全 文 ：园　艺　学　报　2002 , 29 (3):358 ～ 362
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:2001-06-15;修回日期:2001-11-13
基金项目:国家教育部高等学校骨干教师资助计划项目 〔教技司 (00) 65号〕
＊现工作单位:天士力集团生物技术和生物制品研究开发中心。
＊＊通讯联系人 , E-mail:chendefu@public.tpt.tj.cn。
不同来源红 木材料的 RAPD分析及分类学探讨
李晨东1＊　唐前瑞2　陈德富1＊＊　夏立新1 　陈喜文1　陈友云2
(1南开大学生物化学与分子生物学系 , 天津 300071;　2湖南农业大学园艺系 , 长沙 410128)
摘　要:以 2 个生态型 木材料为对照 , 对在各原产地收集到的 14 个红 木材料进行 55 个随机引物
的 RAPD反应 , 共产生 632 条稳定的扩增带 , 其中 427条具有多态性。按扩增带的有无列出二元数据矩阵 ,
利用 NTSYS-pc计算Nei氏相似系数及遗传距离 , 利用 SAS 软件进行主成分分析。结果表明:红 木是 木
的变种 , 供试的 14 个红 木材料分属 4 类 , 其突变途径可能是一个复杂的过程 , 存在着 木不同生态型
间 、 木与红 木之间 , 红 木之间的相互作用。
关键词:红 木;RAPD;遗传距离;聚类分析
中图分类号:S 68　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2002)04-0358-05
RAPD技术是研究系统进化 、 分类学等问题的有效工具〔1～ 4〕 , 国内外已成功地应用 RAPD技术对
多种植物进行了亲缘关系 、系统进化和品种鉴定等研究 。红 木 (Loropetalum chinense var.rubrum)
是常绿或 半落叶灌 木 , 属 金缕梅科 (Haamelidaceaem)金缕梅亚 科 (Subfam H.) 木属
(Loropetalum), 其野生种产于湘东山区 , 即罗宵山脉腹部的浏阳与醴陵相邻区域〔5〕 。由于其叶型小
巧 、 叶色与众不同 , 具有极大的观赏价值和经济价值 。目前因自然变异 , 已发现许多突变类型。现在
对红 木的研究大多局限于生理 、 组织培养等方面 , 其分类的研究也仅在生理水平得出红 木是 木
(Loropetalum chinense)的变种的结论〔10〕 。作者以来源于两个不同生态型的 木为对照 , 采用 RAPD技
术对 14个红 木材料的遗传关系进行了研究 , 探讨了红 木的突变途径和可能的起源 , 旨在为红
木资源的整理 、 品种命名等提供相关的分子生理学基础 , 也为红 木的遗传育种 、 遗传工程等提供一
些有益的参考。
1　材料与方法
1.1 　材料
供试材料取自湖南农业大学园艺系园林植物资源圃 3年生扦插苗 , 根据来源和形态特征收集了
14个红 木材料 , 几乎包括了各产地所能收集的红 木材料。以来源不同的两个生态型 木为对照
(表 1)。
1.2 　方法
1.2.1 　红 木总 DNA的提取　在湖南初春季节 (3月 1 ～ 7日)收集叶片 , 随机摘取 2 g 幼嫩叶片 ,
立即带回实验室按文献 〔6〕 方法提取总 DNA 。
1.2.2 　RAPD及其产物的检测　为了保证结果的可重复性 , 每个 RAPD扩增重复2次以上。扩增反应
体系为 22 μL/管 , 其中包括 1×缓冲液 , MgCl2 2.5×10-6mol/L , dNTP 0.4×10-6mol/L , 引物 2×10-7
mol/L , 2 U Taq DNA聚合酶 (上海Sangon产品)及 100 ng模板DNA 。扩增反应在PTC-200型热循环仪
(MJ Research Inc.)上进行 , 研究所用的随机引物及序列见表 2 。反应首先 94℃变性 5 min , 然后进行
以下 41 个循环:94℃ 40 s , 37℃ 32 s , 72℃ 105 s , 最后于 72℃延伸 7 min。取 8 μL 扩增产物在
1.6%琼脂糖凝胶中电泳 , 电泳介质为 1×TAE 缓冲液 , 电泳完毕以 0.5 μg/mL 浓度的 EB 染色
30 min , 用蒸馏水振荡洗涤凝胶 15 ～ 30 min , 紫外透射仪上观察照相。
表 1 　不同来源的红 木材料
Table 1　The list of materials of L.chinense var.rubrum from different fountainhead areas
编 号 No. 来 源地 Fountainhead area 叶色 Leaf color 叶 形 Leaf shape
1 湖南浏阳柏加乡 Bojia country Liuyang , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
2 湖南浏阳团然乡 Tuanran country , Liuyang , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
3 湖南浏阳柏加乡 Bojia country , Liuyang , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
4 湖南浏阳柏加乡 Bojia country , Liuyang , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
5 湖南浏阳团然乡 Tuanran country , Liuyang , Hunan 紫 Purple 菱 形 Lozenge
6 湖南浏阳永和镇 Yonghe town , Liuyang , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
7 湖南浏阳永和镇 Yonghe town , Liuyang , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
8 湖南浏阳柏加乡 Bojia country , Liuyang , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
9 湖南长沙天心区 Tianxin district , Changsha , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
10 湖南长沙芙蓉区 Furong district , Changsha , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
11 湖南长沙苗圃 Nursery garden of Changsha , Hunan 紫红 Purple red 椭 圆 Ellipse
12 湖南浏阳郊区 Suburbs of Liuyang , Hunan 紫红 Purple red 卵 圆 Egg round
13 湖南长沙望城县 Wangcheng country , Changsha , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
14 湖南长沙天心区 Tianxin district , Changsha , Hunan 红赭 Red-ochre 椭 圆 Ellipse
15 (CK) 湖南桑植 Sangzhi , Hunan 绿 Green 椭 圆 Ellipse
16 (CK) 湖南浏阳永和镇 Yonghe town , Liuyang , Hunan 绿 Green 椭 圆 Ellipse
1.2.3 　数据处理　每个材料扩增带的有无分别以 1 、 0代表。利用 NTSYS-pc 软件的 Nei和 Li〔7〕的方
法计算各材料间的简单相似系数F , 并转换成遗传距离 (D=1-F)。F=2×Sab/ (Sa +Sb), 其中 Sa 、
Sb代表两材料的总扩增带数 , Sab为两材料共有的扩增带数 。然后按NTSYS-pc中的非加权算术平均数
方法 (unweighted pair group method with arithmetic mean , UWPGA)对 Nei相似系数进行聚类 , 并利用
SAS 软件进行主成分分析 (principal components analysis , PCA)。
2　结果与分析
2.1 　DNA多态性分析
采用上海 Sangon公司合成的 116个10 mer随机引物进行 RAPD分析 , 均能产生扩增带 , 有 84个
随机引物的扩增带有差异 , 其中 55个随机引物的扩增带清晰而稳定 , 大小为 200 ～ 3000 bp (图 1),
平均每个引物的扩增带数为 11.49条 , 55个引物产生稳定的多态性扩增产物见表 2 。从以上结果可以
　　　　　　　
图 1　引物 S2 (左)和 S35 (右)的 RAPD扩增结果
1～ 16为不同材料的编号 , 详见表 1 , M为 GeneRulerTM DNA Ladder Mix。
Fig.1　The RAPD amplified profile using the primer S2 (Left) and S35 (right)
1-16 is the number of materials , see table 1.M is GeneRulerTM DNA Ladder Mix.
3593 期　　　　　　　　　　李晨东等:不同来源红 木材料的 RAPD 分析及分类学探讨　　　　　　　　　　　
看出 , 55个随机引物共产生 632个扩增产物 , 其中 427个具有多态性 , 占 67.6%。产生多态性结果
的随机引物的所有扩增产物都用于分析 , 由于 RAPD是显性标记 , 所以每个扩增产物都可以看作是一
个性状 , 相当于比较了 16份供试材料的 632个性状 , 其中 427个性状是多态的。
表 2　产生 RAPD 多态性带的随机引物
Table 2　The list of the used primers which ampl ified polymorphic bands by RAPD
引 物
Primers
序 列
Sequences
总带 数
Total bands
多态 性带
Polymorphic bands
%
S1 GTTTCGCTCC 8 5 62.5
S2 TGATCCCTGG 8 4 50.0
S4 GGACTGGAGT 16 13 81.3
S6 TGCTCTGCCC 8 5 62.5
S7 GGTGACGCAG 15 13 86.7
S8 GTCCACACGG 18 17 94.4
S10 CTGCTGGGAG 12 5 41.7
S21 CAGGCCCTTC 8 4 50.0
S23 AGTCAGCCAC 5 1 20.0
S24 AATCGGGCTG 12 4 33.3
S25 AGGGGTCTTG 18 8 44.4
S26 GGTCCCTGAC 13 9 69.2
S27 GAAACGGGTG 15 10 66.7
S29 GGGTAACGCC 18 15 83.3
S30 GTGATCGCAG 10 5 50.0
S31 CAATAGAAGT 15 12 80.0
S32 TCGGCGATAG 18 14 77.8
S33 CAGCACCCAC 11 4 36.4
S34 TCTGTGCTGG 14 11 78.6
S35 TTCCGAACCC 21 16 76.2
S36 AGCCAGCGAA 15 13 86.7
S38 AGGTGACCGT 15 10 66.7
S98 GGCTCATGTG 7 3 42.9
S99 GTCAGGGCAA 7 4 57.1
S103 AGACGTCCAC 17 9 52.9
S111 CTTCCGCAGT 19 15 78.9
S147 AGATGCAGCC 13 4 30.8
S159 ACGGCGTAGT 16 15 93.8
引 物
Primers
序 列
Sequences
总带 数
Total bands
多 态 性带
Polymorphic bands
%
S161 ACCTGGACAC 12 9 75.0
S162 GGAGGAGAGG 8 6 75.0
S165 TGTTCCACGG 6 5 83.3
S166 AAGGCGGCAG 10 2 20.0
S182 CCTCTGACTG 15 12 80.0
S183 CAGAGGTCCC 9 4 44.4
S186 GATACCTCGG 6 4 66.7
S187 TCCGATGCTG 6 2 33.3
S188 TTCAGGGTGG 6 5 83.3
S189 TCCTGGTCCC 7 4 57.1
S190 ACCGTTCCAG 6 3 50.0
S202 GGAGAGACTC 10 6 60.0
S203 TCCACTCCTG 6 3 50.0
S208 AACGGCGACA 13 9 69.2
S209 CACCCCTGAG 17 10 58.8
S431 TCGCCGCAAA 12 11 91.7
S432 CACAGACACC 9 6 66.7
S433 AGCGTCACTC 10 7 70.0
S434 TCGTGCGGGT 11 9 81.8
S436 AAGCGACCTG 16 8 50.0
S437 CATTGGGGAG 12 11 91.7
S439 CTCCGTACTG 13 10 76.9
S440 GGTGCTCCGT 8 5 62.5
S1291 GACCCCGACA 14 12 85.7
S1295 GGCAGCAGGT 5 4 80.0
S1299 CTCGATCACC 5 4 80.0
S1475 TGCCTGGACC 8 7 87.5
Total 632 427 67.6
图 2　根据 RAPD资料计算的不同材料间亲缘关系聚类图(左)与 PCA分析图(右)
1～ 16如表 1。
Fig.2　Genetic relationship dendrogram of different materials generated from RAPD data(left), figure based on PCA(right)
1-16 andM indicates as in table 1.
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2.2 　供试材料间的遗传关系
聚类分析结果 (图 2)显示作为对照的红 木聚在一起 , 供试的 14个红 木材料聚在一起 , 说
明它们分属不同类型;在红 木中通过聚类图又可以细分出四类:5号为第一类 , 12号为第二类 , 11
号为第三类 , 其他红 木材料 1 ～ 4 、 6 ～ 10 、 13和 14号为第四类 。PCA 结果同样很好地显示了它们
之间的亲缘关系 , 将 木和红 木以及红 木各类间区分开来。根据它们间的遗传距离 (表 3), 我
们发现第四类红 木与湖南浏阳 木的亲缘关系较近 , 而第一 、三类红 木与湖南桑植 木的亲缘关
系较近 , 第二类红 木与两个不同生态型 木的遗传距离相同 。并且 RAPD分析得到的结果与各材料
间叶片的形态差异非常吻合 , 第一类红 木为紫色菱形叶片 , 第二类为紫红色卵圆形叶片 , 第三类为
紫红色椭圆形叶片 , 第四类为红赭色椭圆形叶片 。
表 3　根据 RAPD 资料计算的不同材料的遗传距离
Table 3　The genetic distance matrix of different materials based on RAPD data
编号 No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 0
2 0.0482 0
3 0.0373 0.0285 0
4 0.0548 0.0504 0.0482 0
5 0.3969 0.3794 0.3772 0.3991 0
6 0.0592 0.0548 0.0395 0.0614 0.3772 0
7 0.0504 0.0504 0.0351 0.0658 0.3860 0.0395 0
8 0.0724 0.0768 0.0702 0.0877 0.4035 0.0614 0.0658 0
9 0.0746 0.0658 0.0592 0.0855 0.3969 0.0636 0.0724 0.0461 0
10 0.0746 0.0614 0.0548 0.0680 0.3925 0.0636 0.0680 0.0855 0.0658 0
11 0.3377 0.3465 0.3311 0.3531 0.4452 0.3399 0.3355 0.3531 0.3553 0.3553 0
12 0.3706 0.3531 0.3596 0.3596 0.4123 0.3596 0.3596 0.3640 0.3662 0.3706 0.3706 0
13 0.0724 0.0680 0.0614 0.0746 0.4035 0.0658 0.0746 0.0746 0.0636 0.0680 0.3575 0.3684 0
14 0.1009 0.0921 0.0855 0.1031 0.3969 0.0855 0.0899 0.0943 0.0877 0.0921 0.3640 0.3882 0.0680 0
15 0.4518 0.4693 0.4539 0.4671 0.4846 0.4539 0.4539 0.4583 0.4693 0.4737 0.4430 0.4539 0.4671 0.4649 0
16 0.4211 0.4386 0.4320 0.4364 0.4934 0.4232 0.4189 0.4364 0.4474 0.4518 0.4518 0.4539 0.4452 0.4386 0.4123 0
　　注:编号见表 1。 　Note:No.see table 1.
3　讨论
3.1 　供试红 木材料的分类
本研究结果显示红 木不同材料间的遗传距离在 0.029 ～ 0.399间 , 而与 木的遗传距离都在
0.42以上 , 大多在 0.45左右。如果我们将供试材料分成两大类 (比如在遗传距离 0.40处划分), 则
可将 木与红 木明显分开 , 结合生理上的结论〔5〕 , 我们认为红 木为 木的一个变种 。若对 14个
不同来源的红 木材料再细分成 4个类型 , 则可将 5号划为第一类 , 12号划为第二类 , 11号划为第
三类 , 其它红 木材料划为第四类 。其中第四类的11个材料间的遗传距离在 0.03 ～ 0.10之间 , 说明
彼此间的亲缘关系十分密切 , 这些红 木材料很可能来源于同一个株系 , 相互之间仅存在着微小的个
体差异。
对供试材料的形态特征与分子聚类结果对比分析 , 发现聚类结果与各材料叶片间的形态特征基本
吻合。14个红 木材料的叶色为红色 , 木叶片为绿色 , 从形态和分子水平都可以明显地将红 木
和 木分成两大类。在红 木 4类中 , 第一类叶色为紫色 , 第二 、三类为紫红色 , 第四类为红赭色。
并且第一类叶形为菱形 , 其它类型都为扁圆形。第二类与第三类是各类之间遗传距离最近的 (根据表
3计算得到), 从二者的形态上也能够得到相似的结论 , 但它们之间也有一定差异 , 第二类的叶形是
卵圆形 , 第三类的叶形与大部分红 木相似 , 为椭圆形。结合这些形态特征和我们得到的聚类结果 ,
3613 期　　　　　　　　　　李晨东等:不同来源红 木材料的 RAPD 分析及分类学探讨　　　　　　　　　　　
进一步说明了 RAPD标记技术是寻找种类差异和多态性研究的有效手段 。上述 RAPD分析结果可为合
理开发红木资源提供依据 。
3.2 　红 木突变途径的探讨
红 木是 木的变种 。第一类红 木 (5号)与 木的平均遗传距离是 0.4890 , 第二类红 木
(12号)是 0.4539 , 第三类 (11号)是 0.4474 , 第四类 (其它)是 0.4488。因此推测 木可能首先
突变到第三类红 木 , 经过第四 、 第二类 , 最后突变到第一类 。
从遗传距离 (表 3)中不难发现 , 第四类红 木与两个不同生态型 木的遗传距离也不尽相同 ,
第四类红 木与 15号 木的遗传距离大于与 16号 木的遗传距离 , 所以可以初步认为第四类红 木
更可能是由湖南浏阳 木突变而来 。但对第一类 、第三类红 木与不同生态型 木的遗传距离分析情
况则完全相反 , 这两类的红 木材料都是与 16号 木的遗传距离大于与 15号 木的遗传距离 , 说明
这二类的红 木更可能是由湖南桑植 木突变而来。再对第二类红 木与 15 、 16号 木的遗传距离
进行分析 , 发现遗传距离相同 。由于我们不了解浏阳 木与桑植 木之间的突变过程 , 所以也就无法
对红 木原产地的问题进行探讨 , 但本文结果可以初步说明红 木的突变过程不是仅由一个生态型
木单独突变而成的 , 有可能是由多个生态型 木共同突变而成的。也就是说红 木的突变是一个非常
复杂的过程 , 其中存在着不同生态型 木间的作用 , 红 木与 木间的作用 , 还有红 木之间的相互
作用 。
参考文献:
1　Williams J G K , Kubelik A R , Livak K L , et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nucleic Acids
Research , 1990 , 18 (22):6531～ 6535
2　汪小全 , 邹喻苹 , 张大明 , 等.RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题.植物学报 , 1996, 38 (12):952～ 962
3　Gonzalez J M , Ferrer E.Random amplified polymorphic DNA analysis in Hordeum species.Genome , 1993, 36:1029～ 1031
4　Marillia E F , S coles G J.The use of RAPD markers in Hordeum phylogeny.Genome , 1996 , 39:646～ 654
5　黄瑞康 , 杨金桂 , 贺中华 , 等.红 木资源调查研究.湖南农业科学 , 1998 , 4:44～ 45
6　陈德富 , 陈喜文 , 侯志波 , 等.黄瓜随机扩增多态 DNA (RAPD)研究初报.南开大学学报 (自然科学), 1999 , 32 (4):47～ 50
7　Nei M , Li W A.Mathematical model for studying genetic variat ion in terms of restrict ion endonucleases.Proc.Nat l.Acad.Sci.USA , 1979 ,
76:5269～ 5273
RAPD Analysis and Taxology Discussion on Loropetalum chinense var.rubrum
Materials from Different Fountainhead Areas
Li Chendong1 , Tang Qianrui2 , Chen Defu1 , Xia Lixin1 , Chen Xiwen1 , and Chen Youyun2
(1Department of Biochemistry and Molecular Biology , Nankai University , Tianjin 300071 , China;　2Department of Horticulture ,
Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , China)
Abstract:Contrasted with 2 different Loropetalum chinense ecotypes , fourteen Loropetalum chinense var.
rubrum materials representing almost all the types could be were analyzed by RAPD in this paper.Fifty-five random
primers produced 632 steady amplified bands in total , among them 427 bands were polymorphic.Strong and clear
bands were scored for their presence or absence in a binary data matrix.Nei s similarity coefficients and genetic
distances were calculated by NTSYS-pc software , and principal components analysis was done by SAS software.
The result demonstrated that L .chinense var.rubrum is a mutant of L.chinense on molecular level and 14 L.
chinense var.rubrum materials were classified into 4 groups.The mutant pathway of 4 groups is possibly a
complicated process , including interactions between different ecotypes L.chinense , interactions between L.
chinense and L .chinense var.rubrum , and ineractions between different L .chinense var.rubrum.
Key words:Loropetalum chinense var.rubrum;RAPD;Genetic distances;Cluster analysis
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