全 文 ：中西 医结合肝病杂志 2 0 0 2 年第 12 卷第 1期
扯根菜及其系统提取物抗乙型肝炎病毒
体外实验研究
赵建勤 , 杨 明 3 赵连三 2
1
. 云南省大理医学院 ( 6 7 1 0 0 0)
周明眉 3 王 兴 3 邹文检毛 何 芳 2 秦
2
. 四川大学华西医院 3 . 成都中医药大学
山 2
4
. 四川大学
摘 要 目的 : 通过体外实脸 , 探讨杜根莱及其 系统提取物扰 乙肝病毒的作用 。 方法 : 将中药杜根莱及其系统提取
物作用于 H B V D N A 转染细胞系 22 15 细胞 , 通过检浏细胞培养液 中 H sB A g 、 H eB A g 的变化来评价扯根莱及其系统提
取物杭 乙肝病毒的效果及其可能的药理 活性部位 。 结果 : 当水提取物浓度为 264 陀 / m l 、 直接水提取物浓度为 57 雌 /ml
时 , 对 22 15 细胞分泌 H B e A g 的抑制 率分别为 54 . 79 写及 54 . 09 % , 治疗指数 ( T D > 2 。 结论 : 征根莱水提取物和 直接
水提取物达到一定 浓度时 , 在体外有一 定的扰 乙肝病毒作用 。
关键词 杜根茱 乙 型肝炎病毒 2 15 细胞 体外实脸
I n h i b i t o r y E f f e e t o f P e n t h o ur m C h i n e s e P u r s h o n H e P a t i t i s B V i r u s i n V i t or
z 万A O J i a n g i n , , 丫乃 N G iM n g 3 , z H A O “ a n s a n Z , e t a l . 1 . aD il eM d i ca l C o l le g e , uY n n a n p 阳 v i n e e ( 6 2一0 0 0 )
A加 t r a e t o b j e e t iv e : T o e s t im a t e t h e a n t i一H BV e f f e e t o f P e n t h o 、 m hC 艺n e s e P u sr h . M e t h o d : U s i n g t h e t r a d i t io n a l
C h i n e s e m e d i e in e P e n t h o ur m C h若n e s e P u sr h t o t r e a t 2 215 e e l ls i n v i t or . R e s u l t : Wh e n t h e w a t e r e x t r a e t s e o n e e n t r a t io n
w a s 26 4料g /m l , t h e i n h i b i t o r y r a t e t o H eB A g w a s 5 4
·
7 9写. w h e n t h e d i r e e t w a t e r e x t ar e t s e o n e e n t r a t i o n w a s 5 7户g /m l ,
t h e i n h ib i t o r y r a t e t o H eB A g w
a s 5 4
.
0 9 %
.
T h e r a p e u t ie I n d e x ( T l ) > 2
.
C o n e l u s io n : T o s o m e e x t e n t
,
P
e n t h o r u m C h i en
s e
P
u
sr h 1
5 e f f e e t iv e in in h ib i t i n g H B V r e P l ie a t i o n i n v i t or
.
K e y w o
r d s P e n t h o ur m C h i
n e s e P u sr h H e P a t it is B V i r u s 2 21 5 C e l l L i n e s 知 iV t or
肝苏颖粒的主要成分有虎耳草科扯根菜属植物扯
根菜 (尸en ht ~ m hC i n es e 尸 u sr h ) 和报春花科植物金钱
草 (lys im a e人i a e入ir s t i n a e 万 a n e e ) 。 经临床验证 , 肝苏
颗粒具有降酶 、 保肝 、 退黄 、 健脾等功效 , 可用于治
疗慢性乙型肝炎及急性病毒性肝炎 。 2 2 1 5 细胞株是体
外筛选抗 乙型肝炎病毒 良好 的细胞模型 , S el l s 等人
1 9 8 7 年用共 转染法 将 H B V D N A 导入 肝癌 细胞 株
H e p G :
, 实现了 H BV 在体外的成功表达并能分泌完整
的 H B V 颗粒 。 笔者应用 2 2 1 5 细胞株为模型 , 对扯根
菜及其系统提取物的体外抗 一 H BV 活性进行了研究 。
1 材料与方法
1
.
1 药物 扯根菜及其系统提取物 , 均用超纯水配
制 , 滤纸过滤 , 高压蒸气灭菌 , 4℃保存 。 使用时均用
M E M 培养基稀释成各种不同浓度 。
1
.
2 培养液 培养液为含 2 0 0拌g /m l G 4 1 8 (美国 5 19 -
m a 公司生产 ) 和 20 写小牛血清 (成都华西生化制品厂
生产 ) 的 M E M 培养基 。
1
.
3 2 2 1 5 细胞 H B s A g 、 H B e A g 分泌动力学的测定
将 2 2 1 5 细胞按 1 X 1 0 5 个 /m l 的浓度接种于 2 4 孔板 ,
l m l /孔 , 5% C O : 3 7℃培养 , 于实验第 3 、 5 、 7 、 1 0 、
14 d 收集培养上清 , 一 20 ℃冻存 。 统一用 E L is A 法测
定 H B s A g 、 H B e A g , 显色反应完成后用 自动酶标仪读
取 O D 值 , 结果以 P / N 值表示 。
1
.
4 药物的 细胞毒性试验 2 2 1 5 细胞按 1 X 1 05 个 /
m l 的浓度接种于 9 6 孔细胞培养板 , 0 . l m l/ 孔 , 5%
C O : 3 7℃培养 4 d , 移去培养液 , 换 以含有不 同浓度药
物的培养基 , 每个浓度 2 孔 , 共设 10 个药物浓度 , 另
设不加药物的正常细胞对照 。 继续培养 s d (第 d4 时更
换 1 次相同浓度的相同药液 ) 后判读结果 , 判定对细
胞无毒性作用的最高药物浓度 。 用显微镜观察细胞病
变 ( C P E ) 程度 : 将 10 0%破坏 、 75 %破坏 、 5 0 %破坏 、
25 %破坏 、 无破坏分别记为 + + + + 、 + + 十 、 + 十 、
中西 医结合肝病杂志 2 0 0 2年第 12 卷第 1 期
十和 0。
1
.
5 药物体外杭 一 H B V 病毒活性的测定 将 2 21 5 细
胞按 I X 10 5个 / m l 的浓度接种于 24 孔细胞培养板 ,
每孔 l m l , 3 7℃ 5 % C O : 培养 4 d 后 , 各孔分别换以含
不同浓度药物的培养基 , 继续培养 8d (第 4d 时更换相
同浓度的相同药液 ) , 并分别收集药物作用后第 d4 和
s d 的培养上清 , 一 2 0℃冻存 , 统一用 E L IS A 法检测
H B s A g
、
H B e A g
。 根据药物的细胞毒性测定结果 , 选
用对细胞无明显毒性作用的浓度 4 个 , 以不同药物对
2 2 1 5 细胞的最大无毒剂量为起始浓度 , 加人培养液对
倍系列稀释 , 每个浓度均设 2 个复孔 、 并设不加药物
的正常细胞为对照 。
1
.
6 药物作用后细胞培养上清液 中 H sB A g 、 H eB A g
的浏定 均采用 E L is A 法 , 显色反应完成后用 自动酶
标仪读取 O D 值 , 计算 P / N 值和抑制率 , 以抑制率大
于 5 0%判为有抑制作用 。
一 ` , * 对照孔 P / N 值一实验孔 P /N 值 、 , , ~ 。 /抑制率一二望二匕长云群翰节斋汽扩二=一 X 10 0 %洲 ’阴个 一 对照孔 P /N 值
2 结果
2
.
1 2 2 1 5 细胞的 H B s A g 、 H eB A g 分泌动力学 2 2 1 5
细胞于第 3d 开始有 H B s A g 、 H eB A g 分泌 , 以后逐渐
增加 , 持续到检测的 14 d 。 见附图 。
抗病毒活性 。 见表 1 。
裹 1 ! 接水提取物及水提取物对 2 2 1 5 细胞抑翻率
直接水提取物 水提取物
浓度 伽g / m l) 抑侧率 (% ) 浓度 伽 g /m l ) 抑创率 (% )
643263
,目1一b几」
5 4
。
0 9
4 0
.
0 6.
,`00口勺O曰
14
.
2 5 2 6
.
3 2
7
.
1 25 2 8
。
0 1
5 4
.
7 9
4 7
.
6 6
2 4
.
8 5
2 6
。
4 6
匡瓢
(天 )
附田 2 2 1 5 细胞 H B s A g 、 H eB A g 分泌动力学
2
.
2 药物对细胞的毒性作用 扯根菜及其系统提取
物对细胞毒性作用 因浓度不同而异 , 对细胞无明显毒
性作用的最高药物浓度分别为 : 水提取物 2 64 拌g /m l 、
直接水提取物 57 拜g /m l 、 乙酸乙酷提取物 25 拼g /m l 、 乙
醇提取物 27 5拌g /m l 、 水提后醇提取物 1 60 拌g /m l 、 正丁
醇提取物 1 9 2 . 5拌g /m l 。
2
.
3 药物的体外杭病毒作用 以抑制率大于 50 纬判
一 为有效 l1[ , 结果表明 , 在药物作用 d4 , 水提取物浓度
为 2 6 4拌g /m l 、 直接水提取物浓度为 57 产g /m l 时 , 对
221 5 细 胞 H B e A g 分 泌 抑 制 率分 别 为 5 4 . 7 9%及
5 4
.
0 9%
, 治疗指数 ( T l = T C s。 / IC s。 ) 分别为 2 . 8 3及
4
.
1 5
, 提示水提取物 、 直接水提取物在体外有一定的
3 讨论
2 2 1 5 细胞在一定的培养条件下 , 能长期稳定地分
泌 H sB A g 、 H eB A g 和 H B V 颗粒 , 笔者首先对现有的
2 2 1 5 细胞分泌 H B s A g 、 H B e A g 的情况进行 T 测定 , 并
研究了 H sB A g 及 H eB A g 的分泌规律 , 为本实验药物
作用时间的选择奠定了基础 。 为了排除药物非特异性
细胞毒性而造成细胞死亡的影响 , 我们测定了各种药
物对 2 2 1 5 细胞的毒性 , 选择对细胞基本无毒性作用 的
浓度进行了药物抗 H B V 活性检测 。 本文结果显示 : 当
水提取 物 浓度 为 264 拜g / m l 、 直 接水 提 取物 浓度 为
5 7拌g / m l 时 , 对 2 2 1 5 细胞 H B e A g 分泌的抑制率分别
为 5 4 . 9 7写和 54 . 0 9% , T l> 2阁 。 提示其在体外有一定
的抗 H B V 活性 。 有研究提示水提取物及直接水提取
物中含没食子酸及懈皮素 a1[ , 而没食子酸及懈皮素具
有抗病毒活性闭 。 本研究结果表明 : 肝苏具有一定的体
外抗 一 H B V 活性 , 且其抗病毒活性成分可能主要存在
于水提取物及直接水提取物 中 。 然而在水提取物及直
接 水提 取物 的多种 复杂成 分 中 , 要 确定 其具 有抗 -
H BV 活性 的有效单体 尚需对其复杂成分作进一步分
离纯化和研究 。
本研究 中其他提取 物在无明显细胞毒性 的浓度
下 , 对 2 2 1 5 细胞分泌 H sB A g 、 H eB A g 的抑制率均小
于 5 0 % , 提 示这些 部位 的药 物 组分 可 能无 体外 抗
H B V 活性 。
参考文献
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3 陈兴其 , 袁艺 , 艾克惠 , 等 , 新药肝苏化学成分研究 . 中成药 , 1 9 98 ,
2 0 ( 1 1 )
:
4 0
4 孙文基 , 金房 . 天然活性成份简明手册 . 第 l 版 . 北京 : 中国医药
科技 出版社 , 1 9 98 , 2 4 9 : 4 7 6
(收稿 日期 : 2 0 0 1一 1 0一 2 9 编辉 : 姚昌经 )
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