全 文 ：收稿日期:2014-04-15
基金项目:安徽中医药大学自然科学研究基金(2014zr015)
作者简介:谢冬梅(1975-)，女，在读博士研究生，讲师，专业方向:药用植物资源与中药质量评价;Tel:0551-65169306，E-mail:xiedongmei96
@ 126. com。
* 通讯作者:黄璐琦，Tel:010-64014411，E-mail:huangluqi01@ 126. com。
·鉴别·
应用位点特异性扩增反应鉴别垂盆草及其近缘植物
谢冬梅1，2，黄璐琦3* ，秦民坚1，王德群2，蒋 超3，袁 媛3
(1. 中国药科大学，江苏 南京 211198;2. 安徽中医药大学 /安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究
所，安徽 合肥 230038;3. 道地药材国家重点实验室培育基地 /中国中医科学院中药资源中心，北京
100700)
摘要 目的:建立垂盆草药材的 DNA分子鉴定方法。方法:不同地区野外采集景天属垂盆草及其近缘药用植
物共 4 种，分别提取总 DNA，扩增 cpDNA trnL-trnF序列，比对所有样品的该段核苷酸序列，设计特异性鉴别垂盆草
及其近缘种的位点特异性引物。结果:垂盆草及其近缘易混淆品的 trnL-trnF序列具有多个稳定的 SNP位点;选取
适宜的变异位点设计的 2 对特异性引物，在一定的退火温度，只有垂盆草扩增后产生预期长度的阳性扩增产物，而
其他 3 种近缘种在同等条件下不能被有效扩增。结论:所设计的鉴别引物在适宜的反应条件下能特异性鉴别垂盆
草及其近缘易混淆植物。
关键词 垂盆草;近缘种;位点特异性;分子鉴别
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)10-1768-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2014. 10. 014
AS-PCＲ Amplification in Identification of Sedum sarmentosum with Its Ｒelative Species
XIE Dong-mei1，2，HUANG Lu-qi3，QIN Min-jian1，WANG De-qun2，JIANG Chao3，YUAN Yuan3
(1. China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China;2. Anhui University of Chinese Medicine / Institute of TCM Ｒesources
Protection and Development，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei 230038，China;3. State Key Laboratory Breeding Base of
Dao-di Herbs /National Ｒesources Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，
China)
Abstract Objective:To develop a scientific and effective method for identification of Sedum sarmentosum and its relative materi-
als easily confused. Methods:DNA templates were extracted from plants，and DNA fragments of cpDNA trnL(tＲNA-Leu)gene and
trnL-trnF intergenic spacer were amplified and sequenced subsequently. trnL-trnF sequences of all samples were aligned. Ｒesults:The
allele specific PCＲ method was studied with the designed allele-specific for distinguishing different samples. The result indicated that
300 bp and 500 bp DNA fragments were amplified from Sedum sarmentosum，where no any fragment was amplified from its relative spe-
cies under the same reaction condition. Conclusion:The primers designed in this study are specific for Sedum sarmentosum from its rela-
tive species.
Key words Sedum sarmentosum Bge.;Ｒelative species;Single nucleotide polymorphism;Molecular identification
中药材垂盆草为景天科景天属植物垂盆草 Se-
dum sarmentosum Bge. 的干燥全草，始载于《本草纲
目拾遗》，性凉，味甘、淡，具有利湿退黄、清热解毒
的功能，用于湿热黄疸、小便不利、痈肿疮疡〔1〕。现
代研究表明，垂盆草主要含有蛋白质、氨基酸、糖类、
黄酮类、三萜类及垂盆草苷类成分，具有保肝护肝、
抗菌、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫力和改善妇女更年
期生活质量等作用，对急慢性咽炎和扁桃体炎也有
良好治疗作用，是重要的药用植物资源〔2-5〕。
由于景天属植物叶片、花、种子多形态较小，干
燥后肉质叶片易脱落，同属广泛分布的爪瓣景天
S. onychopetalum Frod. 、短蕊景天 S. yvesii Hamet、佛
甲草 S. lineare Thunb. 在性状鉴定和显微鉴定中与
垂盆草非常相近，给药材的基原鉴别带来极大的困
难。已开展的垂盆草鉴别方法不能很好地满足中药
材鉴定工作的实际需要，因此需要建立高效、简便、
客观的中药分子鉴别方法，为垂盆草的“真伪”鉴定
提供保证。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymor-
phism，SNP)在基因组水平上广泛存在，因其分布广
泛、数量众多、双等位特性易于检测，常用来研究物
种的起源与进化，进行物种的鉴定，在药材近缘易混
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淆品种鉴别研究中具有重要意义〔6，7〕。位点特异性
PCＲ(Allele-specific polymerase chain reaction，AS-
PCＲ)是在 PCＲ扩增的基础上发展的一种 SNP分型
方法，该方法具有快速、简便的特点，已成功用于白
花蛇舌草〔8〕、人参与西洋参〔9〕、白术与苍术〔10〕、金银
花〔11-13〕等中药材的真伪鉴别。本研究通过对垂盆
草及其同属近缘植物的叶绿体基因 trnL-trnF 序列
的扩增，分析不同植物间序列差异，寻找适合的 SNP
位点设计特异性扩增引物，应用 AS-PCＲ 建立药材
垂盆草及其易混淆近缘植物间的分子鉴别方法，为
中药材垂盆草“真伪”的分子鉴别提供可行的方法。
1 材料与试剂
1. 1 材料 实验用垂盆草及其近缘植物爪瓣景
天、短蕊景天、佛甲草均为景天属景天组(Sedum
sect. Sedum)植物，分别采自安徽、浙江、重庆、江苏、
湖北等地，材料来源见表 1，所有标本均经安徽中医
药大学王德群教授鉴定，凭证标本保存于安徽中医
药大学药学院生药系。
表 1 垂盆草及其近缘植物实验材料来源
样品编号 采集标本号 来源植物 拉丁学名 采集地 数量 /株
1 201305030015 垂盆草 Sedum sarmentosum 安徽省芜湖市 3
2 201305110022 垂盆草 Sedum sarmentosum 安徽省黄山市 3
3 201305140038 垂盆草 Sedum sarmentosum 安徽省池州市 3
4 201305140051 垂盆草 Sedum sarmentosum 安徽省黄山市 3
5 201305260058 垂盆草 Sedum sarmentosum 浙江省丽水市 4
6 201305280061 垂盆草 Sedum sarmentosum 浙江省龙泉市 3
7 201305310062 垂盆草 Sedum sarmentosum 浙江省杭州市 4
8 201306030018 垂盆草 Sedum sarmentosum 安徽省六安市 3
9 201306170077 垂盆草 Sedum sarmentosum 湖北省宜昌市 3
10 201305100080 垂盆草 Sedum sarmentosum 北京市海淀区 3
11 201306240079 佛甲草 Sedum lineare 重庆市南川区 3
12 201309200088 佛甲草 Sedum lineare 重庆市南川区 3
13 201307210082 佛甲草 Sedum lineare 安徽省芜湖市 3
13 201305140035 爪瓣景天 Sedum onychopetalum 安徽省池州市 3
14 201305240056 爪瓣景天 Sedum onychopetalum 江苏省南京市 6
15 201306030017 爪瓣景天 Sedum onychopetalum 安徽省六安市 3
16 201305140030 短蕊景天 Sedum yvesii 安徽省池州市 3
17 201305240056 短蕊景天 Sedum yvesii 江苏省南京市 3
18 201306030016 短蕊景天 Sedum yvesii 安徽省六安市 3
1. 2 仪器 微量移液器(德国 Eppendorf);MM400
混合型球磨仪(德国 Ｒetsch);5810Ｒ 低温冷冻离心
机(德国 Eppendorf);GB0XHＲ紫外凝胶成像分析仪
(英国 Syngene);DYY-12 电泳仪(北京市六一仪器
厂);ND-1000 超微量核酸蛋白测定仪(美国 Nano-
Drop);VeritiTM96 梯度 PCＲ 仪(美国 ABI 公司);
3730XL测序仪(美国 ABI公司)。
1. 3 试剂 2 × CTAB 提取液、1 × TAE 缓冲液、琼
脂糖(Promega 公司)，溴化乙锭(Fluka 公司)，rTaq
酶、Ex Taq 酶(Takara 公司)，2 000 bp DNA Marker
(Takara公司)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP 40，北京江晨
生物)，β-巯基乙醇、三氯甲烷﹑异戊醇、无水乙醇﹑
异丙醇均为国产分析纯，引物由生工生物工程(上
海)股份有限公司合成。
2 方法
2. 1 样品总 DNA 的提取 选取硅胶干燥的植物
叶片 10 mg左右置于 2 mL EP管中，采用改良 CTAB
法提取、纯化总 DNA，加入灭菌的超纯水(ddH2O)
50 μL使之溶解。采用 1. 0%琼脂糖凝胶进行电泳
检测 DNA质量(6 × Loading buffer 3 μL、DNA样品 2
μL及 DL2000 marker 5 μL进行点样，电压 180 V，时
间 15 min左右)，SYNGENE 凝胶成像系统观察、成
像保存。
2. 2 SNP位点标记的获取和特异性引物设计
2. 2. 1 目标序列 PCＲ扩增和测序:常用的 DNA条
形码主要包括叶绿体基因组的 rbcL、matK、psbA-
trnH和 trnL-trnF序列以及核基因组 ITS 序列，由于
不同基因的进化速度、分辨率、片段长度等存在差
异，叶绿体基因组中的 trnL-trnF 序列多用于组间及
种间发育研究，可用于发现不同种间的 SNP位点。
使用通用引物进行扩增，其中引物 trnL 序列:
5-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3，引物 trnF 序列:
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5-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3。PCＲ 反应体积
25 μL，体系包含 ddH2O 19. 8 μL，10 × Ex Taq buffer
2. 5 μL，dNTP 1 μL(10 mmol /L)，引物各 0. 25 μL
(10 mmol /L)，Ex Taq 0. 2 μL(5 U /μL) ，总 DNA 1
μL(约 30 ng)。扩增程序:94 ℃ 预变性 5 min;94
℃变性 45 s，58 ℃退火 1 min，72℃延伸 1. 5 min，35
个循环;72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。
PCＲ扩增产物经纯化后，使用 ABI 3730XL 测
序仪进行双向测序，应用 Seqman 软件进行拼接、校
验，除去低质量序列后得到 trnL-trnF序列。
2. 2. 2 NCBI 数据库获取:通过 NCBI 数据库
(www. ncbi. nlm. nih. gov)检索，共获得 3 条与样品
有关的 trnL-trnF 序列信息，分别是垂盆草 Sedum
sarmentosum Bge． (GenBank:JQ954575，AB089774)
及其近缘植物佛甲草 Sedum lineare Thunb． (Gen-
Bank:AB089773)。
2. 2. 3 SNP位点分析、选择和特异性引物设计:通
过 ClastalⅩ2. 1 软件进行序列比对，分析垂盆草及
其近缘植物的 SNP 变异位点;选择 SNP 距离在 150
～ 500 bp 的 3 个不同位点应用 Primer5-Cracked 软
件设计特异性鉴别引物，设计的引物送生工生物公
司进行合成。
2. 3 位点特异性 PCＲ鉴别垂盆草及其近缘种 利
用设计的特异性引物对不同样品 DNA 进行 PCＲ 鉴
别。PCＲ反应体系应包括 10 × buffer、dNTP、鉴别
引物对、rTaq 酶、DNA 模板和 ddH2O，反应在梯度
PCＲ 扩增仪上进行;PCＲ 反应条件的选择参照
“2. 2. 1”项下进行，考察不同退火温度的影响。反
应结束后取 PCＲ 产物 2 μL，加入 3 μL 6 × Loading
buffer，混匀后于 EB 染色的 1. 5%琼脂糖凝胶电泳
检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。
使用位点特异性 PCＲ鉴别引物，通过扩增反应
物条带的有无、亮度和产物长度等判断和鉴别垂盆
草及其近缘植物。
3 结果
3. 1 目标序列 PCＲ扩增效率和测序成功率 通用
引物 trnL、trnF 可以成功实现景天属垂盆草及其近
缘植物的 PCＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像见
图 1。
图 1 通用引物 trnL和 trnF对垂盆草及其
近缘植物 DNA扩增的凝胶电泳图
M. DL2000 Marker 1、2. 垂盆草 3、4. 爪瓣景天 5、6. 短
蕊景天 7、8. 佛甲草 C. 阴性对照
由图 1 可以看出，通用引物 trnL 和 trnF 可以较
好地实现对垂盆草及其近缘植物的目标序列进行扩
增，扩增产物长度在 850 ～ 1 000 bp 之间，双向测序
和序列比对结果显示，所获得序列包含了 trnL 内含
子及 trnL-trnF 间隔区，与 NCBI 数据库获取的垂盆
草 S. sarmentosum Bge. (GenBank:JQ954575)一致。
3. 2 SNP位点分析、选择和特异性引物设计 通
过不同样品 trnL 内含子及 trnL-trnF 间隔区序列比
对，发现 trnL内含子在 18 ～ 574 bp之间存在多个稳
定的 SNP变异位点，根据鉴别引物的设计目标，选
择第 18 位点(A /G)、第 182 位点(C /A)、第 513 位
点(C /A)进行特异性引物设计，在所设计的鉴别引
物 3端第 2 或 3 个碱基引入错配，特异性引物目标
扩增长度分别为 300 bp 和 500 bp。鉴别用引物序
列见表 2。
3. 3 特异性引物扩增反应条件的确定及验证 由
于特异性 PCＲ鉴别引物中人为引入错配位点，因此
考察不同退火温度、不同酶的使用等对 PCＲ反应效
率的影响。结果表明特异性鉴别中使用 rTaq 酶能
明显区分不同样品 DNA 的扩增，其中特异性引物
SarJB F2-SarJB Ｒ在退火温度 42 ～ 60 ℃均能不同程
度扩增出 500 bp左右的条带，特异性引物 SarJB F1-
SarJB Ｒ在退火温度 42 ～ 60 ℃之间仅能对垂盆草扩
增出 300 bp 左右的条带，条带有无、亮度及扩增产
物长度如图 2。
表 2 特异性鉴别用引物序列
序列 引物 引物序列 5-3 特异性扩增目标长度 /bp
SarJB1 F1 GCAGAGACTCAACGGAAGTGG 300
Ｒ CTAGCAATTTCCTTGTTGTCAGTAT
SarJB2 F2 TTGTATTGAGCCTTGGTATGGTA 500
Ｒ CTAGCAATTTCCTTGTTGTCAGTAT
注:G、T为增加特异性而引入的错配
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图 2 不同特异性 PCＲ引物鉴别垂盆草及其近缘植物凝胶电泳图
M. DL2000 Marker 1、2. 垂盆草 3、4. 爪瓣景天 5、6. 短蕊景天 7、8. 佛甲草 C. 阴性对照
由图 2 可以看出，不同特异性鉴别引物在 42 ～
60 ℃扩增效果不同。其中特异性引物 SarJB F1-Sar-
JB Ｒ在退火温度 42 ～ 60 ℃之间均能不同程度扩增
出垂盆草，而其他近缘植物扩增效果较差或无法扩
增;特异性引物 SarJB F2-SarJB Ｒ 退火温度 52 ℃时
均能扩增较亮的 500 bp 左右的条带，而在 60 ℃时
仅垂盆草能扩增出特异性条带，可以很好地鉴别垂
盆草及其近缘植物。
4 讨论与结论
本研究对核基因序列 ITS(引物:1F 和 4Ｒ)、叶
绿体基因 psbA-trnH(引物:psbA-trnH)分别进行
PCＲ扩增、双向测序和比对，其中 ITS 序列长度在
650 ～ 700 bp 之间，psbA-trnH 序列长度在 220 ～ 240
bp之间，而 trnL内含子及 trnL-trnF 间隔区序列 GC
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含量适宜，长度在 850 ～ 880 bp 之间，显示出良好的
长度与 SNP位点多态性，适用于设计特异性鉴别引
物。
PCＲ扩增条件包括温度、时间和循环次数，其
中退火温度是影响 PCＲ 特异性的较重要因素。退
火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓
度，还有靶基序列的长度。在 Tm 值允许范围内，选
择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特
异性结合，提高 PCＲ反应的特异性。
本研究中基于 trnL-trnF 序列中 SNP 的特异性
设计的两对引物均能应用 AS-PCＲ 准确、快速鉴别
药材垂盆草及其近缘植物，该分子鉴别方法可为亲
缘关系相近的药用植物间的准确鉴别提供研究依
据。
参 考 文 献
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09-18.
售《广东地产药材研究》一书
由广州中医药大学附属中山医院梅全喜教授主编的《广东地产药材研究》一书于 2011 年 5 月由广东科技出版社正式出
版发行，该书是我国近年出版的一部有关广东地产药材研究的重要专著，全书 130 多万字，由总论、各论和附录三部分组成，总
论部分主要介绍广东的地理生态特点及地产药材资源、广东地产中药发展历史沿革、广东地产药材应用的典范———广东凉
茶、论广东地产药材的研究与开发及开展广东地产药材研究应重视品种考证工作等方面内容。各论部分收载广东地产药材
170多种，附有 170 多张药用植物图片，按别名、来源、性味、功能主治、用法用量、药用历史、化学成分、药理作用、临床应用、附
注、参考文献等 11 个栏目内容来描述。其中最为重点的栏目是药用历史、化学成分、药理作用和临床应用。书的附录部分列
举了本书编写涉及到的参考书目、药物中文名称索引及药用植、动、矿物学名索引，方便读者查考阅读。该书由国医大师、广
州中医药大学邓铁涛终身教授题写书名，中国工程院院士、中国医学科学院药用植物研究所名誉所长肖培根教授题词，中国
中医科学院副院长兼中药研究所所长黄璐琦教授和中国医学科学院药用植物研究所所长陈士林教授为本书写序。同时，该
书还获 2010 年度国家出版基金资助。全书为铜版纸彩印精装，定价 288 元，现有少量现书供邮购，实收 250 元(含邮费)。需
要者请与广东省中山市中医院药学部高玉桥联系，地址:广东省中山市西区康欣路 3 号，邮编:528401，邮箱:aqiaosky@
163. com，电话:0760-88815106。
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