全 文 ：2012 年 2 月
第 35 卷 第 1 期
湖南师范大学自然科学学报
Journal of Natural Science of Hunan Normal University
Vol． 35 No． 1
Feb．，2012
广西壳菜果遗传多样性的 ISSR研究
彭继庆，曹福祥
*，许若娴
(中南林业科技大学生命科学与技术学院，中国 长沙 410004)
摘 要 利用 ISSR分子标记技术，对广西壳菜果 4 个自然种群共 43 个个体进行了遗传多样性研究．结果表
明，广西壳菜果天然种群总体水平的遗传多样性较高，各个种群的遗传多样性水平存在差异，其中广西凭祥种群的
遗传多样性水平最高，广西那坡种群的最低． 通过 PopGen32 分析表明:有 82． 43%的遗传变异存在于种群内，而
17. 57%的遗传变异存在于种群间，遗传分化系数(Gst)为 0． 175 8，种群间的基因流(Nm)为 2． 344 7，种群间的遗传
分化程度较低，基因流动足以抵制遗传漂变的影响．利用 UPGMA法对 4 个种群进行聚类分析显示:广西凭祥、广西
德保和广西靖西 3 个种群聚为一类，广西那坡种群单独聚为一类．
关键词 壳菜果;遗传多样性;ISSR
中图分类号 Q789 文献标识码 A 文章编号 1000-2537(2012)01-0061-05
Genetic Diversity of the Mytilaria laosensis in
Guangxi Detected by ISSR Markers
PENG Ji-qing，CAO Fu-xiang* ，XU Ruo-xian
(College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China)
Abstract The genetic diversity of 43 individuals of Mytilaria laosensis populations in Guangxi province was
studied using inter-simple sequence repeat(ISSR)markers． The results show that the general level of Mytilaria lao-
sensis natural population genetic diversity in Guangxi is high． The genetic diversity level of four populations is dif-
ferent largely． The level of genetic diversity of Pingxiang population in Guangxi is the highest among the four popu-
lations，and that of Napo population in Guangxi is the lowest． The analysis of genetic differentiation shows that the
82． 43% of genetic variation is in population，and the others is not in population by PopGen 32． Coefficient of ge-
netic differentiation (Gst)among four populations is 0． 175 8 and the gene flow (Nm)among Mytilaria laosensis is
2． 344 7． It shows that the level of genetic differentiation is low and gene flow is sufficient to resist the effects of ge-
netic drift． UPGMA cluster analysis shows that four populations can be classified two kinds，and the population of
Pingxiang，Debao and Jingxi in Guangxi are divided into one kind and the population of Napo in Guangxi is divided
into one kind alone．
Key words Mytilaria laosensis;genetic diversity;ISSR
壳菜果(Mytilaria laosensis Lecomte) ，别名米老排、三角枫、山桐油、米显灵、马蹄荷、朔潘［1］，属金缕梅科
(Hamamelidaceae)壳菜果属(Mytilaria)常绿阔叶树种．天然林分布于广东的封开、信阳、阳春，广西西南部的
* 收稿日期:2011-11-18
基金项目:国家林业公益行业科研专项子项目课题“中国森林对气候变化的影响与林业适应对策研究”(200804001) ;
校级重点学科建设项目“生化与分子生物学”
* 通讯作者，E-mail:csfucao@ 163． com
十万大山、龙川、那坡、德保、靖西和云南南部，老挝和越南也有分布，垂直分布在广东海拔 250 ～ 1 000 m，广
西和云南在海拔 1 100 ～ 1 800 m之间的山谷、丘陵的中下部和沟谷两旁［2］，是优良速生用材树种．其树干通
直，枝条较细，材质较好，色泽美观，经久耐用，适于制作家具、胶合板等，在水土保持、土壤改良、混交造林、生
物防火等方面作用明显［3-4］．壳菜果叶子肥大嫩绿，营养成分含量较高，是一种很好的饲料资源［5］;所分泌的
树脂的化学成分主要是脂类物质［6］，其种仁含油质量分数高达 36． 8%，是重要的油脂资源［7］．目前对壳菜果
的研究多集中在引种［8］、育苗造林［9］和材质利用等方面［2-3］，而壳菜果种群遗传多样性方面的文章迄今未见
报道．
ISSR(inter simple sequence repeat)即简单重复序列区间扩增多态性，由 Zietkiewiez等［10］在 PCR反应基
础上发展起来的一种新的分子生物学技术，ISSR标记技术与 RAPD相比具有检测位点多、稳定可靠、重复性
更好等优点［11］;与 AFLP相比具有操作简单、技术性低、花费低等优点，适合一般的实验室使用．因此 ISSR分
子标记技术已在生物种质鉴定、遗传多样性检测、基因定位及遗传图谱等方面得到广泛应用［12］． 利用 ISSR
分子标记技术对壳菜果种群多样性进行研究有助于从 DNA分子水平上揭示壳菜果种群的遗传结构和遗传
多样性水平，了解壳菜果的生存状况和对环境的适应能力，了解壳菜果种群间的亲缘关系，为壳菜果的合理
开发和利用提供参考依据．
1 材料与方法
1． 1 样品采集与处理
壳菜果样品分别采自广西凭祥、广西德保、广西靖西、广西那坡 4 个壳菜果天然分布区，采样过程中要防
止采到同一棵树的后代;每一样品为同一株的新鲜叶片，选取没有病虫害的比较干净的叶片，用纱布擦洗干
净后放入自封袋中，加入一定量的硅胶，摇动袋子使硅胶与叶子充分接触．将样品放入保温箱中，加入冰袋带
回实验室，置于 － 70℃超低温冰箱中保存备用．样品采集情况见表 1．
表 1 壳菜果种群分布地的基本情况
种群 产地 地理位置 海拔 /m
广西凭祥 凭祥市凭祥镇竹山村 22°07N，106°44E 247
广西德保 德保县那甲乡红旗坡林场 23°24N，105°48E 957
广西靖西 靖西县同德乡果老村 23°02N，106°35E 681
广西那坡 那坡徳孚自然保护区 23°19N，105°48E 927
1． 2 壳菜果基因组 DNA提取及检测
壳菜果基因组 DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组提取试剂盒进行提取，具
体操作按照植物基因组提取试剂盒说明书进行，仅对离心时间和裂解时间稍作修改．
所提取的基因组 DNA 用 10 g /L琼脂糖凝胶电泳检测，倒胶前加入 EB，终浓度为 0． 5 mg /L;用核酸蛋白
测定分析仪检测 DNA样品纯度和浓度，将所有样品 DNA浓度稀释为 40 mg /L，置于 －20 ℃冰箱中保存备用．
1． 3 引物的合成与筛选
ISSR引物是根据加拿大哥伦比亚大学公布的第九套 ISSR 引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司
合成．从中筛选出 9 条扩增条带较多、条带清晰、重复性好的引物用于 ISSR-PCR扩增．
1． 4 ISSR-PCR扩增与电泳检测
利用筛选出的 9 条引物对 43 个样品进行 PCR扩增，ISSR-PCR扩增体系为:在 20 μL 的反应体系中，模
板 DNA为 30 ng，Mg2 +浓度为 2． 75 mmol /L，TaqDNA聚合酶为 36. 67 nkat，dNTPs浓度为 0． 20 mmol /L，引物
浓度为 0． 6 μmol /L，10 × PCR Buffer 2． 0 μL，最后用灭菌好的 ddH2O将体系补足．扩增程序为:94 ℃预变性 5
min，94 ℃变性 30 s，50 ～ 54 ℃(依据引物而定)退火 45 s，72 ℃延伸 90 s，36 个循环，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保
存．扩增产物用 10 g /L的琼脂糖凝胶电泳检测，用 200 bp DNA Ladder Marker(200 ～ 3 000 bp)作标记，溴化
乙锭染色后在凝胶成像系统上成像，拍照．
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彭继庆等:广西壳菜果遗传多样性的 ISSR研究
1． 5 数据处理与分析
电泳图谱中扩增出的每一条带代表引物的一个结合位点，视为有效的分子标记，同一引物的扩增产物中
电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性．根据电泳图谱中扩增条带的有无及扩增片段的大小，有条带的记
作“1”，否则记作“0”，建立 0 /1 数据矩阵，通过 Popgene32 软件计算壳菜果群落的多态性位点百分比
M:200 bp DNA Ladder
图 1 引物 UBC835 对壳菜果的多态性扩增
(PPB)、观测等位基因数(Na)、有效等位基因数
(Ne)、Neis基因多样性指数(H)、Shanon多样性
指数(I)、种群总基因多样性(Ht)、种群内基因
多样性(Hs)、种群间遗传分化指数(Gst)及 Neis
遗传距离(D)．
2 结果与讨论
2． 1 广西壳菜果种群的扩增产物多态性
9 条引物对 4 个种群的 43 份广西壳菜果样
品进行扩增，结果显示，9 条引物均能扩增出很
好的图谱，(图 1 为引物 UBC836 对 43 份广西壳
菜果样品进行扩增的图谱)共扩增出 129 条带，
平均每条引物扩增出 14． 3 条带，其中 105 条带
是多态性条带，多态性条带占 81． 40%，说明 43
个广西壳菜果样品的 ISSR标记存在较高的遗传
多样性．引物 UBC841 扩增出 13 条带，有 12 条
带是多态性条带，多态性最高为 92． 30%，引物
UBC840 扩增的多态性条带最少，多态性也最低，为 61． 54%(表 2)．
表 2 ISSR引物扩增位点
引物编号 退火温度 /℃ 条带总数 多态性条带数 多态性比率 /%
UBC827 50 11 9 81． 82
UBC834 50 17 14 82． 35
UBC835 50 15 12 80． 00
UBC836 51 17 13 76． 47
UBC840 50 13 8 61． 54
UBC841 52 13 12 92． 30
UBC842 54 15 13 86． 67
UBC848 53 14 12 85． 71
UBC855 53 14 12 85． 71
总计 － 129 105 81． 40
2． 2 广西壳菜果自然种群的遗传多样性分析
4 个广西壳菜果自然种群 43 个样品的遗传多样性分析表明(见表 3) ，壳菜果在物种水平上的多态位点
百分率(PPB)为 81． 40%，表明其拥有较高的遗传多样性．在种群水平上，广西凭祥种群的最高，为 69． 77%;
其次为广西德保和广西靖西的种群，同时为 62． 79%;广西那坡种群的最低，为 54． 26% ．利用 Popgene32 软
件分析表明 4 个种群总体水平上的观测等位基因数(Na)为 1． 845 0;有效等位基因数(Ne)为 1． 511 9;Neis
基因多样性指数(H)为 0． 296 9;Shannon多样性指数(I)为 0． 440 4． 对 4 个种群而言，Na 的变化幅度为
1． 542 6 ～ 1. 697 7;Ne的变化幅度为 1． 355 9 ～ 1． 471 8;H的变化幅度为 0． 203 1 ～ 0． 268 6;I 的变化幅度为
0. 300 4 ～ 0． 394 5，其变化趋势与种群位点多态性一致．说明广西壳菜果自然种群具有丰富的遗传多样性，在
这 4 个种群中，广西凭祥种群适应环境的能力最强，其次为广西德保种群和广西靖西种群，广西那坡种群最
弱．因此，广西凭祥的遗传基础最好，在将来的引种试验中建议从广西凭祥引种是比较合理的．
36第 1 期
表 3 壳菜果种群内的遗传多样性
种群 样本数 N PPB Na Ne H I
广西凭祥 16 69． 77% 1． 697 7 1． 471 8 0． 268 6 0． 394 5
广西德保 10 62． 79% 1． 627 9 1． 442 5 0． 251 2 0． 367 1
广西靖西 11 62． 79% 1． 627 9 1． 439 9 0． 249 0 0． 364 3
广西那坡 6 54． 26% 1． 542 6 1． 355 9 0． 203 1 0． 300 4
总计 43 81． 40% 1． 845 0 1． 511 9 0． 296 9 0． 440 4
2． 3 广西壳菜果自然群落的遗传分化研究
壳菜果种群总基因多样性(Ht)为 0． 294 8，种群内的基因多样度(Hs)为 0． 243 0，种群间基因多样性等
于总基因多样性减去种群内的遗传多样性，即种群间的基因多样性为 0． 051 8;在物种水平上有 82． 43%的
遗传变异存在于种群内，而 17． 57% 的遗传变异存在于种群间． 各个种群之间的基因分化系数 Gst 为
0. 175 8，说明壳菜果自然种群间存在一定程度的遗传分化，但分化程度比较低． 壳菜果种群间的基因流
(Nm)为 2． 344 7，大于 1，证明种群间存在一定的基因流动，足以抵制遗传漂变的作用．
2． 4 遗传一致度与聚类分析
如表 4 所示，广西壳菜果 4 个自然种群之间的 Neis遗传距离范围在 0． 055 8 ～ 0． 138 5 之间．广西德保
和广西靖西 2 个种群之间的遗传距离最小，说明它们之间的遗传差异最小;而广西那坡种群与广西凭祥之间
的遗传距离最大，为 0． 138 5，表明广西凭祥与广西那坡之间存在的遗传差异也最大;4 个种群的遗传一致度
变化范围在 0． 870 7 ～ 0． 945 7 之间，变化趋势与 4 个种群之间的遗传距离变化趋势一致．
表 4 4 个壳菜果种群间的遗传一致度和遗传距离
种群 广西凭祥 广西德保 广西靖西 广西那坡
广西凭祥 ＊＊＊＊ 0． 942 7 0． 909 2 0． 870 7
广西德保 0． 059 0 ＊＊＊＊ 0． 945 7 0． 880 7
广西靖西 0． 095 2 0． 055 8 ＊＊＊＊ 0． 907 2
广西那坡 0． 138 5 0． 127 0 0． 097 3 ＊＊＊＊
图 2 4 个壳菜果种群间遗传距离的聚类分析
根据 Neis(1978)的遗传距离对广西壳菜果种
群进行 UPGMA聚类分析(见图 2) ，聚类结果表明:4
个广西壳菜果自然种群聚为两大类，一类是广西德
保和广西靖西的 2 个种群聚在一起，再与广西凭祥
的聚在一起;广西那坡种群单独聚为一类．表明广西
德保与广西靖西 2 个自然种群之间的亲缘关系最
近，与广西那坡之间的亲缘关系最远．
3 讨论
遗传多样性是生物多样性的基本特性，是物种长期进化的结果，遗传多样性的高低对种群的生存和分布
有很大影响［13］．通过 ISSR分子标记技术对壳菜果遗传多样性进行分析，多态位点百分率为 81． 40%，比广布
型植物略低，如木荷的多态位点百分率为 90． 02%［14］，油松的多态位点百分率为 91． 67%［15］，枫香的多态位
点百分率为 87． 41%［16］，比频危植物要高，如资源冷杉的多态位点百分率为 77． 78%［17］．表明尽管壳菜果的
多态位点百分率比广布型植物要低，但壳菜果仍处于较高水平，仍有很强的适应能力．广西壳菜果的多态位
点百分率介于广布型植物和频危植物之间，可能与两方面原因有关:一是与广西壳菜果自然群落的分布状况
有关，目前广西壳菜果除了在广西凭祥有大面积的天然林外，在广西其他地方很少有成片的天然林，且多集
中在一些林场或者在一些自然保护区，地理距离比较远，因此壳菜果的多态位点百分率比广布型的要低;另
一方面是壳菜果结实量大，种子的含油量高达 36． 8%［7］，种子的萌发能力比较强，发芽率在 90%左右，易于
植株的存活，这与 Hamrick［18］提出的具有高水平遗传变异的物种寿命长、结实性高的观点一致．
广西壳菜果自然群落的遗传分化程度比较低，种群内的遗传变异占主导地位，种群间遗传变异小，这是
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彭继庆等:广西壳菜果遗传多样性的 ISSR研究
由基因流和微环境共同作用的．基因流被视为是使种群遗传结构均质化的主要因素之一，具有广泛基因流
的物种遗传分化程度也比较小［19］．壳菜果种群间的基因流(Nm)为 2． 344 7，说明基因流发挥了均质化作用．
种群间微生境的差异也是产生种群间遗传分化的原因之一，不同的微生境条件下存在不同的适应型，种群的
基因型之间必存在相应的差异，从而产生种群间的遗传分化［20］．本研究中的壳菜果样品均来自广西，温度、
水分、光照、土壤等生态因子变化较小，微生境差异不大，不同种群所承受的生境选择压力差异比较小．但是
目前很多广西壳菜果天然种群都被分割开来，种群之间相距比较远，产生了生境片段化，而生境片段化可以
阻断原种群之间的基因交流［21］，降低遗传多样性，加大遗传分化程度，估计随着时间的推移，各种群之间的
遗传分化将逐渐增大．
本文从分子水平对壳菜果遗传多样性的研究，有助于了解其遗传基础，为种群保护、引种栽培和生产实
践提供参考依据;UPGMA聚类分析结果有助于探清壳菜果种群间的演化规律．但目前仅仅对广西壳菜果天
然种群进行了研究，其他省份的壳菜果的生长状况和亲缘关系还不清楚．下一步将在全国范围内对壳菜果进
行研究，除探清壳菜果天然种群间的亲缘关系外，还要探清天然林与引种地之间的差异，从分子水平上了解
壳菜果是怎样对迁移地进行适应的，对引种是否成功从分子水平上作出评价．
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(编辑 王 健)
56第 1 期