孵育 10 min。100 × g 离心
5 min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1 次。加入荧光溶液
4℃下孵育 20 min，避光并不时振荡，荧光显微镜下
观察细胞凋亡情况，并上机检测。
1． 5 ELISA法检测巨噬细胞移动抑制因子含量
取对数生长期的 NＲK-52E细胞，加入 AA 1，5，
10，40和 80 mg·L －1以及 SSBE 10，50，100，500
和1000 mg·L －1作用24 h，收集培养液。MIF含量检
测采用双抗体夹心 ABC-ELISA法，即用抗大鼠 MIF
单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 MIF 与单
抗结合，加入生物素化的抗大鼠 MIF，形成免疫复合
物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的亲和素与生物
素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，
于 450 nm处测吸光度值(absorbance，A) ，通过绘
制标准曲线求出浓度。
1． 6 qＲT-PCＲ检测 c-Myc和p53 mＲNA的表达
采用 TＲIzol 试剂提取 AA10 和 SSBE 10，100
和 1000 mg·L －1 已 处 理 细 胞 中 的 ＲNA，于
260 /280 nm测定 A 值以确定样本纯度和浓度。根
据试剂说明书将 ＲNA 逆转录成 cDNA。应用
Primer 5． 0软件设计针对 c-Myc 和 p53 mＲNA 特
异性引物，以β肌动蛋白作为内参对照，采用相对定
量法计算获得结果。c-Myc，p53 和 β 肌动蛋白引
物序列如表 1 所示，由上海捷瑞公司合成。取逆转
录产物1 μl进行 PCＲ 扩增，PCＲ 扩增体系:5 μl
2 × SYBＲ Green荧光定量试剂、2 μl引物(上、下游
各 1 μl，终浓度200 nmol·L －1)、2 μl 反应缓冲液和
1 μl cDNA。扩增程序为:95℃ 5 min，95℃ 10 s，
60℃ 35 s，40 个循环。采用溶解曲线评价 PCＲ 结
果可靠性，采用 2 －△△Ct计算 c-Myc，p53 和 β 肌动
蛋白相对mＲNA表达量。
Tab． 1 mＲNA primers for amplifyingp53 andc-Myc
Gene Primers Length
c-Myc F:5-CCCACCACCAGCAGCGACTC-3 146 bp
Ｒ:5-GGGCTGTGAGGAGGTTTGCTGT-3
p53 F:5-TCACCATCATCACACTGGAAGACTC-3 175 bp
Ｒ:5-TTGGGCAGTGCTCGCTTAGT-3
β-Actin F:5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3 150 bp
Ｒ:5-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3
1． 7 细胞免疫荧光染色检测促炎因子 MIF蛋白的
表达
细胞经胰酶消化收集后．分别以 2 ×105 个细胞
接种于含载玻片的 6 孔板中，常规培养。培养细胞
至 80% ～ 90%融合后，按照细胞分组分别给予
AA10 和 SSBE 0，100 和 1000 mg·L －1培养 24 h，
弃去培养基，PBS清洗细胞3 次，用 4%多聚甲醛固
定 30 min，0． 3% Triton-X(每孔 1 ml)破膜，室温
20 min。0． 5%正常山羊血清封闭。在各细胞爬片
上滴加 MIF 一抗工作液，4℃孵育过夜，PBS 冲洗
3 次。滴加 FITC 标记的二抗工作液，37℃孵育
60 min，同上洗涤。滴加 DAPI于盖玻片上，室温染
色 5 min，同上洗涤。细胞胞质绿色和胞核蓝色为
阳性着色。每组取 3 张片，每片取 10 个高倍视野
(400 ×) ，运用 Image Pro Plus(IPP)软件分析吸
光度值表示 MIF蛋白的表达。
1． 8 Western蛋白质印迹法检测 c-Myc和 P53 蛋白
表达
按照细胞分组给予 AA 和 SSBE 处理细胞后，
用 100 μl细胞裂解液进行裂解，收集离心后上清液
测蛋白浓度;制备 12%聚丙烯酰胺分离胶和 4%积
层胶，样品5 ×SDS上样缓冲液，设置恒压 200 V，电
泳 60 min;设置恒压 100 V，湿法电转移 60 min;转
膜后的PVDF膜经5%TBST脱脂奶粉室温封闭1h;
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然后加一抗(均 1∶ 500)4℃孵育过夜，加入相应种属
二抗(1∶5000) ，室温孵育 1 h，加入 ECL发光液孵育
膜 5 min，暗室压片曝光，显影定影后胶片保存。
1． 9 统计学分析
实验结果数据以x ± s 表示，采用 SPSS13． 0
软件包进行统计学分析，两样本比较采用 t 检验和
精确概率法。P ＜0． 05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 SSBE干预 AA对 NＲK-52E细胞形态的影响
如图 1所示，正常情况下，培养24 h后，细胞密度
极高，细胞间接触紧密，由于接触抑制，细胞形态小
(图 1A) ;AA 作用于 NＲK-52E 细胞后，细胞数量下
降，细胞损伤表现明显，失去贴壁作用，细胞漂浮在培
养液中，并且细胞形态大(图 1B ～D)。经 SSBE干预
后，AA所致的损伤作用大幅减轻。但同时随着 SSBE
浓度的增加，细胞数量也明显下降(图1E ～G)。
2． 2 SSBE对 AA致 NＲK-52E细胞增殖和凋亡的影
响
与正常对照(图 2A)相比，AA 1 mg·L －1作用于
NＲK-52E细胞，培养 24 h后，即可诱导细胞出现凋
亡小体(图 2B，白色箭头所示) ，且细胞体积变小;
AA 10 mg·L －1使细胞凋亡特征最典型(图 2C) ;而
AA 100 mg·L －1时，对细胞的损伤作用则主要表现为
坏死，镜下可见明显的细胞残片，完整的细胞几乎消
失(图2D)。经SSBE 10 mg·L －1干预后(图2E) ，细
胞凋亡和坏死程度显著下降;但同时也发现，过量的
SSBE 1000 mg·L －1可引起细胞自身明显凋亡(图
2G)。此外，图3流式分析结果显示，随着AA浓度的
增加，晚期凋亡和坏死的细胞(图 3 Q3 部分)明显增
加。经 SSBE干预后，虽然晚期凋亡和坏死的细胞可
下调，但早期凋亡增加(图 3 Q2部分)。
Fig． 1 Effect ofS． sarmentosum Bunge extract(SSBE)on morphological change in NＲK-52Ecells by inverted/phase contrast microsco-
py (× 100)． Cells were cultured for 24 h． A:normal control;B:AA 1 mg·L －1;C:AA 10 mg·L －1;D:AA 100 mg·L －1;
E:AA 10 mg·L －1 + SSBE 10 mg·L －1;F:AA 10 mg·L －1 + SSBE 100 mg·L －1;G:AA 10 mg·L －1 + SSBE 1000 mg·L －1 ． AA:aristolo-
chic acid．
Fig． 2 Effect of SSBE on apoptosis and necrosis of NＲK-52Ecells(Hoechst 33258 staining ×200)． See Fig． 1 for cell treatment． A:
normal control;B:AA 1 mg·L －1;C:AA 10 mg·L －1;D:AA 100 mg·L －1;E:AA 10 mg·L －1 + SSBE 10 mg·L －1;F:AA 10 mg·L －1 +
SSBE 100 mg·L －1;G:AA 10 mg·L －1 + SSBE 1000 mg·L －1 ．
·099· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 12 月第 27 卷第 6 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 6，Dec 2013
Fig． 3 Effect of SSBE on apoptosis in NＲK-52Ecells by flow cytometry analysis． Cells were treated for 24 h． A:normal control;B:AA 1
mg·L －1;C:AA 10 mg·L －1;D:AA 10 mg·L －1 + SSBE 10 mg·L －1;E:AA 10 mg·L －1 + SSBE 100 mg·L －1;F:AA 10 mg·L －1 + SSBE
1000 mg·L －1 ．
2． 3 SSBE干预 AA对 NＲK-52E细胞c-Myc 和p53
mＲNA表达的影响
如图4所示，AA 0，1，5，10 和 50 mg·L －1以及
AA 10 mg·L －1 +SSBE 0，10，100和 1000 mg·L －1
加入 NＲK-52E 细胞培养 24 h，细胞中 c-Myc 和
p53 mＲNA的相对表达量。NＲK-52E细胞在受到
AA损伤后，c-Myc mＲNA的表达随着 AA浓度的增
加而逐渐升高(图 4B)。当 AA 50 mg·L －1 时，
c-Myc mＲNA 表达量达最高值，为正常对照组的
40． 14倍(P ＜ 0． 05)。同样，p53 mＲNA 的表达也
随着 AA 浓度的增加而呈现逐渐升高的趋势(图
4A)。当 AA 50 mg·L －1时，p53 mＲNA的表达量达
最高值，为正常对照组的 646． 3 倍(P ＜0． 05)。与
AA 10 mg·L －1组相比，应用 SSBE 1000 mg·L －1干
预后，c-Myc 和 p53 mＲNA 表达均明显下调(P ＜
0． 05) (图 4C)。
2． 4 SSBE干预 AA对 NＲK-52E细胞 MIF表达的影
响
如图 5A 所示，随着 AA 浓度的增加，NＲK-52E
细胞分泌 MIF 量逐渐升高，并呈浓度依赖性。当
AA 80 mg·L －1 时 MIF 表达量达峰值(4． 7 ±
0． 09)μg·L －1。同样，细胞免疫荧光染色的结果也
显示，MIF表达明显增加(图 6)。经 SSBE 不同浓
度干预后，MIF表达随着 SSBE 浓度的增加而下降
(图 6B)。当 SSBE 1000 mg·L －1时 MIF含量仅为
(4． 1 ±0． 1)μg·L －1。提示 SSBE 抑制了 MIF 表
达，可影响炎症反应过程中的巨噬细胞移动和迁移，
进而减轻炎症反应。
Fig． 4 Effect of AA and SSBE on expression of c-Myc andp53
mＲNA in NＲK-52E cells． A:effect of AA on p53 mＲNA expres-
sion;B:effect of AA on c-Myc mＲNA expression;C:effect of AA
and SSBE on c-Myc mＲNA expression． Cells were cultured for 24
h． x ± s，n = 6，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01，compared with normal
control group;#P ＜0． 05，compared with AA10 group．
·199·中国药理学与毒理学杂志 2013 年 12 月第 27 卷第 6 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 6，Dec 2013
Fig． 5 Effect of AA and SSBE on migration inhibitory factor
(MIF)levels in NＲK-52E cells by ELISA． See Fig． 1 for cell treat-
ment． A:NＲK-52E cells were treated with AA for 24 h;B:NＲK-
52E cells were treated with AA and SSBE for 24 h． x ± s，n =3，*
P ＜ 0． 05，compared with normal control;#P ＜0． 05，compared
with AA10 group．
Fig． 6 Effect of AA and SSBE on MIF expression in NＲK-52E cells
(×400)． See Fig．1 for cell treatment． A:normal control;B:AA 10
mg·L －1;C:AA 10 mg·L －1 +SSBE 10 mg·L －1 ．
2． 5 SSBE干预 AA对 NＲK-52E细胞 c-Myc 和 P53
蛋白表达的影响
如图 7 结果显示，与正常对照组比较，c-Myc和
P53蛋白在 AA损伤后明显升高(P ＜0． 05)。与 AA
10 mg·L －1组比较，经 SSBE 100和 1000 mg·L －1干
预后，c-Myc和 P53 蛋白表达明显下调(P ＜0． 05，
P ＜0． 01) (图 7) ，提示 SSBE具有抑制 AA所引起
细胞损伤的作用。
Fig． 7 Effect of AA and SSBE on expression of c-Myc and P53
protein in NＲK-52E cells by Western blot． See Fig． 1 for cells
treatment． A． Lane 1:normal control;lane 2:AA 1 mg·L －1;lane
3:AA 10 mg·L －1 + SSBE 100 mg·L －1;lane 4:AA 10 mg·L －1 +
SSBE 1000 mg·L －1;B． Semiquatity of A for c-Myc and P53 protein
expression． x ± s，n =6，* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01，compared with
normal control group;# P ＜ 0． 05，## P ＜ 0． 01，compared with
AA10 group．
3 讨论
AA是植物界中发现的第一个硝基化合物，是
马兜铃植物中所含的共同成分。近十几年来，随着
国内外对含有 AA 制剂的密切关注，有关 AA 中药
致肾损害的报道和研究也逐年增加。然而至今尚未
完全明确 AA对肾脏的损伤机制，且临床上亦缺乏
成熟的治疗方案。因此，很有必要提高对此病的认
识，并查找确实有效的治疗药物。对肾小管上皮细
胞而言，AA 的损伤主要表现为凋亡和坏死［4］。有
研究显示，一定剂量范围内的 AA 可诱导细胞 DNA
损伤，导致细胞周期在 G2 /M 期阻滞
［5］。细胞周期
的阻滞在一定程度上打破了细胞增殖和凋亡的平
衡。本研究显示，随着 AA浓度的增加，肾小管上皮
细胞损伤越严重，发生凋亡越明显，甚至高浓度的
·299· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 12 月第 27 卷第 6 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 6，Dec 2013
AA可引起细胞坏死。此外，也检测了增殖凋亡相
关基因 c-Myc和 p53 mＲNA 和蛋白的表达。结果
发现，c-Myc 和 p53 表达均随着 AA 浓度的增加而
升高。c-Myc作为癌基因，其表达的增加能促进多
种细胞的增殖。至于 p53，目前学术界对于其在 AA
诱导肾损伤中的角色还存在争议。有文献报道，AA
能通过非 p53 依赖途径诱导人肾小管上皮细胞损
伤［6］。但也有研究显示，AA 能促进 p53 的高表
达［7］，这与本研究观察到的现象一致。正常情况
下，p53 基因为抑癌基因，但 AA可诱发 p53 基因突
变，使之失去对细胞生长、凋亡和 DNA 修复的调控
作用，而转变为促进细胞增殖的癌基因［8］。p53 和
c-Myc表达的升高，提示 AA 诱导细胞凋亡，同时伴
随着细胞反馈性增殖现象。
除了影响细胞凋亡增殖之外，在体内 AA 所致
的肾组织损伤局部，巨噬细胞也会不断地增殖和活
化，同时伴随着周围组织巨噬细胞的浸润和聚集以
及外周血管内单核细胞游走至损伤部位并转变为巨
噬细胞［9］。作为巨噬细胞迁徙、浸润和活化的重要
调控因子，MIF不仅由巨噬细胞分泌产生，同样也由
肾小管上皮细胞产生［10］。本研究发现，AA 可诱导
MIF的高表达。高表达的 MIF 推动了巨噬细胞参
与炎症反应过程，进而影响间质纤维化。
以前研究虽然已报道 SSBE 具有抗肝炎和免
疫调节作用［3］。然而，SSBE 是否具有抗肾间质炎
症反应目前尚不清楚。本研究发现，SSBE 在一定
程度上能拮抗 AA 对肾小管上皮细胞的损伤作用。
SSBE能明显下调小管上皮细胞 MIF 的表达水平，
提示 SSBE抑制巨噬细胞参与的炎症反应作用过
程，这有可能为 SSBE 的抗炎作用分子机制之一。
此外，研究也发现，当 SSBE 超过一定浓度后，细胞
数量反而下降，c-Myc和 p53 表达下调，这说明高浓
度的 SSBE抑制了细胞增殖。因此，在选择 SSBE
作为抑制 AA 所致的损伤时，浓度适合是非常
关键的。
因此，通过体外实验，本研究初步阐明 AA可诱
导肾小管上皮细胞凋亡和反馈性增殖，促进 MIF 的
释放，进而调控巨噬细胞相关的炎症反应。SSBE
具有一定潜在的抗炎作用，不仅抑制 MIF 的表达，
而且也可抑制小管上皮细胞的增殖。然而，尚需通
过体内实验和更深入的分子机制研究，进一步证实
和明确 SSBE抗 AA所致的肾损伤过程。
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·399·中国药理学与毒理学杂志 2013 年 12 月第 27 卷第 6 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 6，Dec 2013
Protective effect ofSedum sarmentosum Bunge extract against
aristolochic acid-induced rat renal tubular
epithelial cell injury
LU Hong1，CHEN Bi-cheng2，HU Li-ping1，HONG Wei-long2，LIN Cheng-cheng2，BAI Yong-heng2
(1． Department of Laboratory Medicine，2． Laboratory of Surgery，the First Affiliated Hospital
of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China)
Abstract:OBJECTIVE To investigate the protective effect of Sedum sarmentosum Bunge extract
(SSBE)on aristolochic acid (AA)-induced renal tubular epithelial cell injury，and to explore its possible
molecular mechanisms． METHODS In vitro，NＲK-52E cells were divided randomly into 3 groups，solvent
control group，AA 1，5，10，50，100 mg·L －1 group and AA 10 mg·L －1 + SSBE 10，50，100，500 and
1000 mg·L －1 ． After cells were cultured for 24 h，the morphology of NＲK-52E cells was observed with in-
verted /phase contrast microscopy． Hoechst 33258 staining and flow cytometry analysis were used to de-
termine cell apoptosis and necrosis． The expression of macrophage migration inhibitory factor (MIF)
was measured by ELISA and immunofluorescent analysis． Using real － time ＲT-PCＲ and western blot，
mＲNA and protein expressions of p53 and c-Myc were quantified． ＲESULT Injury obviously increased in
AA-treated cells by microscopy and Hoechst 33258 staining，and it aggravated with the passage of time
and increase of concentrations． Compared with normal control group，AA 10 and 50 mg·L －1 induced ap-
optosis of NＲK-52E cells，and promoted the expression of p53 and c-Myc (P ＜ 0． 05) ，The secretion
and expression of MIF protein significantly increased in NＲK-52E cells in AA 10 and 50 mg·L －1 groups
(P ＜0． 05)． Compared with AA 10 mg·L －1 group，with SSBE 1000 mg·L －1 treatment，injury in NＲK-
52E cells was alleviated，and expression of MIF protein also decreased (P ＜0． 05)． In addition，SSBE
1000 mg·L －1 decreased expression of c-Myc and p53 in concentration dependent manner (P ＜0． 05)．
CONCLUSION AA-induced injury in NＲK-52E cells involves in cellular apoptosis and proliferation． AA pro-
motes the expression of MIF，which regulates the gathering and activation of macrophages in inflamma-
tory response． AA-induced injury can be reduced with the treatment of SSBE by down-regulating expres-
sion of MIF．
Key Words:Sedum sarmentosum;plant extracts;aristolochic acid;macrophage;macrophage
migration-inhibitory factor;apoptosis
Foundation item:The project supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LQ12H050001) ;Natural
Science Foundation of Zhejiang Province (LY12H050004) ;Wenzhou Municipal Science and Technology Plan Project
(Y20110028) ;Wenzhou Municipal Science and Technology Plan Project (Y20110072)
Corresponding author:BAI Yong-heng，E-mail:greatsailor@163． com，Tel: (0577)88069338
(收稿日期:2013-06-27 接受日期:2013-08-22)
(本文编辑:付良青)
·499· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 12 月第 27 卷第 6 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 6，Dec 2013