全 文 ：火棘基因组 DNA的提取和 RAPD稳定的反应体系的建立
韩 颖　(西南科技大学生命科学与工程学院 ,四川绵阳 621010)
摘要　[目的 ]研究提取火棘基因组 DNA的最佳方法 ,并研究适合火棘的稳定的RAPD反应体系 ,为以后开展火棘的遗传多样性研究、
物种资源研究和亲缘关系鉴定等提供重要的参考。 [方法]采用改进的CTAB法 ,成功地提取了火棘基因组DNA, 并对RAPD反应体系
中的Taq酶 、MgCl2、dNTPs和引物 4个因素进行 4因素 4水平的正交试验设计 ,从中筛选出最佳的优化条件。 [结果 ] 电泳结果显示 ,
DNA无降解 ,杂质少。 DNA浓度较高约为 500ng/μl。并以此DNA为模板 ,成功地建立了 RAPD稳定的反应体系:总体积 25 μl, 包括
25ng的DNA, 1×bufer, 2.3mmol/LMgCl2 , 1.0μmol/L引物 , 0.15mmol/LdNTPs和 2.0U的TaqDNA聚合酶。RAPD扩增程序为:先在
94℃下变性 4min,然后在 94℃下变性 40s, 36.8℃下复性 50s, 72℃下延伸 70s,反应 40个循环 ,最后 72℃延伸 4min。 [结论 ] 改进
的CTAB法能成功地提取火棘基因组DNA,利用正交试验设计所建立的RAPD反应体系 ,可以获得较为稳定 、可靠的扩增产物。该体系
可应用于火棘遗传多样性、亲缘关系等方面的研究中 ,为进一步开展火棘分子生物学研究奠定了基础。
关键词　火棘;RAPD;反应体系
中图分类号　Q949.751.9 　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)19-08876-03
ResearchontheGenomicDNAExtractionandEstablishmentofReproducibleRAPDReactionSystemforPyracanthafortuneana
HANYing　(ColegeofLifeScienceandEngineering, SouthwestUniversityofScienceandTechnology, Mianyang, Sichuan621010)
Abstract　[ Objective] ThereferencefortheresearchonthediversityandresourceofPyracanthafortuneanaandtheidentificationoftherela-
tionofitsvarietieswereprovidedthroughthestudyontheoptimalmethodofDNAextractionandstablesystemofRAPDreaction.[ Method]
ThegenomicDNAofPyracanthafortuneanawassuccessfullyextractedwiththeimprovedCTABmethodandtheoptimalconditioninthesystem
wasselectedwiththeexperimentaldesignof4factors(Taqenzyme, MgcL2 , dNTPsandprimer)at4levels.[ Results] Theelectrophoresisre-
sultindicatedthatthequalityandconcentrationofextractedDNAwereveryhigh(500ng/μl).Afterthat, thereproducibleRAPDreaction
systemwassetupwithextractedDNAastemplate.RAPDswereperformedinvolumesof25μl, containing25ngofDNA, 1×reactionbuffer
(TaKaRaDalian), 2.3 mmol/LMgCl2(TaKaRaDalian), 1.0 μmol/Lprimer(SBSBeijing), 0.15 mmol/LmixtureofdNTPs(TaKaRaDalian)and2.0unitTaqDNAPolymerase(promegaShanghai).TheprocedureofRAPDwasthermalcycler(HYBAID)wasprogrammedfor
1 cycleat94℃for4minutes, folowedby40cyclesat94℃for40seconds, at36.8℃for50secondsandat72℃for70seconds, andfi-
nallyby1cycleat72℃ for4 minutes.[ Conclusion] ThegenomicDNAofPyracanthafortuneanawasextractedwiththeimprovedCTAB
methodandthereactionsystemwasestablishedforthestableandreliabletheprocedureofRAPD.
Keywords　Pyracanthafortuneana;RAPD;Reactionsystem
基金项目　西南科技大学人才引进基金项目(zk043081)。
作者简介　韩颖(1977-),女 ,河北昌黎人 ,硕士 ,从事植物分子生物学
方面的研究。
收稿日期　 2009-03-17
　　火棘(Pyracanthafortuneana)为蔷薇科火棘属常绿灌木
野生果树。现在世界上有 10个种 ,我国有 7个种 ,常见有 4
个种 。火棘主要分布于亚洲东部至欧洲南部 ,在我国主要分
布在西南地区 ,储量极为丰富 [ 1] 。火棘的生态价值 、药用价
值 、食用价值 、化工价值都非常高。笔者以绵阳地区的火棘
品种为材料 ,研究提取川火棘基因组 DNA的最佳方法 ,并通
过进一步试验得出火棘的 RAPD优化体系 ,最后检测该优化
体系的稳定性 。
1990年 , Wiliam和 Welsh等 [ 2-3]几乎同时建立起来了
随机扩增多态 DNA(randomamplificationpolymorphismDNA
RAPD)技术 ,该技术是最早应用于遗传作图和 DNA指纹上
的以 PCR为基础的分子标记。随着 RAPD的应用 ,许多经过
改进的以 PCR为基础的分子标记技术得到发展 ,以适用于
不同的研究目的。以 PCR为基础的分子标记已广泛地应用
于遗传作图 、基因组指纹和多样性分析 ,这是因为该技术相
对比较简单 ,引物设计也不需要预先知道其序列。RAPD-
PCR反应一般使用一个随机寡核苷酸引物 (大约 10个碱
基),该引物与基因组上相应同源互补序列退火结合。如果
该引物的下游(3′末端)不远处也有一处退火结合点 ,这对引
物之间的序列在 DNA聚合酶作用下得到扩增 [ 3] 。
目前 ,对火棘的 RAPD体系的优化还未见报道 ,因此 ,该
试验为以后研究火棘的遗传多样性分析 、物种资源的研究 、
基因组图谱的构建 、亲缘关系的鉴定等方面打下了一定的基
础 ,并提供了重要参考。
1　材料与方法
1.1　植物材料 　植物材料采自绵阳地区 5个天然居群 ,每
居群随机选取 10 ～15株 ,每株保持 15 ～20m。
1.2　基因组 DNA的提取 　采用改良的 CTAB法。参照
JosepHSambrook等的方法 [ 4]并作适当改良 ,进行基因组
DNA的提取。具体方法如下:取约 300 mg叶片 ,在液氮中用
研钵迅速研磨成粉末状 ,转入标记好的 1.5 mlEppendorf管
中;加入预热的裂解缓冲液 [ 2% CTAB(购自 Sigama), 1.42
mol/LNaCl, 20 mmol/LEDTA(pH值 8.0), 100 mmol/LTris-
HCl(pH值 8.0), 2% PVP-40(购自 Sigama), 0.1%抗坏血
酸(购自 Sigama), 0.1%二乙基二硫氨基甲酸 , 0.2%巯基乙
醇 ] 700 μl,混匀。 65℃水浴 30 min,每隔 5 min取出轻轻混
匀;加 700μl酚 /氯仿(1∶1),混匀 , 13 000r/min离心 15min;
吸取 500 ～ 700 μl上清到一个新 Eppendorf管中 ,加 700 μl
Tris-饱和酚 /氯仿(1∶1),混匀 , 13 000 r/min离心 8min;吸取
500～ 700 μl上清到一个新 Eppendorf管中 ,加入 50 μl3
mol/L醋酸钠(pH值 5.2)和 800 μl预冷的无水乙醇 , 4 ℃
13 000 r/min离心 4 min;弃上清 ,加入 500μl1×TE;加 3 ～5
μlRNaseA(购自 Roche)(10 mg/ml), 37 ℃, 30 min;加 3 ～ 5
μlProteinaseK(购自 merck)(10 mg/ml), 37 ℃, 30 min;加
700μlTris-饱和酚 /氯仿 ,混匀。 13 000 r/min离心 8 min;吸
取 500 ～ 700 μl上清到一个新 Eppendorf管中 ,加入 50 μl3
mol/L醋酸钠(pH值 5.2)和 800 μl预冷的无水乙醇。 4 ℃
13 000r/min离心 4min;70%乙醇漂洗 DNA沉淀一次;50μl
责任编辑　李菲菲　责任校对　夏蓉安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(19):8876-8878, 8880
ddH2O或 1×TE溶解 , -20 ℃保存 。
1.3　 PCR扩增及电泳检测　随机引物采用北京赛百盛公
司的引物系列 A、B和 C,经预备试验选择扩增产物稳定 ,重
复性好的 A4引物进行 PCR扩增。基本反应条件为总体积
25μl,其中含 10X的 PCRbufer2.5μl, 1.5mmol/LMgCl2 ,
0.2 μmol/L引物 , 0.2 mmol/LdNTP混合物(购自 TaKaRa),
1.0U的 TaqDNA聚合酶(购自上海 promega)和 1ng/L模板
DNA。扩增程序为:先在 92 ℃下变性 3 min,然后在 92 ℃下
变性 1min, 40℃下复性 1min, 72℃下延伸 2 min,反应 45个
循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min。扩增完毕后 ,在 1.2%的琼脂
糖凝胶上 ,加含 EB0.5 μg/ml电泳分离 ,以 DL2000做 Mark-
er,最后用凝胶成像系统分析电泳结果 ,并保存图像 。
1.4　反应条件设计　RAPD技术是由 PCR发展起来的 ,
PCR合成反应体系由模板 、引物 、dNTPs、MgCl2、耐热 DNA聚
合酶等基本条件构成 ,要想确保 PCR的成功扩增 ,就要对以
上的反应体系中的各种因素进行优化。该试验采用正交设
计试验的方法 ,对火棘嫩叶 RAPD反应体系中的 Taq酶 、
MgCl2、dNTPs和引物浓度 4个因素进行 4因素 4水平的正交
试验设计 ,从中筛选出最佳的优化条件 。该试验为 25 μl反
应体系 ,试验正交设计见表 1、2。
表 1　反应条件正交组合设计因素水平
Table1　OrthogonaldesignfactorlevelsofRAPDreactionconditions
水平
Levels
因素 Factors
Taq酶∥U
Taqpolymerase
MgCl2
mmol/L
dNTPs
mmol/L
引物∥μmol/L
Primers
1 1.5 2.3 0.05 0.7
2 2.0 2.5 0.10 0.8
3 2.5 2.7 0.15 0.9
4 3.0 2.9 0.20 1.0
表 2　反应条件正交组合设计试验实施方案
Table2　ImplementingschemeoforthogonaldesignofRAPDreactioncon-
ditions
试验号
Testnumber
Taq酶∥U
Taqpolymerase
MgCl2
mmol/L
dNTPs
mmol/L
引物∥μmol/L
Primers
1 1.5 2.3 0.05 0.7
2 1.5 2.5 0.10 0.8
3 1.5 2.7 0.15 0.9
4 1.5 2.9 0.20 1.0
5 2.0 2.3 0.15 1.0
6 2.0 2.5 0.20 0.9
7 2.0 2.7 0.05 0.8
8 2.0 2.9 0.10 0.7
9 2.5 2.3 0.20 0.8
10 2.5 2.5 0.15 0.7
11 2.5 2.7 0.05 1.0
12 2.5 2.9 0.10 0.9
13 3.0 2.3 0.10 0.9
14 3.0 2.5 0.05 1.0
15 3.0 2.7 0.20 0.7
16 3.0 2.9 0.15 0.8
2　结果与分析
2.1 　火棘基因组 DNA的提取结果与分析　从图 1可以看
出 ,通过改进的 CTAB法提取的火棘 DNA效果很好 , DNA含
量较高 、无降解 、杂质少 。DNA浓度约为 500 ng/μl。提取
DNA的过程中有许多因素能导致 DNA降解 ,首先是物理因
素 。因为 DNA分子量较大 ,同时又失去了核蛋白的保护 ,机
械张力或高温很容易使 DNA分子发生断裂。因此 ,在实际
操作过程中应尽可能轻缓 ,尽量避免过多的溶液转移及剧烈
的振荡等 ,以减少机械张力对 DNA的损伤 ,同时也应避免过
高的温度。其次 ,细胞内源 DNA酶及细胞破裂释放的次级
产物也会导致 DNA降解。所以在提取 DNA的试验中 ,设计
了裂解缓冲液 ,裂解缓冲液的 pH值应避免接近降解酶的最
适点。由于在过酸的条件下 , DNA腺嘌呤会导致 DNA的不
稳定 ,极易在碱基脱落的地方发生断裂 ,所以大多植物 DNA
提取缓冲液的 pH值为 8.0。在抽提 DNA的过程中如果水相
和有机层的界面不太清楚 ,说明其中的蛋白质含量较高 ,可
增加苯酚 -氯仿抽提的次数或适当地延长离心时间 。分离
DNA与蛋白质一般采用苯酚 -氯仿抽取的方法。苯酚 、氯仿
对蛋白质均有极强的变性作用 ,而对 DNA无影响。
注:第 1条为 DNAMarker,第 2～ 6条为火棘基因组 DNA。
Note:Thefirstbondismarker, 2-6bondsaregenomeDNAofPyra-
canthafortuneana.
图 1　火棘的基因组 DNA
Fig.1　GenomeDNAofPyracanthafortuneana
2.2　RAPD引物筛选结果与分析　该试验用 58个引物(A1
～ A21、B1 ～ B19 、C1 ～ C19)对火棘的 DNA模板进行随机扩增 ,
以筛选出适合于火棘模板 DNA进行 RAPD分析的引物。由
图 2可知 ,在 A组引物中样品产生了清晰的 、条带数多的
DNA扩增谱带。而 B组和 C组引物均未能获得扩增谱带 , A
组中引物 A4的扩增条带清晰 ,且条带数目较多适用于 RAPD
分析扩增。
注:从右至左第 1条为 DNAMarker,第 2 ～ 21条分别为引物 A1 ～
A20的电泳图谱。
Note:Thefirstbondismarkerfromlefttoright, 2-21bondsareelec-
trophoretogramofA1 -A20primers.
图 2　RAPD引物筛选
Fig.2　ThescreeningofRAPDprimer
2.3　Taq酶 、MgCL2、dNTPs、引物浓度筛选结果与分析　通
过正交试验设计 ,共有 16种组合 ,第 5泳道的扩增条带清
887737卷 19期　　　　　　　　　　　　　　　　韩颖　火棘基因组 DNA的提取和RAPD稳定的反应体系的建立
晰 ,且条带数目较多 。因此 ,由图 3可以得出 ,最佳反应条件
为:扩增反应总体积为 25 μl:2.5μl10×bufer, 0.15 mmol/L
dNTPs, 1.0 μmol/L引物 , 2.0 UTaq聚合酶 , 1 ng/μlDNA模
板 , 2.3mmol/LMgCl2。
注:从右至左第 1条为 DNAMarkerDL2000,第 2 ～ 17条为正交表
顺序得到的电泳图谱。
Note:　ThefirstbondisDL2000DNAmarkerfromlefttoright, 2-
17bondsareelectrophoretogramaccordingtheorderofor-
thogonaltable.
图 3　Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物浓度筛选
Fig.3　ThescreeningofTaqpolymerase, Mg2+ , dNTPsand
primerconcentrations
2.4　退火温度的筛选结果与分析 　退火温度是影响 RAPD
反应最重要的因素之一 ,因此 ,筛选最适退火温度是优化
RAPD扩增程序的重要措施之一 。在上述试验因素的最适
条件下 ,同样以火棘为模板 DNA, A4作为引物 ,对退火温度
进行筛选试验 ,结果如图 4所示。
由图 4可以看出 ,在 32 ～ 44 ℃的温度范围内 ,温度越
低 ,扩增带越多 、越强 ,扩增效率高;温度越高 ,扩增带减少 、
变弱 ,扩增效率降低。在保证扩增效率的同时 ,又要达到增
强特异性的目的 ,选择 32 ～ 36 ℃较为适宜。图 4中 ,当退火
温度为 36.8 ℃时 ,扩增条带数目最多 ,且较清晰 。一般来
说 ,退火温度的降低 ,能保证引物与模板的稳定配对 ,同时允许
适当的错配 ,以扩大引物在基因组 DNA中配对的随机性[ 5] 。
注:从左至右按温度梯度从小到大的顺序,第 12条为 DNAMarker
DL2000。
Note:Theorderaccordingtotemperaturegradientfromlefttoright,
thetwelfthbondisDL2000DNAmarker.
图 4　退火温度筛选
Fig.4　Thescreeningofannealtemperature
3　讨论
RAPD的重复性是指对同一试验材料及同一引物 、同样
的人在不同次或不同实验室之间的 PCR扩增结果是否一
致。影响 RAPD重复性的因素很多 ,大致可以分为 5类:①
PCR反应体系中各种影响因素 ,如模板质量 、Mg2+浓度 、
dNTP浓度 、引物浓度 、Taq酶用量及其纯度等;②PCR反应
中仪器设备因素 ,如 PCR仪的性能 、PCR反应管的管壁厚
薄等;③PCR反应中的控制因素 ,如循环次数 、反应循环的
温度设置等;④加样方式等人为误差等。
3.1　 PCR反应体系中各种影响因素
3.1.1　DNA模板质量 。RAPD反应对模板质量要求不高。
各种方法提取的 DNA均能获得一致的扩增结果 ,模板中少
量的蛋白质和 RNA对扩增结果无影响 ,模板降解程度不大 ,
绝大部分分子大于 10 kb,不影响扩增结果 [ 35] 。但用常规方
法提取 DNA时 ,常需要酚 、三氯甲烷等无机溶剂 ,少量的残
留可使 Taq酶失活 ,故使用时可以在保证 DNA浓度的前提
下适当稀释以降低抑制物的浓度 ,并相应增加 Taq酶和
Mg2+用量 ,使反应得以进行。
3.1.2　Mg2+浓度。Mg2+为 Taq酶活性不可缺少的辅助因
子 , Mg2+浓度对反应特异性和扩增效率有重大影响 。Mg2+
浓度过高会使非特异性扩增产物增加 ,过低会使扩增产物减
少 ,电泳谱带不明显 [ 6] 。
3.1.3　dNTP浓度 。一般认为 ,在较大范围内 , dNTP浓度变
化对 RAPD结果影响不大。若浓度太高则容易拖尾 ,识别并
去除错配碱基的机会下降 ,导致错误率升高;太低则 DNA合
成速率较低 ,扩增效果差 。
3.1.4　引物浓度。RAPD对引物浓度不敏感 ,一般认为 ,引
物浓度应为 1.0 ～ 1.5 μmol/L。有的引物可能对模板基因组
不能扩增 ,所以应对引物扩增筛选后再设梯度进行优化。
3.1.5　TaqDNA聚合酶用量及纯度。 TaqDNA聚合酶用量
在很大程度上影响反应结果 。酶量过大 ,非特异性产物大大
增加 ,使 RAPD稳定性降低 ,甚至出现拖尾现象;酶量过小 ,
则扩增效率低 ,使 RAPD多态性降低。模板 DNA中聚合酶
抑制物的浓度 、Taq酶活性高低会影响 Taq酶的用量。模板
DNA中聚合酶抑制物的浓度越低 、Taq酶活性越高 , Taq酶的
用量就越少。一般在 25 μl反应体系中 , 0.5 ～ 2.5 U便可以
得到可重复的清晰条带 ,但具体试验中要摸索 Taq酶的最佳
用量 [ 6] 。不同厂家甚至同一厂家不同生产批次的 Taq酶活
性有时有差异 ,扩增的 RAPD结果也就有差异 。试验中应尽
量使用同一商标的 Taq酶。
3.1.6　RAPD的反应体积。反应体积多采用 25 ～ 50 μl。低
于 20μl,一般不会得到好的重复结果 [ 7] 。
3.2　PCR反应中仪器设备因素　PCR仪的性能对 RAPD
结果有细微影响 。性能优越的 PCR仪有较快的温度变化率
和在特定温度上的稳定性 ,这样在比较短的时间内达到设定
温度并且波动幅度比较小。PCR反应管的管壁厚薄直接影
响传热性能 ,从而影响反应体系的反应温度。
3.3　PCR反应中的控制因素　通过较多的循环次数后 ,由
于长时间的高温 , Taq酶活性已很低 ,反应产物基本不会增
加 ,且有一定程度的非特异性扩增 。因此 ,应尽可能进行较
少次数的循环。现在普遍使用的温度设计仍是 Wiliams等
最早提出的:94℃变性 1 min, 36 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 2
min。减少 94℃变性时间 ,会有效增加 Taq酶的活性。退火
(下转第 8880页)
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虑增大 RNase的用量;若 A260nm /A280 nm <1.6,说明样品中存
在蛋白。根据公式计算 DNA的浓度:DNA浓度 =A260nm ×50
×稀释倍数 [ 6] 。
2　结果与分析
2.1　用改良的 SDS法提取红掌总 DNA　利用改良的 SDS
方法所提取的 DNA颜色为透明色 ,无杂质 , A260nm/A280nm的比
值在 1.6～ 2.0。由表 1和图 1可知 ,电泳后未见拖尾带 ,样
品中 RNA酶消化的比较彻底。所以利用该方法提取的 DNA
较纯 ,可满足红掌分子生物学试验的要求。
2.2　用 CTAB法对红掌总 DNA的提取　用 CTAB法提取
得总 DNA为褐色或淡黄色 , A260nm/A280nm均小于 1.6。由表 1
和图 2可知 ,所提取的 DNA中含有大量蛋白 ,在点样孔处也
可看到亮带 ,为残留的蛋白 , DNA纯度较差 ,并且浓度低。说
明此方法不适于提取红掌基因组 DNA。
表 1　SDS法和 CTAB法提取的总DNA的纯度与浓度
Table1　PurityandconcentrationoftotalDNAextractedbySDSand
CTABmethods
编号
Code
SDS法 SDSmethod
A260nm /A280nm 浓度∥μg/μlConcentration
CTAB法 CTABmethod
A260nm /A280nm 浓度∥μg/μlConcentration
1 1.70 1.86 1.50 0.24
2 1.78 1.97 1.25 0.25
3 1.65 1.85 1.21 0.68
4 1.69 3.12 1.36 0.39
图 1　SDS法提取红掌基因组 DNA电泳
Fig.1　TheelectrophoresisresultsofgenomicDNAextracted
fromA.andraeanumbySDSmethod
图 2　CTAB法提取红掌基因组 DNA电泳
Fig.2　TheelectrophoresisresultsofgenomicDNAextractedA.
andraeanumbyCTABmethod
3　讨论
改良 SDS法加大了 SDS的浓度及水浴的时间 ,增加了酚
抽提的次数 ,这些措施均可以有效地去除红掌叶片内所含有
的大量酚类物质及蛋白成分 ,但由于增加了抽提次数 ,在一
定程度上增加了时间 ,不适于处理大量样品 。
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(上接第 8878页)
温度是影响 RAPD反应灵敏度的最重要条件。降低退火温
度 ,可在很大程度上增加 RAPD反应的敏感性。升高温度可
以有效减少非特异性扩增产物 ,增加 RAPD的稳定性 ,提高
RAPD结果的可信度 [ 8] 。
3 .4 　操作过程　加样顺序不影响扩增结果。为了避免污
染 ,应最后加模板 。吸取样品时动作要轻柔 ,避免样品溅出
或污染加样器 。加样与电泳检测场所要严格分开 ,最好采用
两套加样系统 。为使加样量准确 ,应使用误差小的加样器 。
在加样过程中 ,应将反应管置于冰块上 ,以防止引物多聚体
的形成及引物与模板的非特异性结合。
4　结论
经过以上的试验 ,笔者最终确定的适合于火棘的 RAPD
反应体系为:总体积 25 μl, 包括 25 ng的 DNA, 1×反应缓冲
液 , 2.3 mmol/LMgCl2 , 1.0μmol/L引物 , 0.15mmol/LdNTP混
合物和 2.0 U的 TaqDNA聚合酶。RAPD扩增程序为:先在
94℃下变性 4min,然后在 94℃下变性 40s, 36.8 ℃下复性 50
s, 72℃下延伸 70s,反应 40个循环 ,最后 72 ℃延伸 4 min。
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