全 文 ：上海农业学报 1 98 7, 3 ( 1 ) : 7 3一 7只
上理e t a A g r f e u l t“ r a e S h a ,` g l a 玄
凹叶景天叶片离体培养的形态发生
倪德祥 易莹 张王 方 王 凯基
(复旦大学生物系 , 上海 )
摘 要 凹叶景天 ( S e d o m e 、 a r g f n a t“ 川 )叶外植体于 M S + 0 . 2m g / 1 N A A + Zm g / 1 B A 固
体培养基上诱导培养 , 形成愈伤组织 , 并进 一步产生大量的芽 。 经石蜡切片观察 , 愈伤组织形成
时 , 细饱核的分裂类型多样 , 都属无丝分裂 , 未观察到核的有丝分裂 。 据细胞组织学断定 , 芽的
发 生全径为不 定芽的途径 。 将已产生达生芽的愈伤组织切块转接到 M S 基本培养基 上后 , 芽沐伸
长 、 健壮 。 切取伸长的苗 , 再转接到 1 / 2 M S (或M }S 培养基上 , 经 2一 3 周 的培养 , 则在苗茎的
切 口处产生白嫩的不定恨 , 形成完整植株 。
关越词 叶外植体 , 形态发生 ; 无丝分裂 , 不定芽 ; 凹叶景天
凹叶景天 ( S e d o m 。 : 。 gr i o at u m )为常用药材 , 全草入药 , 有清热解毒的功效 , 能治肝炎
等症 。
药用植物的组织培养在世界上受到了人们的日益重视 ! 2 ] , 我国目前已有不少单位正开展
这方面的研究工作 。 我国享有 “ 中药宝库 ” 之称 , 药用植物种类多 、 分布广 , 但由于采收不
当 , 或遭到种种的 人为破坏 , 有些种类濒临灭迹 . 因此 , 开展药用植物的组培研究 , 是保留
药用植物基因而不被绝种和扩大药源的有效手段 . 近年来 , 利用叶外植体进行组培工作研究
其形态发生的 , 已有一些报道 [ ’ , 4 , 7 , “ 〕, 但唯药用植物叶培养形态发生的报道极少 。 本文以凹
叶景天叶片为材料 , 对培养过程中愈伤组织和芽的形成 , 进行了细胞组织学的观察 , 同时诱
导培养形成大量的完整植株 . 初步结果 , 为实现凹叶景天的育苗工厂化生产提供了细胞组织
学的基本资料 .
材 料 与 方 法
切取凹叶景天 ( 5 . e o ar 少。 at 。 。 ) 无菌苗叶片为外植体 , 接种于 M S 十 0 . 2 m g / 1 N A A +
Z m叮 1 B A 的固体培养基上 , 每瓶接种 3 片 。 培养条件 : 室温为 25 士 2℃ , 每天 用 冷白荧光
灯辅助照光 1 0 小时 , 光强为 1 2 0 0 L x 。
培养两周后陆续取样 , 材料用 F A A 固定液固定 , 按常规石蜡切片法制片 , 切片厚 8 微
米 , 用代氏苏木精液染色 。 镜检后用显微摄影法拍摄图象 .
结 果 与 讨 论
(一 ) 愈伤组织形成过程中的细胞组织学观察
叶片在培养基上诱导培养 10 天后 , 叶片卷曲 、 增厚 , 产生肿胀状的愈伤组织 . 两周后 ,
本文于 19 8 6年 g 月 1 日 t次至!l。
* 实验材料由上海市药材公司中药研究所苗和恺提供 , 特此致谢 I
伴一上 海 农 业 学 报在叶片的切 口 处产生了肉眼可见的愈伤组织 .叶色由深绿逐渐变为淡黄绿 色。 这些愈伤组织
块经石蜡切片镜检 , 发现其主要是由外植体表皮层细胞经启动脱分化而分裂形成的 。 细胞经
多次分裂形成了大量的愈伤组织 ( 图 9 ) .
在胚性细胞分裂时 ,核的分裂类型多样 。 一种类型是 : 分裂细脑内的核相对增大 (图1 _ 个) ,
并移至细胞中央 ; 原生质变浓 , 且不断向细胞核聚集 ( 图 2 个) ; 接着核中出现两个核仁 , 同
时核以劈裂的方式一分为二 (图 3 个) ; 在核的开裂处产生新的细胞壁 , 形成两 个子 细胞 (图
4 个) . 另一种分裂类型与我们在研究洋兰原球茎时所观察到的相类似 〔“〕 ,首先在单核仁的细
胞核中出现两个核仁 , 继而核纵向拉长 , 两核仁分别向两极移动 , 随后核仁消失 , 随核的拉
长 , 中间出现凹陷 , 整个核两端大而中间小 , 呈哑铃形 (图 5 个) , 核继续拉长 , 核中间凹陷
加深 , 直至中间产生新的细胞壁 , 把原来的细胞核分隔为二 , 核内又重新 出现核仁 , 形成了
两个子细胞 ( 图 6 个) 。 第三种细胞分裂的类型 : 细胞内核先分裂为多个 , 然后产生新 的细胞
壁 , 分别把每个核分隔开 , 形成许多细胞 。 这种类型分裂形成的子细胞 , 由于是在原来母细
胞中一下子形成的 , 其体积明显变小 (图 7 个) . 从上述几种细胞分裂图像分析 , 细胞核的分
裂方式都属于无丝分裂 。 我们在镜检所用的全部切片时 , 胚性细胞内未出现有染色体的有丝
分裂图像 。
我们的观察结果 , 与以烟草 、 胡萝 卜等为材料的培养中所观察到的细胞分裂方式有些是
类似的 t“ , ’ ` 1 ’ 弓} 。文献报道了无丝分裂方式既可以先形成许多核后分隔成胚性的细胞团 , 也可不
断进行一分为二 地 形 成 新细胞 , 或以类似于酵母 “ 出芽 ” 生殖方式形成新细脸 。 桂耀林等
( 1 9 8 6) 在观察竹节海棠叶外植体细胞启动脱分化过程中细胞分裂时 , 发现核有一个向两极延
伸而成 “ 眼 ” 形的特殊阶段 , 这在我们的试验材料中未观察到 。
从上述提到的文献报道和我们的结果表明 , 在细胞分裂时 , 虽然细胞核的分裂类型可随
植物种类和培养条件有一定的变化 , 但这些核分裂的类型都属于无丝分裂 。 这种无丝分裂的
结果 , 可以设想 , 分裂后的子细胞内遗传物质的均一性是很难确保的 , 因而诱导产生的再生
植株 , 其遗传性是难 以稳定的 .
随着愈伤组织的不断形成 , 其内一部分细胞再次启动脱分化 , 可继续分裂增殖 : 而另一部
分细胞老化 , 细胞呈非等径的长形结构 , 胞壁加厚 , 胞腔变小 , 成群出现在较成熟的愈伤组
织内 , 形成维管组织结节 ( 图 9 个) . 这是愈伤组织里出现的组织分化 , 它为器官的发生奠定
了基础 。
( 二 ) 芽形成的细胞组织学观察
当叶片外植体经三周诱导培养后 , 肿胀状的愈伤组织表面 , 出现无数肉眼可见的绿色小
突起 , 即为芽 点。
镜检石蜡切片发现 , 外植体经两周培养后 , 在愈伤组织表层 ( 或近表层 )陆续形成芽 。 开
始时 ,愈伤组织的表层细胞 (或近表层 )产生垂周 、 平周等较有规律的分裂 , 其内还有分生细胞
团 ( 图 8 个) , 进一步形成苗端 (生长锥 ) , 产生芽的原基 ( 图 1 0) , 并不断地在 生 长锥 上形成
叶原基 , 同时生长锥也明显地伸长 (图 1 1) . 随芽的长大 , 幼叶 内 的 维管束也开始分化 , 并
向基部延伸直至愈伤组织的深层 ( 图 12 个) 。 但这种维管束向基部延伸时 , 并不 交于一点 呈
“
Y
” 形 , 整个芽体与愈伤组织紧密相连 , 也没有明显的两极性 , 未出现根端 . 据这些细胞
组织学的形态结构特点 , 我们断定它是个不定芽 , 而决不是胚状体 .

刊 上 海 农 业 学 报 3卷
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d e u s (份) . x SQQ ,
N u e l e u s d i v i d e d i n t o t w o p a r t s t h r o u g五 e lo n g a t i o n (个) . x 5 00 ;
A f e w o f d a u g h t e r e e l l s d e r i v e d f r o m a n e m b r y o n i e c e l l (个) . x 50 0 ;
M e r i s t e m a t i e
e e l l m a s s e m e r g i n g a t t h e o u t e r r e g i o n o f e a l l u s (个) . x 125 ;
A l a r g e q u a n t i t y o f e a l l u s e s
, s h o w i n g v a s e u l
a r t i s s u e n o d u l e e 皿 e r g i n g a t t h e i n s i d e o f
e a l l u s (个) . x 12 5 ,
L o n g i t u d i n a l s e e t i o n o f b u d P r i m o r d i u m d e v e l o P e d f r o m t h e m e r i s t e m a t i e e e l l m a s s e m e -
r g i n g
a t t h e o u t e r r e g i o n o f e a l l u s
.
x 2 0 0 ,
L o n g i t u d i a l s e e t i o n o f b u d w i t h t h r e e l e a f p r i m o r d i a
.
x 2 0 0 ;
D i f f e r e n t i a t i o n o f f i b r o 一 v a s e u l a r b u n d l e (个) i n t h e b u d . x 2 0 0 ;
B u d s f o r m a t i o n i n d u e e d f r o m t h e b l a d e o f s
.
e沉 a r夕苦n a d ` u 阴 ;
E l o n g a t i o n o f s h o o t s o n h o r m o n e 一 f r e e M S m e d i u m ;
R e g e n e r a t e d P l a n t l e t s o n M S m
e d i u m
.
n卜U斤了nC刁
在一些植物茎 、 叶组织培养中 , 发现芽原基既可能由表皮细胞或皮下组织形成 〔` , ’ “ , ` “ ] ,
也可以由表皮与皮下薄壁组织一起分裂形成 [ ’ “ l , 我们的结果与前者类似 , 芽原 基 是由表皮
细胞分裂形成的 。 在一些植物的茎或根的切段培养中 , 芽原基也有起源于切 口处的形成层细
胞 、 韧皮部或维管薄壁组织的【’ “ ]。 上述文献提到的和我们观察到 的芽发生 , 同为外起源类
型 . 在组织培养中 , 芽的发生除有外起源 , 也有起源于较深层的分生细胞 , 即为 内起源 .
(三 ) 植株的再生
叶片经三周诱导培养后 , 即可在愈伤组织表面见到绿色芽点 , 约经四周培养后 , 形成大
量的丛生芽 (图 1 3 ) 。 若这些芽不经转接 , 或继代培养在原来相同配方的培养基上时 ,发现芽体
不 易伸长 , 芽丛呈球状 。 为了使这些芽伸长 、 长壮 , 将 它们 转 接到 M (S 或 1 / 2 M )S 基本培
养基上培养 2 一 3 周 , 则芽体伸长 , 形成壮苗 ( 图 14) 。 切取长约 2 厘 米 、 带 3 一 6 张叶片
的苗 , 转接到 1 / Z M S ( 或M S ) 培养基上培养两周 , 即可在茎段切 口处 见到 少量白色的愈伤
组织及不定根 , 形成完整小植株 (图 1 5 ) . 这种植株移植盆中栽种 , 只 要管理 得当 , 成活率
达 9 5 % 以上 。
丙和恺等 ( 1 9 8 6) 在凹叶景天的再生植株研究中指出〔“ 〕 , 当叶片培养在 M S + 6 m g l/ N A A
+ 0
. 弱 m g / 1 B A 的培养基上时 ,依然有芽的发生 。 这说明凹叶景天的组织培养 , 对于培养基中
附加激素的浓度要求并不严格 。 在我们的实验中 , 在不加激素的 M S 基本培养基上诱导 , 同
样可以得到壮苗和根的发生 , 也说明了这点 。
叶片培养产生的试管苗繁殖系数大 , 每个外植体每年可以生产百万以上的苗 , 且这种苗
可应用于生产 . 因此 , 本文提供的产生完整植株的方法 , 为凹叶景天苗的工厂化生产 、 扩大
药源提供了可能的生产新途径 。
结 语
药用植物的组织培养研究受到生产实践单位的重视 , 特别是药用植物的有效化学成分的
工厂化生产 , 研究前景诱人 。 在本试验 中 ,通过细胞组织学的方法所观察到的器官发生的过程
表明 , 再生植株遗传性有可能改变 , 是值得引起重视的。 因此 , 我们认为 , 对于药用植物组
培后的产物 , 进行必要的化学和细胞组织学的质量鉴定是必不可少的重要工作 . 但是 , 我们
的工作只是初步的 , 有待深入研究 .
1期 倪德祥等 :凹叶景夭叶片离体培养的形态发生 7甲
参 考 文 献
[1〕 许智宏 、 刘桂云 , 植物学报 , 2 2 (1 ) 1 980 : 1一 4
〔 2 〕 何文竹译 (日文 ) , 世界科学 , 9 , 1 98 6 : 16一 18
【 3 〕 丙和恺等 , 植物生理学通讯 , 2 , 1 93 6 : 3 2
〔 4 〕 陈维沦等 , 科学通报 , 16 , 197 9 : 75 8一 7 60
[ 5 〕 陆文梁 , 中国科学 B 辑 , 4 , 19 83 : 3 21一 32 6
〔 6 」倪德祥等 , 中国植物学会五十周年年会报告及论文摘要汇编 , 科学出版社出版 , 1 9 83 : 5妞
〔 7 〕 张不方等 , 植物学报 , 2 4 ( 4 ) 1 98 2 : 2 8 2一 28 4
[ 8 〕 桂耀林等 , 植物学报 , 2 6 ( 2 ) 1 98 4 : 1 2 0一 12 5
〔 9 〕 桂耀林等 , 武汉植物学研究 , 4 ( 1 ) 1 9 86 : 13一 16
[ 1 0〕 C h l y a l , H . , C a n . J . B o t . , 5 2 , 1 97 4 : 47 3一 47 6
[ 1 1〕 I d z i k o w s k a , K . a n d F . M l o d z i a n o w s k i , A e t a S o e i e t a t i s B o t . P o l o n t a e , 98 ( 3) 197 9 : 27 7
一 3 80〔1 2」 K a t o , T . a n d 5 . K a w a r a , P l a n t a , 1 07 1 97 2 : 11 1一 1 20
[ 13〕 R a o , A . N . , I n V i t r o C u l t u r e o f L e a f F r a g m e n t s o f S a i n t p a u l i a I o n a n t h a , M a s s o n ,
] 9 77 : ] 10一 12 3
〔 ] 4〕 V a s i l , W . a n d A . C . H i l d e b r a n d t , S e i e n e e , 15 0 , 198 5 : 88 9一 8 92
[ 15〕 Z e s , 5 . Y . e t a l . , 2 . P f l a n z e n Ph y s i o l . , 90 , 197 8 : 1 5 5一 16 3
7 宫 上 海 农 业 学 报3 卷
M O RP H OG EN! 5 E S OB FA LD E CU LU T RE OF
Se du m e ma增 i” a tu m N IV IT RO
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( B io lo夕夕 D e Pa r t优 e nt, F u d a n U n i口 e r s i t v , S h a n夕h a i )
Ab s t r a e t L e a f e x p l a n t s o f S e d u m e优 a r 夕i n a t u m w e r e e u l t u r e d o n M S m e d i u m
s u p p l e m e n t e d w i t h N A A 0
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t h e n m a n y b u d s w e r e d i f f e r e n t i a t e d f r o m e a l l u s e s
.
H i s t o e y t o l o g i e a l
o b s e r v a t i o n s o n b u d s f o r m a t i o n s h o w 尽d t h a t t h e b u d s d i f f e r e n t i a t e d w e r e a d v e n t i -
t i o u s b u d s
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T h e e l o n g a t e d s t e m o f
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a n d e o m p l e t p l a n t l e t s f o r m e d
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T h e e a r y o l o g i e a l o b s e r v a t i o n o n e a l l u s p a r a f f i n s e e -
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d i v i s i o n m o d e s i n e e l l d i v i s i o n p r o e e s s
,
b u t a l l t h e s e w e r e o f a m i t o s i s
.
K e y w o r d s L e a f e x p l a n t
,
M o r p h o g e n e s i s
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A d v e n t i t i o u s b u d
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