全 文 ：第 27 卷第 6 期
2003 年 11 月
南 京 林 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版)
Journal of Nanjing Forest ry University(Natural Sciences Edition)
Vol.27 , No.6　
Nov., 2003　
大叶冬青叶外植体的愈伤组织诱导与不定芽苗再生
梁珍海 ,刘根林 ,蒋泽平 ,李玉巧 ,袁　芳
(江苏省林业科学研究院 ,江苏　南京　211153)
摘　要:将离体培养的大叶冬青幼叶外植体在含有 TDZ(噻吩隆 ,浓度 0.1 ～ 5.0 μmol/ L)与
IAA(浓度 0.1 ～ 5.0μmol/L)的WPM 培养基上培养 ,能够产生愈伤组织 。当 TDZ 浓度不变
时 ,5.0μmol/L IAA处理产生的愈伤组织块直径最大;愈伤组织块转培到含有不同浓度 TDZ
与 IAA 的WPM 培养基上 ,在 5.0μmol/LTDZ+3.0μmol/L IAA的培养基上出现较多不定芽
苗(每一愈伤组织块平均产生 11.2株);几种细胞分裂素作用比较研究表明:在 BA 、TDZ 与
ZT(均为 15.0 μmol/L)处理中 ,较好的芽苗增殖系数分别为 3.7 , 6.0 和 7.4 ,BA 与 2-ip(均为
3.0 μmol/ L)处理时芽苗高生长可达 34 mm和 45 mm 。
关键词:大叶冬青;叶外植体;愈伤组织;不定芽苗
中图分类号:S723　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1000-2006(2003)06-0051-04
Callus Induction and Adventitious Shoot Regeneration
of Ilex latifolia Thunb.Leaf Explants
LIANG Zhen-hai ,LIU Gen-lin , JIANG Ze-ping ,LI Yu-qiao , YUAN Fang
(Jiangsu Forestry Academy , Nanjing 211153 , China)
Abstract:In order to get I lex lati folia Thunb.tube-shoots in short time , leaves explant induction callus and
tube-shoo ts production experiments w ere carried out.Leaves of I lex lati folia Thunb.were cultured on
WPM supplemented with TDZ(0.1 ～ 5.0 μmol/ L)and IAA(0.1 ～ 5.0 μmol/L).Callus product ion was
highest at 5.0 μmol/ L IAA , for each TDZ concentration.When these calli were t ransferred to WPM supple-
mented wi th various levels of TDZ(3.0 or 5.0 μmol/L)and IAA(0.0 ,0.1 ,1.0 , 3.0 , 5.0 μmol/ L), the
highest number of adventitious shoo ts(11.2 per callus)fo rmed at 5.0μmol/L TDZ plus 3.0 μmol/ L IAA.
A comparison of cy tokinin activity showed that the best shoot proliferation w as obtained from cultures t reat-
ed with BA , TDZ and ZT(proliferation times w ere 3.7 , 6.0 and 7.4 respectively)at concentrations of 15.0
μmol/ L.The longest shoots w ere produced in cultures grow n w ith BA o r 2-ip at 3.0μmol/L(34 mm and 45
mm respectively).
Key words:Ilex lati folia Thunb.;Leaf explant;Callus;Adventitious shoo t
大叶冬青(Ilex lati fol ia Thunb.)属冬青科冬青属常绿高大乔木 ,自然分布于我国长江以南地区 ,
是一种珍贵的观赏及叶用保健树种 ,也是西南林区天然林的构成成分之一 。据研究 ,大叶冬青叶片含有
多种药用成分 ,具有很高的药理与保健作用 ,是国内保健饮品苦丁茶的主要原料 。随着人们对优质天然
保健饮品苦丁茶的需求量增大 ,常规繁殖(即种播育苗因种子深休眠 ,一般发芽需 2 a 以上时间)难以短
期满足苗木市场的巨大需求;同时播种育苗母树的优良性状 ,特别是药用成分难以均一地在后代中得到
遗传 ,这就无法保证大叶冬青(苦丁茶)有效药用成分标准化 。而利用植物组织培养手段可以在技术上
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收稿日期:2003-03-12　　　　修回日期:2003-07-25
基金项目:“西南林区天然林保育技术研究与示范”子课题;江苏省农业三项工程“药用保健树种大叶冬青种质资源引进”项目
作者简介:梁珍海(1965-),男 ,江苏泗洪人 ,江苏省林业科学研究院副研究员 ,硕士。
较好地解决上述问题 ,并在短时期内获得优良无性系植株。
有关冬青属植物的组织培养已有不少报道[ 1～ 8] ,但有关由大叶冬青叶外植体诱导愈伤组织再分化
产生不定芽苗方面的研究却未见报道。此研究旨在建立一个愈伤组织诱导体系 ,形成一整套不定芽苗
分化 、增殖的方法。
1　材料与方法
1.1　愈伤组织诱导
从生长在户外的大叶冬青植株上取下腋芽 ,以体积分数为 1%的次氯酸钠溶液(含 0.1% Tween
20)表面消毒 8 min后 ,再以无菌水清洗 3次(每次 4 min),将腋芽外植体接种在MS培养基上。约 15 d
后 ,腋芽绽开 ,长出幼小嫩叶 ,将叶长 5 ～ 10 mm 的幼叶切下 ,横切每片幼叶两半 ,接种于内装 30 mL 培
养基的三角瓶中 ,培养基成分为WPM[ 9] +TDZ +IAA(TDZ 为 Thidiazuron缩写 ,噻吩隆 ,一种苯基脲物
质),植物激素浓度分别为 0.1 ,1.0 ,3.0和 5.0 μmol/L ,形成 16种不同浓度配比的组合 ,每一组合培养
基5瓶 ,以进行 5次重复试验 ,每瓶接种叶外植体 3枚。接种后置于(26±2)℃进行暗处理约 40 d ,测量
愈伤组织块的直径 ,并对数据作统计处理。
1.2　不定芽苗再生
将上述两种组合培养基中诱导的愈伤组织块平均剖成两块 ,每块直径大约 8 ～ 10 mm ,置于培养基
WPM+TDZ +IAA上培养以诱导不定芽苗再生 , TDZ 浓度分别为 3.0或 5.0μmol/L , IAA 浓度分别为
0.0 , 0.1 , 1.0 ,3.0 ,5.0 μmol/ L ,培养条件为(26±2)℃、4 000 lx以及每日光照 16 h ,培养时间 40 d。
1.3　不定芽苗增殖
将长短大小较为一致(7 ～ 10 mm)的不定芽苗从愈伤组织块上取下 ,继代培养在WPM 培养基上 ,
培养基中除含有 5.0 μmol/ L IAA 外 ,还分别含有 5种不同细胞分裂素 ,即 BA 、KT 、2-ip 、ZT 和 TDZ ,浓
度各有 6个梯度 ,即 0.0 ,3.0 ,6.0 ,9.0 ,12.0和 15.0 μmol/L ,培养 30 d后 ,观察分裂素对大叶冬青不定
芽苗的增殖与高生长的影响。并对所获数据作统计处理。
2　结果与分析
2.1　不同处理对愈伤组织的影响
表 1　TDZ与 IAA对大叶冬青叶外植体诱导
的愈伤组织生长的影响
Table 1　Effects of TDZ and IAA on growth of leaf-
derived Ilex latif olia callus
植物生长调节
剂/μmol·L -1
T DZ IAA
愈伤组织
直径/mm
植物生长调节
剂/μmol·L-1
TDZ IAA
愈伤组织
直径/mm
0.1
1.0
0.1 2.1
1.0 5.3
3.0 9.8
5.0 11.1
0.1 4.5
1.0 7.2
3.0 11.6
5.0 13.3
3.0
5.0
0.1 6.3
1.0 11.4
3.0 13.6
5.0 16.5
0.1 7.1
1.0 14.4
3.0 16.8
5.0 17.3
接种 30 d后 ,在幼叶外植体切口表面就可见到
坚硬 、球形的愈伤组织 ,暗处理约 40 d时 ,有 50%的
原始叶外植体完全被愈伤组织所覆盖。不同培养基
上所诱导的愈伤组织块其直径不同(表 1)。当 TDZ
浓度一定时 , 愈伤组织块的直径随着 IAA 浓度
(0.1 ～ 0.5μmol/ L)的上升而增大 , 当 IAA 为
0.5 μmol/ L时 ,愈伤组织块直径为最大;当 IAA 浓
度不变时 ,愈伤组织块的直径随着 TDZ 浓度(0.1 ～
0.5 μmol/L)的上升而增大 , 以 TDZ 浓 度为
0.5 μmol/ L时 , 愈伤组织块的直径为最大 。这与
Sw artz等报道的冬青组培结果基本相似[ 10] 。此试
验也证明 , TDZ对于促进木本植物外植体愈伤组织
的形成具有很强的细胞分裂活性[ 11] 。当然 ,在这一
愈伤组织诱导试验中 ,形成的愈伤组织还不能直接再分化成不定芽苗 ,但是 ,愈伤组织的产生通常是再
生不定器官的必要步骤。
2.2　不同处理对不定芽苗再生的影响
接种 40 d 后 ,不同处理培养物上分化出无根的不定芽苗(图 1a),可以断定它们属于器官发生而非
体胚发生 。由图 1a可知 ,TDZ 能促进不定芽苗的再生 ,浓度为 5.0 μmol/L 时比 3.0 μmol/L 时更有效
果。平均每一愈伤组织块再生芽苗的最大数量可达 11.2株 ,此时培养基为WPM +TDZ 5.0 μmol/L+
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南 京 林 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版)　　　　　　第 27 卷　第 6 期　
IAA 3.0μmol/ L。在培养基WPM +TDZ 5.0μmol/L+IAA 5.0μmol/ L中能再生芽苗的有效愈伤组织
块占培养总数的百分比最高(60%)(图 1b)。这与文献[ 12]报道的培养在含 TDZ 与 NAA 培养基上的
阿尔及利亚常春藤(Hedera canariensis)不定芽苗分化的情形大体相似 。虽然 TDZ 已使许多植物外植
体愈伤组织再生不定芽苗 ,但在大叶冬青愈伤组织再分化芽苗中使用 TDZ 属首次 。
图 1　TDZ与 IAA 对大叶冬青叶外植体愈伤组织的影响
Fig.1　Effects of TDZ and IAA on the number of adventitious shoots(a)and the percentage
of shoo t reg eneration(b)on leaf-derived of I lex lati folia
◆TDZ 3.0μmol/ L;□TDZ 5.0μmol/ L
2.3　不同处理对不定芽苗增殖的影响
细胞分裂素类物质显著地影响着不定芽苗的增殖(图 2a)。BA 、TDZ 和 ZT 比 KT 与 2-ip更能提高
不定芽苗的增殖系数;没有细胞分裂素类物质 ,不会出现芽苗的增殖;最大增殖系数分别出现在 5种激
素浓度都为 15.0 μmol/L 时。芽苗的高生长则随着 5种相关激素浓度的增高而下降(图 2b)。这说明
细胞分裂素对芽苗的增殖与高生长作用存在着显著差异。BA 、TDZ 与 ZT 处理的最大增殖系数分别为
3.7 , 6.0和 7.4;在BA与 2-ip浓度都为3.0μmol/L 时 ,芽苗高度为最大 ,分别为 34与45 mm ;而相同浓
度下 ,KT 、TDZ 和ZT 处理的芽苗高度则仅为 19 ,13和 10 mm 。由图 2还可知 ,在 IAA 浓度一定(5.0
μmol/L)时 ,高浓度的 BA(15.0μmol/L)处理 ,芽苗增殖系数高(3.7);低浓度的 BA(3.0μmol/L)处理 ,
芽苗生长高度较好(34 mm),显然高浓度的 BA处理抑制了芽苗的高生长。
图 2　几种细胞分裂素对不定芽苗增殖(a)与高生长(b)的影响
Fig.2　Effects of various cytokinins on shoot proliferation(a)and shoo t length (b)
of callus-derived regenerants of I lex lati folia
IAA 为 5.0μmol/ L;—◇—2-ip;—□—BA;—■—KT;—×—TDZ;— ×—ZT
3　结　论
(1)离体培养基的大叶冬青幼叶外植体在含有 TDZ(0.1 ～ 5.0 μmol/L)与 IAA(0.1 ～ 5.0 μmol/L)
的WPM 培养基上 ,能够产生愈伤组织 。当 TDZ 浓度不变时 , 5.0μmol/ L的 IAA处理产生的愈伤组织
块直径最大。
(2)愈伤组织块转培到含有 TDZ(3.0或 5.0 μmol/L)与 IAA(0.0 , 0.1 , 1.0 ,3.0 , 5.0 μmol/L)的
WPM培养基上 , 较多不定芽苗(每一愈伤组织块平均产生 11.2 株)出现在 5.0 μmol/LTDZ +
3.0 μmol/ L IAA 的培养基上。
(3)几种细胞分裂素作用比较研究表明:较好的芽苗增殖系数出现在 BA 、TDZ 与 ZT(均为
15.0 μmol/L)处理中 ,分别为 3.7 , 6.0 和 7.4 , 而较好的芽苗高生长却出现在 BA 与 2-ip(均为
3.0 μmol/ L)处理中 ,分别为 34和 45 mm 。作为细胞分裂素的 BA对大叶冬青叶外植体不定芽苗的处
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　2003年　总第 108期　　　　　　　　梁珍海等:大叶冬青叶外植体的愈伤组织诱导与不定芽苗再生
理 ,能产生较适宜的增殖系数与高生长 。
[ 参 考 文 献 ]
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(责任编辑　郑琰炎炎)
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