全 文 ：第 29卷　第 6期 西 南 师 范 大 学 学 报(自然科学版) 2004年 12月
Vol.29　N o.6 Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition) Dec. 2004
文章编号:1000 5471(2004)06 1069 04
菘蓝离体培养过程中愈伤组织和
再生芽发生的细胞组织学观察①
曾建军1 , 2 , 　孙一铭1 , 　孙　敏1 , 　肖　璇1
1.西南师范大学 生命科学学院 , 重庆 400715;2.井冈山学院 生命科学系 , 江西 吉安 343009
摘要:对菘蓝子叶和下胚轴在离体培养过程中的细胞分裂 、 分化以及器官发生进行了细胞组织学观察.研究结果
表明:培养 2～ 5 d , 切口处及维管束薄壁细胞均开始脱分化 , 恢复分裂能力形成愈伤组织 , 愈伤组织表层细胞启
动分化形成芽原基.2种外植体不定芽的起源方式均为外起源.
关　键　词:菘蓝;外植体;离体培养;形态发生
中图分类号:Q94 文献标识码:A
十字花科植物菘蓝(I sat is indigot ica For t.)是一种有重要开发前景的药用植物[ 1] , 为常见中药材大青
叶及板蓝根的主要来源 , 具有较好的抗病毒效果.通过植物遗传转化将目的基因转入菘蓝是一项有较高应
用价值的技术.植物的转基因技术除需要建立高效的植株再生系统外 , 成功转化的关键是将外源基因导入
那些具有再生能力的细胞[ 2] .菘蓝高效再生系统的研究已有报道[ 3] , 但尚未见其形态发生的报道.笔者以
菘蓝的下胚轴 、子叶为外植体 , 对其培养过程中细胞脱分化和芽发生进行了石蜡切片观察和分析 , 以期为
菘蓝转基因工程研究提供有用的参考.
1　材料和方法
试验材料为菘蓝(Isatis ind igot ica Fo rt.).用种子培育无菌苗 , 苗龄 7 d时 , 切取下胚轴(0.5 cm)、子
叶(0.5 cm×0.5 cm)作为离体培养的外植体.以 MS为基本培养基 , 下胚轴分化培养基附加 2 mg/L KT +
0.2 mg/L NAA , 子叶分化培养基附加 2mg/L 6-BA+1 mg/L NAA [ 3] , 于(25±1)℃、光强 1 500 lx.每天
16 h 光 、 8 h暗的光周期条件下培养.培养 2 d后第 1次取材固定 , 固定液为 FAA .以后的取材时间以外植
体在形态上有变化为准.常规石蜡切片法制片 , 切片厚度 8μm , 番红 固绿对染或海登汉氏苏木精染色 , 光
学树脂封片 , Nikon显微镜摄影.
2　结果与分析
2.1　不同外植体的形态反应
培养 3 d时 , 子叶培养基不再紧贴 , 外植体肥厚增大 , 略显不规则卷曲 , 下胚轴两端也略显肿胀 , 这表
明已有愈伤组织产生;培养 8 d时 , 子叶 、下胚轴皆呈黄绿色 , 子叶切口处分化出黄白色的愈伤组织(图版
Ⅰ 1), 下胚轴未见肉眼可见的愈伤组织 , 少数分化出不定芽;10 d左右 , 子叶愈伤组织上和外植体非切口
① 收稿日期:2004 02 17
作者简介:曾建军(1973 ), 女 , 江西井冈山人 , 硕士研究生 , 主要从事药用植物方面的研究.
通讯作者:孙　敏 , 教授.
DOI :10.13718/j.cnki.xsxb.2004.06.042
处与培养基接触面分化出肉眼可见少量绿色芽丛(图版 Ⅰ 2 , Ⅰ 3), 下胚轴切口处分化出 1 ～ 2个不定芽
(图版 Ⅰ 4).随培养时间增加 , 非切口处与培养基接触的地方分生细胞突破表层形成不定芽.分化芽子叶
较多 , 下胚轴次之.
2.2　愈伤组织形成过程中的细胞组织学观察
培养 2 ～ 5 d后取材切片观察表明 , 子叶表皮细胞部分破碎 , 切口处细胞和叶脉里的薄壁细胞都在诱导
培养下全面启动脱分化 , 并产生愈伤组织.下胚轴切口处 、靠近培养基非切口处表层细胞(图版Ⅰ 5)和维
管束薄壁细胞均见脱分化 , 也见极少愈伤组织产生.无论何种外植体 , 在诱导培养下 , 启动脱分化的薄壁
细胞的细胞质都变得稠密 , 细胞核在比例上增大 , 趋向中央 , 液泡化程度降低 , 成为一个具有分生组织特
性的细胞(图版 Ⅰ 6).分生组织分裂形成的愈伤组织为均质的 、活的薄壁细胞组成 , 有些细胞会再次脱分
化形成多个分生组织团(图版 Ⅰ 7), 即分生组织结节;分生组织进一步发育 , 部分细胞明显伸长弯曲 , 壁
不同增厚为导管 , 形成鸟巢状结构(图版Ⅰ 8), 即维管组织结节[ 4] .分生组织结节的出现证明愈伤组织的
发生 , 在子叶中分生组织结节多 , 而下胚轴中极少见 , 表明该培养基不利下胚轴愈伤组织发生.
2.3　再生芽形成的细胞组织学观察
当培养 8 ～ 10 d后 , 在子叶的愈伤组织表面分化出肉眼可见的绿色芽丛.取材固定观察 , 可看到在愈
伤组织内不同步形成的分生细胞团和维管结节.由于愈伤组织表层细胞比内部细胞更易接近诱导因子 , 因
而优先分化.分化时表层细胞进行垂周分裂(图版 Ⅰ 9), 形成体积小 、核大 、质浓的细胞 , 说明细胞处于
代谢旺盛期 , 正进行大量的 RNA合成[ 5] .随之进行平周和垂周分裂形成突起(图版 Ⅰ 10), 出现生长点并
由之分化出芽原基(图版 Ⅰ 11), 这表明芽原基的发生是外起源的.芽原基的下方没有维管组织结节的存
在 , 说明菘蓝愈伤组织芽的形成与维管组织结节无直接联系.
对培养 8 d的下胚轴纵切观察表明 , 此时分生细胞团已活跃分裂为球形分生组织 , 分生细胞团表层细
胞不断向外增加细胞层数(图版Ⅰ 12), 连接成片 , 并逐渐抑制愈伤组织的生长 , 故在芽诱导培养基上未见
下胚轴分化出肉眼可见的愈伤组织.分生细胞团表面几层细胞分裂旺盛形成突起 , 分化形成芽原基(图版
Ⅰ 13), 芽原基中间细胞变长 , 且已出现螺纹导管分子.研究结果表明 , 子叶和下胚轴芽的起源均为外起
源 , 下胚轴芽发生方式为直接出芽.
3　讨　　论
农杆菌介导的转化方法主要作用于外植体表层细胞 , 如果再生植株细胞起源于深层细胞 , 则很难得到
转化体[ 2 , 6] .本试验结果表明 , 菘蓝外植体芽原基的产生为外起源.在接种后 5 d左右内部出现较多的变
化 , 多个部位开始启动细胞分裂.同时 , 分生细胞的分裂速度加快 , 此时是导入外源基因的最佳时期 , 所以
接种 5 d后再转入筛选培养基将有利于提高转化率.
基因工程较好的途径是采用器官由体细胞直接发生的方式 , 例如直接诱导外植体分化不定芽.因为直
接出芽方式具有获得再生植株周期短 、不经过脱分化 、体细胞无性系变异小 、能较好保持受体细胞的遗传
稳定性以及转化的外源基因也能实现稳定遗传等优点[ 7 , 8] .经组织学观察 , 我们在直接诱导芽分化的培养
基上诱导的菘蓝下胚轴的芽原基由分生细胞团产生 , 属直接出芽方式 , 子叶愈伤组织也迅速分化芽原基 ,
芽的起源方式为外起源.因此 , 该离体培养系统适合于菘蓝的遗传转化.
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Cytohistological Observations of Callus and
Adventitious Bud of Isatis indigotica Fort.
ZENG Jian- jun1 , 2 , 　SUN Yi-ming1 , 　SUN　Min1 , 　XIAO　Xuan1
1.School of Life Science , Southwest China Normal University , Chongqing 400715 , China ;
2.Department of Life Science , JingGangShan College , Jian Jiangxi 343009 , China
Abstract:Explants o f Isatis ind igot ica Fort.were cul tured in medium for induction of callus and bud fo r-
mation.Cy tohistological observat ions on cal lus and bud fo rmation w ere carried out.The resul ts are as fo l-
low s:af ter 2 5day s , callus different iated f rom parenchyma cell and cut surface of explants.Then , the ep-
idermal cel ls of the callus init iated to form bud primo rdium .The adventit ious buds of tw o explants w ere
externally o riginated.
Key words:Isatis indigotica Fo rt.;explants;culture in vit ro;morphogenesis
责任编辑　胡　杨　　　　
1071第 6期　　　　曾建军 , 等:菘蓝离体培养过程中愈伤组织和再生芽发生的细胞组织学观察
1.培养 8 d子叶后切口出诱导的愈伤组织;2.子叶非切口处分化出愈伤组织及芽点;3.培养 10 d后 , 子叶切口出分化的绿色芽丛;4.下
胚轴切口出分化的不定芽;5.子叶愈伤组织中多个分生细胞团;6.黑箭头示分生细胞;7.子叶愈伤组织表面的多层细胞启动;8.子叶横
切面示鸟巢状结构———维管结节(箭头处示螺纹导管分子);9.愈伤组织表面的突起;10.子叶横切面 , 示芽点的发生和两排平行状的维
管系统结构;11.下胚轴纵切面 , 表层细胞分裂脱分化;12.下胚轴纵切面 , 示愈伤组织表面的多层细胞启动;13.下胚轴纵切面 , 示芽点
的发生 , 黑箭头示螺纹导管分子
图版 Ⅰ　菘蓝愈伤组织和芽发生的细胞组织学
Plate Ⅰ　Cytohistolo gy of Callus and Buds in I.indigotica
1072 西南师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 29卷