全 文 ：— 42 — 现代中药研究与实践2016年第30卷第6期Chin. Med. J. Res. Prac., 2016 Vol. 30 No. 6
·制剂工艺·
基金项目：苏州市科技发展计划项目（SYSD2014173）
作者简介：余　辉（1965―），男，学士，副主任中药师，研究方向：中药饮片质量管理与科研工作。E-mial: yuhuishi.2008@163.com
通讯作者：王建平（1973―），男，学士，副主任中药师，研究方向：中药药剂及调剂工作。E-mail: wushuang232@sohu.com
正交试验法优选垂盆草颗粒的水提工艺
余　辉，张咏梅，陈晓峰，王建春，汪铜芳，王建平 *
( 张家港市中医医院 江苏省企业研究生工作站，江苏 张家港 215600)
摘　要：目的　优选垂盆草颗粒水提工艺。方法　应用HPLC和正交试验，以垂盆草颗粒中君药垂盆
草的主要成分活性成分槲皮素、山柰素、异鼠李素三种黄酮成分总含量提出量、全方收膏率的综合评分为
考察指标，以提取时间、提取次数、加水量 3个因素设计 L9(34) 正交试验优选垂盆草颗粒水提工艺。结果
最佳水提工艺为加 10 倍量水回流提取 2次，每次 1 h。结论　优选的提取工艺稳定可靠，可用于垂盆草颗
粒的生产制备。
关键词：垂盆草颗粒；正交试验；提取工艺；总黄酮
中图分类号：R284.2 文献标识码： A 文章编号：1673-6427(2016)06-42-04
doi: 10.13728/j. 1673-6427. 2016. 06. 013
Optimization of Extraction Process of Sedum sarmentosum Granules
by Orthogonal Test
YU Hui, ZHANG Yong-mei, CHEN Xiao-feng, WANG Jian-chun, WANG Tong-fang, WANG Jian-ping*
(Zhangjiagang Hospital of Traditional Chinese Medicine Group Corporation, Graduate workstation of enterprises
in Jiangsu Province, Zhangjiagang 215600, China )
Abstract: Objective　To optimize water reflux extraction technology of Sedum sarmentosum granules.
Methods　By using the HPLC and orthogonal experiment, with the content of uercetin, kaempferide and isorha-
mnetin and dry ointment yield rate as the observed index.And taking extraction time, extraction times ,and amount
of water added as the factors. L9(3
4) orthogonal test was designed to optimize the extraction technology of Sedum
sarmentosum granules. Results　The optimal technology was to add water with an amount 10 times as much
as that of drugs and to conduct extraction twice,1 h for each. Conclusion　The optimized process is stable and
reliable, and can be used for the extraction of Sedum sarmentosum granules.
Key words: Sedum sarmentosum granules; orthogonal test; extraction process; total fl avonoids
“垂盆草颗粒”处方来源于我院名老中医的临
床经验方，在临床使用多年，全方由垂盆草、茵陈、
金钱草等七味药组成，具有清热解毒、益肝化瘀、
保肝降酶、利湿退黄、散瘀止痛之效。临床主要用
于治疗温热中阻、瘀血阻络所致的脘胁胀痛、口苦、
黄疸、胸闷、急、慢性肝炎见上述症候者等。方中
垂盆草为君药，性甘、淡、凉，归肝、胆、小肠经，
具有利湿退黄，清热解毒之功效，用于湿热黄疸，小
便不利，痈肿疮疡 [1]。原方为汤剂，存在服用不便、
病人依从性差、煎煮繁琐等问题，根据临床应用经
验，拟将其研制为颗粒剂，作为医院制剂开发使用。
垂盆草的主要活性成分为各种黄酮类成分，《中国药
典》（2015 年版）将槲皮素、山柰素、异鼠李素作为
控制垂盆草药材饮片的质量指标，故本试验以上述三
种黄酮类成分的总含量和干膏得率的综合评分值为
考察指标，设计 L9(34) 因素水平表进行正交试验 [2]，
确定垂盆草颗粒的最优水提工艺的因素水平。
1　仪器与材料
1.1　仪器
Waters2695 高效液相色谱仪，Waters 2998 紫外
检测器，Empower 色谱工作站；AG135 型电子天平
（瑞士梅特勒）；A1104N 电子分析天平 ( 上海精密科
学仪器有限公司 )；CQ250 超声清洗器（33kHz±2Hz，
250±70W，上海船舶电子设备研究所）。
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1.2　材料
处方饮片均来自张家港市中医医院药剂科，由钱
伟副主任中药师鉴定，符合 2015 版《中国药典》一
部项下规定。槲皮素对照品（批号：13122506），山
柰素对照品（批号：14010701），异鼠李素对照品（批
号：13053007），均购于成都曼斯特科技开发有限公
司；甲醇为色谱纯（德国默克），水为娃哈哈纯净水，
盐酸为分析纯。
2　方法与结果
2.1　色谱条件 [3]
色 谱 柱 为 Hedera ODS-2（4.6 mm×200 mm，
5μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇
（A）∶ 0.4% 磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱，
程序见表 1。
表 1　流动相梯度洗脱程序
Tab. 1　The gradient elution program of mobile phase
T(min) V(ml/min) A(%) B(%)
0-12 1 45 55
14-24 1 50 50
26-36 1 20 80
38-48 1 45 55
2.2　溶液制备
2.2.1　对照品溶液的制备　　精密称取槲皮素、山柰
素、异鼠李素各 18.20、5.13、5.28 mg，分别放入 10
ml 量瓶中，加适量甲醇溶解，后用甲醇定容至刻度，
摇匀备用。分别为取 1 ml 上述已配制的三种对照品溶
液置于 25 ml 量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，制
成每 1 ml 分别含槲皮素、山柰素、异鼠李素 0.072 8 、
0.020 52、0.021 12 mg 的混合对照品溶液。
2.2.2　供试品溶液 [4]　　按处方比例分别称取各药
味，加入适量水，按设计的因素水平进行提取，提
取液滤过，合并，后定容至 1 000 ml。精密量取定容
后的提取液 10 ml 置于具塞锥形瓶中，加入甲醇 -25%
盐酸溶液（4∶ 1）混合溶液 25 ml，后称定重量，加
热回流 2 h，放冷后再称定重量，用甲醇 -25% 盐酸
溶液（4∶ 1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，先
用滤纸过滤，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜压滤后，
取续滤液备用。
2.2.3　阴性对照液　　按处方比例取不含垂盆草的
其余药材，按照水提工艺同法制得阴性样品，取此阴
性样品 10 ml，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法
制备即得。
2.3　方法学考察　　
2.3.1 专属性考察　　分别吸取对照品溶液、供试品
溶液、阴性对照溶液各 10 μl，注入液相色谱仪，按
0.10
0.08
0.08
0.04
0.02
0.00
1
2
A
3
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
min
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
min
“2.1”项下色谱条件测定。结果显示，供试品色谱中，
槲皮素、山柰素、异鼠李素与对照品的保留时间一致；
主成分峰与杂质峰分离度大于1.5，阴性对照无干扰。
色谱图见图 1。
图 1　对照品、供试品、阴性对照溶液的HPLC图
A. 混合对照品； B. 供试品； C. 阴性样品
（1. 槲皮素； 2. 山柰素； 3. 异鼠李素）
Fig. 1　HPLC of reference substance, sample and
negative control solution
A. Reference Substance; B. Sample; C. Negative control solution
(1. Quercetin; 2. Kaempferide; 3. Isorhamnetin)
2.3.2　线性关系考察　　精密吸取混合对照品储备
溶液各 1、2、4、6、10、20 μl 进样，按“2.1”项
下色谱条件测定，并记录峰面积。以槲皮素、山柰
素、异鼠李素的进样量（μg）为横坐标 X，以三者
相应的对照品的峰面积为纵坐标 Y，绘制标准曲线，
进行回归处理。结果槲皮素线性回归方程为：Y =
3 056 782.1X - 12 873.4，r = 0.999 9 ；山柰素的线性
回归方程为 Y = 3 087 291.4X - 6 011.4，r = 0.999 8 ；
异鼠李素的线性回归方程为：Y = 2 578 261.3X-
9 651.4，r = 0.999 9。结果表明槲皮素、山柰素、异
鼠李素分别在 0.072 8 ~ 1.456 mg，0.020 52 ~ 0.401 4
mg，0.021 12 ~ 0.422 4 mg线性范围内，线性关系良好。
2.3.3　精密度试验　　精密吸取上述每 1 ml 含槲皮
素、山柰素、异鼠李素分别为 0.072 8 mg、0.020 52
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
2
3
1
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
min
B
C
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mg、0.021 12 mg 的混合对照品溶液，在上述色谱条
件下，重复进样 6 次后进行分析测定，进样量均为
10 μl，同时测定槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积。
结果计算得出槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积的
RSD分别为 0.7%、0.8%、1.2%，该试验结果表明仪
器的精密度良好，符合含量测定的要求。
2.3.4　稳定性试验　　取同一批供试品溶液，于室温
下放置，分别于 0、2、4、6、8、10、12 h 后吸取 10
μl 进样进行分析测定，在上述色谱条件下进行测定
供试品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积，结果
槲皮素、山柰素、异鼠李素三者峰面积的 RSD分别
为 1.2 %、1.1%、1.0%，说明按此方法制备的供试品
溶液在该环境下 12 h 内稳定性良好。
2.3.5　重复性试验　　取同一批样品，按“2.2”项
下供试品溶液的制备方法平行制备 6份供试品溶液，
精密吸取 6份供试品溶液各 10 μl 进样，在“2.1”
项下色谱条件进行分析测定，结果槲皮素、山柰素、
异鼠李素三者成分含量的 RSD分别为 1.2%、0.8%、
1.1%，均符合要求，表明该方法重复性良好。
2.3.6　加样回收率试验　　采用加样回収法，精密量
取 10 ml 已知三种黄酮类成分含量的同一批样品溶液
6份，精密加入适量的混合对照品溶液，按“2.2”项
下供试品溶液的制备方法进行制备。后按照“2.1”
项下色谱条件分别进样 10 μl，测定三者的峰面积并
计算含量，再分别计算三者的加样回收率，结果三
者的平均回收率分别为 99.2%、98.9%、99.7%，RSD
分别为 1.2%、1.3%、1.2%（n = 6）。结果见表 2 ~ 4。
表 2　槲皮素的加样回收率试验结果 (n = 6)
Tab. 2　Determination results of quercetin (n = 6)
取样量
(ml)
原有量
(μg)
加入量
(μg)
测得量
(μg)
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
10 238 145.6 383.1 99.7
10 238 145.6 379.6 97.3
10 238 145.6 381.2 98.4 99.2 1.2
10 238 145.6 384.3 100.5
10 238 145.6 382.6 99.3
10 238 145.6 383.4 99.9
表 3　山柰素的加样回收率试验结果 (n = 6)
Tab. 3　Determination results of Kaempferid (n = 6)
取样量
(ml)
原有量
(μg)
加入量
(μg)
测得量
(μg)
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
10 68 41.04 109.01 99.9
10 68 41.04 108.21 98.0
10 68 41.04 108.36 98.3 98.9 1.3
10 68 41.04 109.35 100.8
10 68 41.04 108.65 99.0
10 68 41.04 107.95 97.3
2.4　干膏得率测定 [5]
分别精密量取提取液 20 ml，置已干燥至恒重的
蒸发皿中，水浴蒸干后置于 105℃烘箱中干燥 3 h，
置干燥器中冷却 0.5 h，迅速精密称定质量，至两次
质量差异不超过 0.3 mg 为止，记录各样品液的干膏
质量，计算干膏得率。
表 4　异鼠李素的加样回收率试验结果 (n = 6)
Tab. 4　Determination results of Isorhamnetin (n = 6)
取样量
( ml)
原有量
(μg)
加入量
(μg)
测得量
(μg)
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
10 104 42.24 145.36 97.9
10 104 42.24 146.21 99.9
10 104 42.24 145.98 99.4 99.7 1.2
10 104 42.24 146.35 100.3
10 104 42.24 146.03 99.5
10 104 42.24 146.86 101.5 　
2.5　正交试验设计
在参考文献、预实验单因素考察各因素水平范围
的基础上，选择提取次数、提取时间及加水量为考察
的三个因素，以总黄酮的含量和干膏得率为主要的评
价指标 [6]，据此设计 L9(34) 正交试验。为客观反映各
因素间的关系及因素水平对水提液质量的影响，拟
采用综合加权评分法进行数据处理 [7]，总分以 100 分
计，其中总黄酮的含量占 50 分，干膏得率占 50 分。
A = 50×B0/B1 + 50×C0/C1，其中 A 指综合评分，B0
指总黄酮含量，B1 总黄酮含量最大值，C0 指干膏得
率，C1 指干膏得率最大值。
按垂盆草颗粒的处方比例称取 9 份药材，因素
水平见表 5。参照表 5 中的因素与水平安排提取方
案，药材加适量水煎煮一定的时间与次数后合并提取
液，过滤浓缩定容至100 ml，得药液后检测各项指标。
正交试验结果及综合评分值的方差分析见表 6 ~ 7。
表 5　正交试验因素水平表
Tab. 5　Factors and levels in the orthogonal design
水平 因素A加水量 ( 倍 ) B 提取时间 (h) C 提取次数 ( 次 )
1 6 1 2
2 8 1.5 3
3 10 2 4
由表 6进行直观分析可知，三个因素对总黄酮含
量和干膏得率综合评分值的影响大小的顺序为 A ＞
B ＞ C，即加水量 ＞ 提取时间 ＞ 提取次数。经方
差分析表明加水量对提取结果具有显著性影响，而
提取次数和提取时间则对提取结果的影响无统计
学意义。结合实际生产，优选出的最佳提取工艺为
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A3B1C1，即按处方比例称取药材后，加 10 倍量水，
提取 2次，每次 1 h。
表 6　正交试验结果
Tab. 6　Results of the orthogonal test
试验号 A B C D(空白 ) 总黄酮 (mg/g) 干膏得率 OD( 分 )
1 1 1 1 1 1.985 6 19.32 85.72
2 1 2 2 2 1.890 8 17.53 79.95
3 1 3 3 3 1.903 5 19.78 84.61
4 2 1 2 3 1.986 7 20.03 87.12
5 2 2 3 1 2.001 3 18.84 85.18
6 2 3 1 2 2.013 4 17.21 82.32
7 3 1 3 2 2.052 1 24.72 97.78
8 3 2 1 3 2.043 8 23.89 95.97
9 3 3 2 1 2.032 9 25.87 99.53
K1 83.427 90.207 88.003 90.143
K2 84.873 87.033 88.867 86.683
K3 97.76 88.82 89.19 89.233
R 14.333 3.174 1.187 3.46
表 7　综合评分方差分析
Tab. 7　Results of variance analysis
方差因素 离差平方和 自由度 F F临界值 显著性
A 373.603 2 19.356 19 *
B 15.185 2 0.787 19
C 2.258 2 0.117 19
D( 误差 ) 19.302 2 1 19
注：F 0. 05（2，2） =19
2.6　验证试验
按处方比例称取各药材共 3份， 每份 200 g， 按优
选后的最佳提取工艺参数进行提取，分别测定计算总
黄酮的含量以及干膏的得率。具体结果见表 8。
表 8　验证试验结果
Tab. 8　Results of verification test
药材量 (g) 总黄酮含量 (mg/g) 干膏得率 (%)
200 2.053 1 24.31
200 2.048 9 23.87
200 2.050 1 24.02
Average 2.050 7 24.066 7
RSD(%) 0.1 0.9
验证试验的结果表明，本研究所优选的垂盆草颗
粒的提取工艺条件简单、可行性高、适合大生产、稳
定性好，可用于后续该制剂生产中的提取工艺。
3　讨论
垂盆草颗粒处方由垂盆草、茵陈、虎杖等药组
成，临床上使用多年，具有利湿退黄、益肝化瘀、
散瘀止痛的功效 [8]。原临床应用以汤剂为主，患者服
用中药汤剂存在依从性差、携带不方便、保质期短、
剂量不精确等缺点。在保持本方原有疗效的基础上，
本实验结合现代化药物制剂技术将汤剂研制成携带
和服用方便、生物利用度高的颗粒剂，具有较好的实
际意义。
在建立 HPLC 方法时，本试验流动相选择参考
《中国药典》（2015 年版），前期选择甲醇 - 0.4% 磷
酸（45 ∶ 55），发现山柰素不能与其他成分很好地分
离。故采取梯度洗脱的方法，在第 12 分钟增加甲醇
比例，结果三种黄酮成分都可以较好地与其他组分分
离。考虑到单一考察指标优选中药提取工艺不具全面
性，而多指标考察时各指标的影响程度，均会对结果
造成影响，数据处理引入了综合指标概念，给予关键
因素相应的权重系数，不仅将具有不同考察范围的指
标转变成一个数值，且较好地避免单一指标评价的片
面性，分析结果更为客观、科学。
本文通过HPLC 法同时测定垂盆草中槲皮素、山
奈素、异鼠李素，按药典要求进行方法学考察，具有
分离度好、专属性强、稳定性佳、结果准确的特点，
为正交试验优选垂盆草颗粒水提工艺条件提供了科
学依据。本试验所确定的垂盆草颗粒优选提取工艺，
具有提取效率较高、操作简单、适合大生产的特点，
且批间质量稳定，本研究所优选的考察因素可应用于
垂盆草颗粒制剂的提取工艺。
参考文献
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收稿日期：2016-09-06