全 文 ：安徽科技学院学报 , 2007, 21(4):14 ～ 17
JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity
收稿日期:2007-03-20
基金项目:安徽科技学院引进人才基金项目(ZRC200685)。
作者简介:彭丽萍(1978-),女 ,河南省洛阳市人 ,硕士 ,助教 ,主要从事植物组织培养教学与研究。
菘蓝离体叶片高频再生体系的建立
彭丽萍 ,张远兵 ,汪露润
(安徽科技学院　生命科学学院 ,安徽　凤阳　233100)
摘　要:以菘蓝离体叶片为外植体 ,研究了激素种类和浓度 、接种方式 、光照条件等因素对叶片再生的影
响 ,建立了菘蓝离体叶片高频再生体系 。结果表明:以 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖为
培养基 ,接种后暗培养 5天转到光下培养 ,叶片远轴面向下接触培养基对不定芽的再生最为有效 ,不定芽
不经过愈伤组织阶段直接从叶片上分化产生 ,再生率高达 93.10 %。以 1/2MS为培养基附加 0.1 mg/L
NAA可使不定芽生根率达到 100%。
关键词:菘蓝;叶片;不定芽;不定根
中图分类号:Q949.9　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1673-8772(2007)04-0014-04
PlantHighEficientRegenerationSystemfromLeaf
inIsatisIndigoticaFort
PENGLi-ping, ZHANGYuan-bing, WANGLu-run
(ColegeofLifeSciences, AnhuiScienceandTechnologyUniversity, Fengyang233100, China)
Abstract:Inthispaper, IsatisindigoticaFortleafregenerationsystemwasthoroughlydiscussed.Theleavesof
1satisindigoticaFortwereusedastheexperimentalmaterials.Severalfactorssuchashormonetypesandconcen-
tration, thelayingmodesofleaves, iluminationconditionandsoonwereinvestigatedtooptimizetheregeneration
systeminvitro.TheexperimentalresultsshowedThehighfrequencyofshootregenerationwasobservedwhenleaf
explantswereculturedonMSmediumsupplementedwith2.0 mg/L6-BAand0.2 mg/LNAAand3 % su-
crose.Firstly, theleaveswereculturedindark.After5days, theexplantsweretransferredunderlightandbe-
gantodirectlyregenerateadventitiousbuds.Theyoungleaves, whichwereplacedonthemediumwiththelower
surfacetouchingthemediumshowedhigherregenerationrate.Theshootdiferentiationfrequencywasmorethan
93.02 %.Whentheshootswereculturedon1 /2MSsupplementedwith0.1 mg/LNAA, therootingratecould
reach100 %.
Keywords:IsatisindigoticaFort;Leaf;Adeventitiousbuds;Adeventitiousroot
菘蓝(IsatisindigoticaFort),又称草大青 ,属十字花科菘蓝属二年生植物 ,主产河北安国 、安徽亳州等
地 ,是一种有重要开发前景的药用植物 ,为常见中药材大青叶及板蓝根的主要来源 ,具有较好的抗病毒效
果 ,对流感 、流脑 、肝炎 、肺炎等疾病有良好的治疗和预防作用 ,是我国传统常用中药材之一 ,深受广大消费
者的爱戴 [ 1 ～ 2] 。现代生物技术的发展 ,为作物抗逆品种的选育提供了新的手段 ,人们可以将外源基因导入
到植物体内 ,以改善植物的某些形状。植物的转基因技术需要建立高效的植株再生系统 ,菘蓝高效再生系
统的研究虽有少数报道 ,但多数采用子叶和下轴为外植体 [ 3 ～ 4] ,笔者以菘蓝叶片为外植体进行高频再生体
系建立的研究 ,为菘蓝快速繁殖和转基因技术奠定了良好的基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
菘蓝幼嫩叶片 ,取自安徽科技学院中药园。
1.2　方法
1.2.1　不定芽的诱导　以菘蓝幼嫩叶片为外植体 ,在流水中冲洗 1h,然后用 70%的酒精表面消毒 40s,
再在 0.1%的 HgCl2中浸泡 7 min进行消毒 ,无菌水冲洗 5次 ,在超净工作台上将叶片切割成适当大小
(0.5 cm×0.3 cm),分别以叶片远轴面向上和向下两种方式平放于培养基上进行不定芽的诱导 。
1.2.2　最适培养条件的筛选　分别将叶片外植体置于附加不同种类和不同浓度配比激素的培养基上进
行培养 ,培养基中均加入 3 %的蔗糖 , 0.55%的琼脂 , pH值 5.8 ,观察各种因素对菘蓝叶片分化 ,再生和生
根的影响 。
1.2.3　培养条件　不定芽诱导前期 ,先进行一定时间的暗培养(暗处理分别设为 0 d、3 d、5 d、7 d),然后
进行光照培养 ,光照 1500-2000 Lx(每天光照 14 h),培养室温度为 25±2℃。
1.2.4　数据统计　叶片接种培养 30d后 ,统计叶片分化率(叶片不定芽分化率 =出芽叶片数 /接种总叶
片数 ×100%)和叶片平均诱导不定芽数(叶片平均诱导不定芽数 =平均诱导不定芽数 /再生芽叶片总数
×100 %)。不定根诱导 20d后 ,统计不定根诱导率(不定根诱导率 =产生不定根的不定芽数 /接种不定芽
总数 ×100%)。
2　结果与分析
2.1　不定芽的获得
叶片外植体置于分化培养基上进行培养 , 7d后叶片边缘向叶远轴面卷曲 ,叶片有膨大现象 , 20d左右露
出不定芽点 ,不定芽出现的高峰期在接种后的 28 ～ 32d。多数不定芽的形成不经历愈伤组织阶段 ,直接从培
养的叶片外植体上分化产生(见图 1a、b),不定芽再生位点主要在叶片的切口部位 ,刚形成的不定芽较小 ,培
养一段时间后可切割转接进行壮苗培养 ,然后进行生根诱导 ,本试验中不定芽分化率可达 93%以上。
图 1　菘蓝植株再生过程
a.不定芽的形成;b.不定芽的形成;c.不定根的形成;d.再生植株
Fig.1　variousstagesofplantedregenerationin1satisindigoticaFort
a.Adventitiousbudsformedfromleaf;b.Adventitiousbudsformedfromleaf
c.RootformedfromAdventitiousbud;d.Thesmalplantfromregenerationoftissueculture
15　第 21卷第 4期　　　　　　　　　　　彭丽萍 , 等　菘蓝离体叶片高频再生体系的建立　
2.2　植物生长调节剂种类和配比对不定芽再生的影响
以 MS为培养基附加不同种类和浓度的激素 ,配制成多种培养基 ,以生长良好幼嫩的叶片为外植体 ,
筛选分化效果好的培养基。由表 1可以看出 ,不同种类和浓度的植物生长调节剂对不定芽的诱导存在有
一定的影响 , 6-BA和 NAA配合使用很少形成愈伤组织 ,出现不定芽的时间短 ,多数从伤口处直接长出 ,
当培养基为 MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L时对不定芽的诱导效果最好 ,诱导率高达 93.10 %。 6
-BA和 2 , 4-D配合使用时易形成愈伤组织 ,不定芽多数从愈伤组织上长出 ,不定芽诱导率低 ,易玻璃
化 ,长势不好。 KT和 NAA配合使用虽可诱导出不定芽 ,但不定芽诱导率低 ,且生长缓慢。
表 1　不同激素浓度对菘蓝叶片外植体芽分化的影响
Table1　EffectsofhormoneconcentrationonshootdifferentiationfromleavesofIsatisindigoticaFort
激素浓度 Concentrationofregulators(mg/L)
6-BA NAA 2, 4-D KT
外植体数
Numberofexplants
分化情况
Situationofdifferentiation
分化率(%)
Differentiationrate
1.0 0.1 0 0 43 长势缓慢 65.00
2.0 0.2 0 0 45 增长分化速度快再生芽数多 86.67
3.0 0.5 0 0 42 增长分化较快 73.17
1.0 0 0.1 0 42 易愈伤组织化 57.50
2.0 0 0.2 0 44 易愈伤组织化 79.48
0 0.1 0 1.0 40 分化较快 44.74
0 0.2 0 2.0 42 分化较快 62.50
2.3　接种方式对不定芽诱导的影响
分别采取叶片远轴面向上和向下两种方式进行接种 ,研究不同的接种方式对不定芽诱导的影响。结
果表明 ,叶片不同的放置方式对不定芽的诱导和生长存在有一定的影响 ,叶片远轴面接触培养基 ,不定芽
出现的时间短 ,再生率高 ,这可能与叶面远轴面接触培养基 ,叶背面有大量气孔 ,利于营养吸收有关 。
2.4　光照对芽分化的影响
光照对愈伤组织的诱导及器官的发生有较大的影响 , 在多种植物中暗培养可以促进不定芽的形
成[ 5] ,本试验叶片接种后分别给予 0 d、3 d、5d、7 d的暗培养处理 ,以后转移至光下培养 ,结果见表 2。结
果表明 ,光照条件对菘蓝叶片分化的影响很大 ,前期暗处理能显著提高叶片的分化率 ,每个叶片上的再生
芽数也较多 ,暗处理的时间以 5 d为最好 。
表 2　光照对菘蓝芽分化的影响
Table2　Effectsofiluminationconditiononbudsdifferentiationof1satisindigoticaFort
光照条件Ilumination
condition
外植体数
Numberofexplants
分化外植体数VNumberofdiferentiated
explants
分化率(%)
Diferentiationrate%
出芽数
Adventitiousbudsperleaf
暗处理 0 d 32 25 78.13 14
暗处理 3 d 35 30 85.71 19
暗处理 5 d 29 27 93.10 24
暗处理 7 d 32 27 84.38 17
2.5　菘蓝不定根的诱导
当试管苗长到一定高度时 ,将其转入生根培养基进行不定根的诱导 ,不定根的诱导选用 1 /2MS为培
养基附加不同种类和浓度的生长素 , 30d后统计结果 。结果见表 3,结果表明:培养基中生长素的添加与否
以及种类对不定根的诱导存在有一定的影响 ,不加生长素的培养基中部分长势好的苗子可诱导生根 ,但培
养基中加入生长素可明显提高生根率 ,所加生长素以 NAA效果最好 ,但 NAA浓度不可过高 ,浓度过高苗
子基部易形成愈伤组织 ,不定根从愈伤组织上长出 ,当 NAA浓度为 0.1 mg/L时 ,试管苗基部很少形成愈
伤组织 ,生根率可达 100%(见图 1c)。
16 安徽科技学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年　
表 3　不同生长素对诱导菘蓝不定芽生根的影响
Table3　Influenceofdiferentauxinsonrootregenerationofadventitiousbuds
激素浓度(mg/L)
Concentrationofregulators(mg/L)
接种不定芽数
Numberofadventitiousbudsinoculated
生根不定芽数
Numberofrootingadventitiousbuds
诱导率(%)Inductionrate(%)
0 40 21 52.50
NAA0.1 mg/L 42 42 100.00
NAA0.2 mg/L 41 18 43.90
IBA0.1 mg/L 42 19 45.24
IBA0.2 mg/L 40 35 87.50
3　讨论
影响菘蓝离体叶片再生的因素很多 ,如植物生长调节剂 、叶片生理状态 、接种方式和光照条件等 ,但只
有理想的培养条件才能得到好的分化效果。本试验表明菘蓝离体叶片再生有其自身的特点 ,当细胞分裂
素和生长素 NAA配合使用时 ,不经愈伤组织可直接从叶片上再生不定芽 ,且不定芽长势良好 ,当细胞分裂
素和生长素 2, 4-D配合使用时 ,离体叶片极易形成愈伤组织 ,然后从愈伤组织上再分化出不定芽 ,分化
出的不定芽多数畸形 ,长势不好且易玻璃化 。菘蓝叶片再生以 BA和 NAA配合使用效果好 ,但不同浓度
处理对出芽数影响很大 ,当 6-BA2.0 mg/L和 NAA0.2 mg/L时出芽最高 ,诱导不定芽生根需在培养基中
加入低浓度的生长素 NAA,可使生根率达 100 %,本试验以菘蓝离体叶片为外植体获得了再生植株(见图
1d)。
菘蓝叶片离体再生发生的过程和频率除了与激素种类和浓度有关外 ,还与光照和接种方式密切相关 ,
叶片远轴面接触培养基时 ,有利于不定芽的再生 ,这可能是叶背面有大量气孔 ,利于营养物质的吸收而造
成的 ,这与师校欣对樱桃叶片培养的结论相符 [ 6] 。光对愈伤组织及器官发生有较大的影响 ,很多研究表
明 ,弱光比强光更易于诱导细胞分裂[ 7 ～ 8] ,菘蓝叶片前期暗培养(5d)可促进不定芽的形成 ,这可能是暗培
养处理有利于细胞的代谢 ,使代谢物质朝着有利于不定芽发生的方向发展 。
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(责任编辑:李孟良)
17　第 21卷第 4期　　　　　　　　　　　彭丽萍 , 等　菘蓝离体叶片高频再生体系的建立