全 文 ：［文章编号］ 1000-4718(2013)12-2172-07
［收稿日期］2013-07-23 ［修回日期］2013-10-29
* ［基金项目］浙江省自然科学基金资助项目(No． LQ12H050001;No． LY12H050004);温州市科技计划(No．
Y20110028;No． Y20110072)
△通讯作者 Tel:0577-88069338;E-mail:greatsailor@ 163． com
马兜铃酸诱导大鼠肾小管上皮细胞表型转化和
胶原累积及垂盆草提取物的作用*
陆 红1， 胡丽萍1， 洪 丹2， 洪炜龙3， 林成成3， 王斯璐3， 陈必成3， 白永恒3△
(温州医科大学附属第一医院 1医学检验中心，3外科实验室，浙江 温州 325000;
2温州医科大学生命科学学院，浙江 温州 325035)
［摘 要］ 目的:研究垂盆草(SSB)提取物对马兜铃酸(AA)诱导的肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积的
作用，并初步探讨可能的分子机制。方法:将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞(NＲK-52E)分为:(1)溶剂对照组:
未加入 SSB和 AA;(2)AA损伤组:只加 AA，浓度为 1 ～ 100 mg /L;(3)SSB提取物干预组:在加入 10 mg /L AA基
础上，同时加入 SSB提取物(10 ～ 2 000 mg /L)。细胞培养 24 h后，酶联免疫吸附试验检测转化生长因子 β1(TGF-
β1)含量;细胞免疫荧光染色检测肌成纤维细胞标志物 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮细胞标志物 E-cadherin和
基质成分 III型胶原的表达;实时荧光定量 PCＲ 检测 α-SMA、E-cadherin、骨形成蛋白 7(BMP-7)和 I 型胶原 mＲNA
的表达。结果:AA可诱导 NＲK-52E细胞呈现纤维化样改变;1 mg /L 和 10 mg /L AA 不仅可增加基质成分 I 型和
III型胶原的表达量，同时也可促进 α-SMA表达，抑制 E-cadherin的表达。用 SSB提取物干预后，AA所致的纤维化
改变明显减轻;SSB 提取物下调了 α-SMA、I 型和 III 型胶原的表达，并且促进 E-cadherin 和 BMP-7 的表达。此外，
SSB提取物也抑制 TGF-β1 的分泌，并呈浓度依赖性。结论:应用 SSB提取物干预可明显降低 AA所致的肾纤维化
效应，可能的机制为 SSB提取物降低 TGF-β1 的表达，抑制小管上皮细胞的表型转化，进而抑制胶原的累积。
［关键词］ 垂盆草;马兜铃酸;转化生长因子 β1;上皮 －间充质转化;胶原
［中图分类号］ Ｒ285． 5 ［文献标志码］ A doi:10． 3969 / j． issn． 1000-4718． 2013． 12． 010
Sedum sarmentosum Bunge extract inhibits epithelial-mesenchymal transi-
tion and collagen accumulation in aristolochic acid-treated rat renal tubu-
lar epithelial cells
LU Hong1，HU Li-ping1，HONG Dan2，HONG Wei-long3，LIN Cheng-cheng3，WANG Si-
lu3，CHEN Bi-cheng3，BAI Yong-heng3
(1Department of Laboratory Medicine，3Wenzhou Key Laboratory of Surgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical
University，Wenzhou 325000，China;2School of Laboratory Medicine and Life Science，Wenzhou Medical University，
Wenzhou 325035，China． E-mail:greatsailor@163． com)
［ABSTＲACT］ AIM:To investigate the effect of Sedum sarmentosum Bunge (SSB)extract on epithelial-mesenchy-
mal transition (EMT)and collagen accumulation induced by aristolochic acid (AA) in renal tubular epithelial cells．
METHODS:Ｒat renal tubular epithelial NＲK-52E cells were randomly divided into 3 groups，including control group (only
treated with solvent)，AA group (treated with AA at concentrations ranging from 1 to 100 mg /L)and SSB group (treated
with AA at a concentration of 10 mg /L plus SSB extract at concentrations ranging from 10 to 2 000 mg /L)． After cultured for
24 h，the morphology of the NＲK-52E cells was observed under inverted phase-contrast microscope． The level of transforming
growth factor β1(TGF-β1)in the culture supernatant was measured by ELISA． Immunofluorescent analysis was performed to
detect the expression of epithelial marker α-smooth muscle actin(α-SMA)，mesenchymal marker E-cadherin，and extracellu-
lar cell matrix component type III collagen． The mＲNA expression of E-cadherin，α-SMA，bone morphogenetic protein 7
(BMP-7)and type I collagen was also quantified by real-time PCＲ． ＲESULTS:Fibrosis-like reaction observed under mi-
croscope was obviously increased in AA-treated NＲK-52E cells，and aggravated as the increase in the concentration of AA．
AA at concentrations of 1 and 10 mg /L increased the expression of α-SMA，type I and type III collagens，and decreased
the expression of E-cadherin． With SSB extract treatment，fibrosis in NＲK-52E cells was alleviated，accompanied with the
decreasing expression of α-SMA，type I and type III collagen，and the enhancing expression of E-cadherin and BMP-7． Mo-
·2712· 中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2013，29(12) :2172-2178
reover，SSB extract down-regulated TGF-β1 level in a concentration-dependent manner． CONCLUSION:AA-induced fi-
brosis-like reaction in renal tubular epithelial cells is reduced by the treatment with SSB extract． The possible mechanism is
that SSB extract decreases TGF-β1 level，and inhibits renal EMT and collagen accumulation induced by AA．
［KEY WOＲDS］ Sedum sarmentosum Bunge;Aristolochic acid;Transforming growth factor β1;Epithelial-mesen-
chymal transition;Collagen
马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy，
AAN)是服用马兜铃酸(aristolochic acid，AA)类中草
药(如马兜铃、天仙藤、关木通等)引起的一类特殊的
肾小管间质损害，进而导致急、慢性肾功能衰竭［1］。
体内 AAN主要病理表现为进行性肾间质纤维化［2］，
但 AA如何引起间质纤维化，其机制尚不清楚，且临
床上也无确实有效的治疗药物。垂盆草(Sedum sar-
mentosum Bunge，SSB)是一种景天科景天属多年生草
本植物，其提取物具有抑制炎性渗出和免疫调节的
作用，可抵抗肝纤维化的发生发展［3］。本文从体外
实验角度，观察 SSB 提取物是否具有抗 AA 所致的
肾小管间质纤维化作用，并初步探讨其可能的分子
机制。
材 料 和 方 法
1 材料
1． 1 试剂 马兜铃酸 I，购自 Sigma，纯度 97%，25
mg用 50 μL 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)
溶解，再用 DMEM 细胞培养液(12． 45 mL)稀释成 2
g /L原溶液;垂盆草提取物购自安徽宣城百草植物工
贸公司，规格 50∶ 1，1 g 先用 DMSO 溶解(50 μL)，再
用 DMEM(9． 95 mL)配成 100 g /L 原溶液;DMEM 细
胞培养液购自 HyClone;胎牛血清购自杭州四季青生
物公司;胰蛋白酶和 TＲIzol 提取液购自 Gibco;转化
生长因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)
ELISA检测试剂盒购自上海西唐生物;兔抗鼠 E-cad-
herin多克隆抗体购自 Abcam;α-平滑肌肌动蛋白(α-
smooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体购自 Santa
Cruz;III 型胶原多克隆抗体购自 Bioworld;Dylight
488 或 594 标记山羊抗兔 IgG 购自北京康位生物公
司;实时荧光定量 PCＲ试剂购自 Promega。
1． 2 细胞 大鼠肾小管上皮细胞系 NＲK-52E 购于
中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1． 3 仪器 MyCycler 梯度 PCＲ 仪，Bio-Ｒad 产品;
7500 定量 PCＲ 仪，Applied Biosystems 产品;Varios-
kan Flash全波长多功能扫描仪，Thermo Scientific 产
品;DM4000 B LED荧光正置显微镜，Leica产品。
2 方法
2． 1 大鼠肾小管上皮细胞的培养和处理 NＲK-
52E细胞置于含 5%胎牛血清的 DMEM 培养液，37
℃、5% CO2 培养箱内培养。实验时，将细胞按适当
浓度接种于 6 孔板中，待细胞 70% ～ 80%融合时，换
成无血清 DMEM 培养液并开始正式实验。
2． 2 对照溶剂实验 实验中药物 AA和 SSB提取物
均用溶剂 DMSO 溶解，故先评价 DMSO 对细胞外基
质(extracellular matrix，ECM)累积和 TGF-β1 的影响。
AA浓度为 1 ～ 100 mg /L时 DMSO使用体积为 0． 001
～0． 1 mL /L体系，而 SSB 提取物浓度为 10 ～ 2 000
mg /L时 DMSO体积为 0． 0005 ～ 0． 1 mL /L 体系。因
此，DMSO损伤实验分为 0． 001、0． 01 和 0． 1 mL /L 3
组。对照溶剂实验结果证实在本研究使用的不同浓
度范围内 DMSO 对 NＲK-52E 细胞的 ECM 累积和
TGF-β1 生成的影响并无显著差异。
2． 3 干预实验分组 将实验分成 3 组，分别为(1)
溶剂对照组:不加 SSB 和 AA，只加 0． 1 μL DMSO;
(2)AA损伤组:只加 AA，浓度为 1 ～ 100 mg /L;(3)
SSB提取物干预组:在加入 10 mg /L AA 基础上，同
时加入 SSB提取物(10 ～ 2 000 mg /L)。按照上述分
组方案，加入相应药物，置 37 ℃、5% CO2 的培养箱
中培养 24 h后，用倒置相差显微镜观察细胞形态学
变化。
2． 4 ELISA检测促纤维化因子 TGF-β1 含量 取对
数生长期的 NＲK-52E 细胞，以不同浓度 AA(1 ～ 10
mg /L)和 SSB提取物(10 ～ 2 000 mg /L)作用 24 h，收
集培养液。TGF-β1 含量检测采用双抗体夹心 ABC-
ELISA法，即用抗大鼠 TGF-β1 单抗包被于酶标板
上，标准品和样品中的 TGF-β1 与单抗结合，加入生
物素化的抗大鼠 TGF-β1，形成免疫复合物连接在板
上，辣根过氧化物酶标记的 streptavidin 与生物素结
合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，于
450 nm处测吸光度(A)，通过绘制标准曲线求出浓度。
2． 5 实时荧光定量 PCＲ检测 E-cadherin、α-SMA、骨
形成蛋白 7( bone morphogenetic protein 7，BMP-7) 和
I型胶原 mＲNA的表达 采用 TＲIzol 试剂提取已处
理细胞中的 ＲNA，于 260 和 280 nm测定吸光度值以
确定样本纯度和浓度。根据试剂说明书将 ＲNA 逆
转录成 cDNA。应用 Primer 5． 0 软件设计针对 E-
cadherin、α-SMA、BMP-7 和 I型胶原 mＲNA特异性引
物，以 β-actin作为内参照，采用相对定量法计算获
得结果。引物序列见表 1，由上海捷瑞公司合成。取
逆转录产物 1 μL 进行 PCＲ 扩增，PCＲ 扩增体系:5
μL 2 × SYBＲ Green荧光定量试剂、2 μL引物(上、下
游各 1 μL，终浓度 200 nmol /L)、2 μL反应缓冲液和
1 μL cDNA。扩增程序为:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，60
·3712·
℃ 35 s，40 个循环。以熔解曲线评价 PCＲ 结果可靠
性，2 － ΔΔCt 法计算相对 mＲNA 表达量。ΔΔCt =
［Ct目的基因(待测样品)－ Ct内参照(待测样品)］－［Ct目的基因(校正样品)
－ Ct内参照(校正样品)］。
表 1 实时荧光定量 PCＲ引物序列
Table 1． Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCＲ
Name Sequence (5’→3’) GenBank Product (bp)
E-cadherin GTGCCACCACCAAAGATA NM_031334． 1 195
GGCTGAGACAACCCTAAT
α-SMA GGCATCCACGAAACCACCT NM_031004． 2 212
CCGCCGATCCAGACAGAAT
BMP-7 GTGGTCAACCCTCGGCACA NM_001191856． 1 215
GGCGTCTTGGAGCGATTCTG
Type I collagen GATCCTGCCGATGTCGCTAT NM_053304． 1 276
GGAGGTCTTGGTGGTTTTGTATTC
β-actin CCCATCTATGAGGGTTACGC NM_031144． 2 150
TTTAATGTCACGCACGATTTC
2． 6 细胞免疫荧光染色检测 E-cadherin、α-SMA 和
III型胶原蛋白的表达 将细胞经胰酶消化收集后，
分别以 2 × 105 个细胞接种于含载玻片的 6 孔板中，
常规培养。培养细胞至 80% ～ 90%融合后，分别用
AA和 AA联用 SSB提取物进行处理 24 h，弃去培养
基，PBS清洗细胞3次，用4%多聚甲醛固定30 min，0．
3% Triton X-100(1 mL /well)破膜，室温 20 min。0．
5%正常山羊血清封闭。在各细胞爬片上滴加Ⅰ抗工作
液，4 ℃孵育过夜，PBS 冲洗 3 次。滴加 Dylight 488
(绿色)或 594(红色)标记的Ⅱ抗工作液，37 ℃孵育 60
min，同上洗涤。细胞胞质绿色或红色为阳性着色。
每组取 3张片，每张片子取20个高倍视野(×400)，运
用 Image-Pro Plus 6． 0软件分析 IA值。
3 统计学处理
采用 SPSS 13． 0 软件包分析，数据以均数 ±标准
差(mean ± SD)表示，均数比较采用单因素方差分
析。以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
结 果
1 倒置相差显微镜观察损伤与干预前后 NＲK-52E
细胞形态学的影响
如图 1 所示，正常情况下，NＲK-52E细胞培养 24
h后，细胞密度极高，细胞间接触紧密;由于接触抑
制，细胞形态小、排列成铺路石状。用不同浓度的
AA作用后，细胞数量下降，细胞损伤表现明显，失去
贴壁作用，细胞漂浮在培养液中;细胞形态变大，出
现纤维细胞样改变(梭状)。用 SSB 提取物干预后，
AA 所致的损伤作用大幅减轻，细胞数量下降不明
显，且细胞形态逐渐恢复正常。
Figure 1． Morphological changes of NＲK-52E cells observed under inverted phase-contrast microscope (× 200)．
图 1 倒置相差显微镜观察 NＲK-52E细胞的形态改变
·4712·
2 SSB提取物对 AA诱导的 ECM累积的影响
纤维化的病理表现为大量 ECM 成分如 I 型和
III型胶原在损伤局部的累积过程。我们通过细胞免
疫荧光染色发现，DMSO 损伤组中各浓度之间表达 I
型和 III型胶原无明显差异;10 mg /L AA 作用 NＲK-
52E细胞后，其表达的 III 型胶原明显增多，见图 2。
同样，实时荧光定量 PCＲ 结果也显示 I 型胶原 mＲ-
NA的表达随着 AA浓度的增加而增高，见图 3A。在
10 mg /L AA基础上用 SSB提取物进行干预，结果发
现，低浓度的 SSB提取物(10 mg /L)对胶原形成的影
响不明显，但中高浓度的 SSB 提取物(100 和 1 000
mg /L)能明显降低 I型胶原 mＲNA和 III型胶原蛋白
的表达水平，见图 2、3B。这些结果提示一定浓度的
SSB提取物能抑制 AA所致的纤维化样效应。
Figure 2． Expression of type III collagen in NＲK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment (× 200)．
图 2 AA对 NＲK-52E细胞中 III型胶原蛋白表达的影响及 SSB提取物的干预作用
Figure 3． The mＲNA expression of type I collagen in NＲK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment． Mean ±
SD． n = 10． * P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs control;#P ＜ 0． 05 vs AA (10 mg /L)．
图 3 AA对 NＲK-52E细胞 I型胶原 mＲNA表达的影响及 SSB提取物的干预作用
·5712·
3 SSB 对 AA 诱导的肾小管上皮细胞表型转化的
影响
细胞免疫荧光染色发现，10 mg /L AA 作用于
NＲK-52E细胞，E-cadherin 蛋白表达下调，而 α-SMA
蛋白表达上调，见图 4。此外，实时荧光定量 PCＲ 结
果同样显示 E-cadherin mＲNA表达明显下降，α-SMA
mＲNA表达明显增加，且上皮 －间充质转化(epithe-
lial-mesenchymal transition，EMT)抑制分子 BMP-7
mＲNA表达也下调(P ＜ 0． 05)，见图 5。这些结果提
示 AA诱导小管上皮细胞胶原累积过程中出现 EMT
效应。通过 SSB 提取物的干预作用，上述改变呈现
相反的趋势，见图 4、5，说明 SSB 提取物可抑制 AA
诱导的 EMT进程。
Figure 4． Expression of E-cadherin and α-SMA in NＲK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment (× 200)．
图 4 AA对 NＲK-52E细胞 E-cadherin和 α-SMA表达的影响及 SSB提取物的干预作用
·6712·
Figure 5． Effects of SSB extract on mＲNA expression of EMT-related genes in NＲK-52E cells induced by AA． Mean ± SD． n = 6．
* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs control．
图 5 SSB提取物对 AA诱导的 NＲK-52E细胞 EMT相关基因 mＲNA表达的影响
4 SSB提取物影响 TGF-β1 的表达水平
DMSO损伤实验中，各组细胞间产生 TGF-β1 量
无明显差异。在低于 10 mg /L AA 作用 NＲK-52E 细
胞后，细胞分泌 TGF-β1 量呈现浓度依赖性，即随着
AA浓度增高，TGF-β1 表达量逐渐增多，到 AA 浓度
为 10 mg /L时达峰值［(603． 4 ± 30． 1)ng /L］。应用
SSB提取物干预 10 mg /L AA后，随着 SSB 提取物浓
度从 10 mg /L增加到 2 000 mg /L，TGF-β1 分泌量下
降到(257． 9 ± 19． 8)ng /L，见图 6，提示 SSB 提取物
具有抑制 TGF-β1 表达的作用。
Figure 6． The level of TGF-β1 in NＲK-52E cells determined by ELISA．
图 6 ELISA检测 NＲK-52E细胞中 TGF-β1 水平改变
讨 论
在体内，AAN主要表现为广泛的间质纤维化，同
时伴有肾小管萎缩及肾小管消失等病理改变［2］。临
床上 AA引起的肾纤维化具有不可逆性，同时缺乏有
效的治疗药物，病人常常以肾衰竭和尿毒症为结局。
因此，积极探索 AA 所致肾纤维化的分子机制，并给
予有效的早期干预，对于 AAN 病人具有十分重要的
意义。我们前期研究显示，AA可诱导肾小管上皮细
胞凋亡，并活化 Sonic hedgehog 信号，促使 ECM 成分
(如 I型和 III型胶原)在损伤局部广泛累积，从而导
致纤维化的发生［4］。本研究中，AA 促进了 α-SMA
表达，抑制 E-cadherin 表达，并下调了 BMP-7 mＲNA
的表达。这些结果提示肾小管上皮细胞遭受 AA 损
伤后，形成了对损伤微环境更为耐受的肌成纤维细
胞，即 EMT效应。此外，研究也发现，在 AA 损伤肾
小管上皮细胞过程中，TGF-β1 的表达明显升高。
TGF-β1 是目前公认的较强的促纤维化因子，同时也
·7712·
是 EMT过程重要的调节分子。Yang等［5］研究显示，
AA损伤细胞 DNA，导致细胞生长阻滞在 G2 /M 期，
进而引起 JNK信号的活化，促进了 TGF-β1 的表达。
TGF-β1 的高表达不仅促进 EMT进程，也促进了胶原
的累积，最终引起纤维化［6］。
垂盆草又名地蜈蚣草，其化学成分有 N-甲基异
石榴皮碱(N-methylisopelletierine)、二氢-N-甲基异石
榴皮碱、景天庚酮糖(sedoheptulose)、葡萄糖、果糖、
蔗糖等。此药性凉，味甘、淡，新鲜或干燥全草入药，
主要用于治疗湿热黄疽、小便不利、痈肿疮疡。有研
究表明，垂盆草的提取物能抑制炎性渗出、减少肝细
胞损伤、降低血清丙基酸氨基转移酶水平，具有治疗
急、慢性肝炎和抗癌等功效［7-8］。然而目前尚不清楚
SSB提取物能否抑制 AA 所致的肾小管上皮细胞损
伤。本研究结果发现:浓度为 100 ～ 1 000 mg /L SSB
提取物能明显降低 I 型和 III 型胶原的表达水平，提
示一定浓度的 SSB 提取物具有潜在的抗纤维化作
用。此外，我们还观察到 SSB 提取物能下调 α-SMA
的表达，并促进 E-cadherin表达。这些结果提示 SSB
提取物可抑制小管上皮细胞的 EMT 进程。同时，
SSB提取物也抑制了小管上皮细胞分泌和表达 TGF-
β1，通过下调 TGF-β1 表达，进而延缓肾小管上皮细
胞产生胶原的进程。
综上所述，我们通过体外实验初步阐明 AA可促
进 TGF-β1 表达、肾小管上皮细胞 EMT 进程以及胶
原累积，并且 AA 所致的上述这些纤维化效应可被
SSB提取物拮抗。因此，SSB提取物可能具有潜在的
抗纤维化作用。但 SSB提取物如何发挥抗肾间质纤
维化作用，其确实的效应尚需体内实验和更深入的
分子机制研究加以证实和明确。
［参 考 文 献］
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［3］ 张洪超，兰 天，张晓辉． 垂盆草化学成分与药理作
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