全 文 ：实用中西医结合临床 2016年 9月第 16卷第 9期
●中西药苑●
蒌蒿乙酸乙酯部位体外抗乙型肝炎病毒的实验研究 *
罗文艳 1 段和祥 2#
（1南昌大学第四附属医院药剂科 江西南昌 330003；2江西省药品检验检测研究院 南昌 330029）
摘要：目的：研究蒌蒿乙酸乙酯部位体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。方法：蒌蒿药材用 95%乙醇提取后，用乙酸乙酯萃取
获得有效部位，作用于 HBV-DNA转染的 HepG2.2.15 细胞上。采用 MTT 法检测乙酸乙酯部位对 HepG2.2.15 细胞的半数抑制浓度
（IC50）， 用 ELISA法观察乙酸乙酯部位对 HepG2.2.15 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg 表达的抑制作用。 结果： 蒌蒿乙酸乙酯部位对
HepG2.2.15 细胞有一定的细胞抑制作用，对 HepG2.2.15 细胞分泌 HBsAg和 HBeAg表达有不同程度的抗原抑制作用。 结论：蒌蒿
乙酸乙酯部位有较强的抗乙型肝炎病毒作用。
关键词：乙型肝炎病毒；蒌蒿乙酸乙酯部位；乙型肝炎病毒表面抗原；乙型肝炎病毒 e抗原
Experimental study on Ethyl Acetate Fraction from Artemisia selengensis anti- HBV in vitro
LUO Wen-yan1, DUAN He-xiang2#
(1Department of Pharmacy, The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang330003;
2Jiangxi Institute for Drug Control, Nanchang330029)
Abstract: Objective: To study the effect of ethyl acetate from Artemisia selengensis anti-HBV in vitro. Methods: After the
Artemisia selengensis were extracted with 95% ethanol, extracted with ethyl acetate. Then the effective part was acted on HBV-DNA
transfected HepG2.2.15 cells. MTT assay was used to detect ethyl acetate fraction inhibitory concentration 50% of HepG2.2.15 cells.
ELISA method was used to investigate the suppressor effect on HBsAg and HBeAg in the cultured HepG2.2.15 cells which were gene
transferred with HBV. Results: Ethyl acetate fration from Artemisia selengensis have a certain cell inhibitory effect on HepG2.2.15 cells.
HepG2.2.15 cells the secretion of HBsAg and HBeAg express different degrees of antigen inhibition. Conclusion: The ethyl acetate from
Artemisia has strong anti HBV effect.
Key words: HBV; Ethyl Acetate Fraction from Artemisia selengensis; HBsAg; HBeAg
中图分类号：R285.5 文献标识码：B doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.09.045
蒌蒿（Artemisia selengensis Turcz. ex Bess.）为
菊科（Compositae）蒿属（Artemisia Linn.）植物，俗名
藜蒿，在我国各地均有分布，但以生长在长江中下游
的鄱阳湖、洞庭湖和太湖等地区的品质为佳[1]。全草
入药，性平味甘，有止血消炎、镇咳化痰、开胃健脾、
散寒除湿等功效[2]。目前，针对蒌蒿的研究主要集中
在抗菌、抗氧化、降压、抗肿瘤等活性物质及其药理
活性方面[3~7]，而蒌蒿抗乙型肝炎的功效，尚未引起
人们的重视。本试验采用 MTT法和酶联免疫吸附
试验法（ELISA），研究了蒌蒿乙酸乙酯部位对体外
乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎病毒 e
抗原（HBeAg）的抑制作用。现报告如下：
1 仪器与材料
1.1 仪器设备 Forma3131 三气细胞培养箱
（Thermo Fishier公司），ST-360酶标仪（上海科华实
验系统有限公司），KQ-500E型超声波清洗器（昆山
市超声波仪器有限公司），ST16R 低温离心机
（Thermo Fishier 公 司），Synergguv 超 纯 水 仪
（Millipore 公司），净化工作台（苏州净化设备有限
公司）。
1.2 材料 蒌蒿药材采自鄱阳湖畔草滩，经江西省
药品检验检测研究院袁桂平主任中药师鉴定为菊科
蒿属植物蒌蒿的全草。DMEM培养基、胎牛血清购
于美国 GIBCO 公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜
（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购于 Sigma公
司；青霉素、链霉素（上海先锋药业有限公司）；
HBsAg检测试剂盒、HBeAg检测试剂盒（美国 BD
公司）；其余试剂均为分析纯。
1.3 细 胞 株 及 细 胞 培 养 HepG2.2.15 是
HBV-DNA 细胞转染 HepG2 而建立的 HepG2.2.15
细胞株，由军事医学科学院放射与医学辐射学研究
所提供，培养基为 DMEM高糖型培养基，含 10%
FBS，0.2 mg/ml的 G418，用前加入 100 U/ml青霉素
和 100 U/ml链霉素。
2 方法
2.1 样品的制备 称取鲜蒌蒿 1.0 kg，切碎，晾干，
用 95%乙醇回流提取 2次，每次 2 h，合并回流液，
回收乙醇，浓缩至干浸膏，加适量的水使溶解，依次
用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，弃去石油醚与
三氯甲烷萃取液，取乙酸乙酯萃取液，浓缩蒸干，即
得蒌蒿的乙酸乙酯部位。
2.2 细胞培养 在长满 HepG2.2.15细胞的培养瓶
内加 0.25%胰蛋白酶消化、传代、保种。取对数生长
期的细胞用 DMEM高糖型培养基制备成 1×105个
*基金项目：江西省卫生厅中医指导性计划（编号：2013B014）；
江西省科技厅青年科学基金资助项目（编号：20122BAB215044）
#通信作者：段和祥，E-mail：duanhx_007@163.com
84· ·
实用中西医结合临床 2016年 9月第 16卷第 9期
/ml的混悬液，按每孔 100 μl接种于 96孔细胞培养
板中，置 37℃，饱和湿度，5% CO2培养箱中培养 24
h，待细胞长成单层后，每孔加入含有不同浓度的药
物（蒌蒿乙酸乙酯部位用培养基系列倍比稀释，制备
成 0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 mg/ml 等 7 个
不同浓度），每个浓度平行 4个孔。同时设细胞对照
组（不含药液的细胞培养液）及空白对照组（仅含培
养液）。将 96孔细胞培养板放回培养箱培养，每 2
天更换 1次新鲜的培养液，10 d后，取上清液，用
ELISA法计算抗原抑制率，余下细胞用 MTT法测
定半数抑制浓度（IC50）。
2.3 细胞培养结果测定 取“2.2”项下的上清液，
根据 ELISA试剂盒说明书操作，采用酶标仪于 450
nm的波长处测定 OD值。余下细胞，每孔加 0.2 ml
新鲜配制的含有 0.2 ml MTT 的无血清培养基，在
37℃继续培养 4 h后，以 3 000 r/min的速度离心 5
min，倒出上清液，加 0.2 ml DMSO溶解 MTT甲臜
沉淀，超声 5 min后，用酶标仪于 570 nm下测定 OD
值。按（1-OD 给药组 /OD 对照组）×100%计算抑制率。
2.4 统计学处理 采用 SPSS20.0 统计学软件分
析，试验数据均以（x±s）表示，采用 t检验。P＜0.05
为差异有统计学意义。
3 结果
药液对 HepG2.2.15 细胞的 IC50 值为 2.55
mg/ml，对 HepG2.2.15细胞分泌 HBsAg和 HBeAg
的 IC50值分别为 48.52 mg/ml和 1.86 mg/ml。见表 1。
组别 浓度（mg/ml） HepG2.2.15细胞OD570 抑制率（%）
HBsAg
OD450 抑制率（%）
HBeAg
OD450 抑制率（%）
蒌蒿乙酸乙酯部位
细胞对照组
空白对照组
62.5
12.5
2.5
0.5
0.1
0.02
0.004
–
–
0.351±0.053*
0.502±0.070*
1.125±0.059*
1.551±0.074*
1.993±0.126
2.222±0.102
2.256±0.095
2.246±0.098
0.011±0.003
84.30
77.54
49.66
30.60
10.83
0.58
0
–
–
0.351±0.067
0.614±0.049
0.727±0.065
0.843±0.052
0.956±0.104
1.022±0.083
1.055±0.077
1.027±0.091
0.003±0.001
65.72*
40.04*
29.00*
17.68
6.64
0.20
0
–
–
0.151±0.011
0.202±0.017
0.209±0.039
0.426±0.051
0.587±0.072
0.651±0.054
0.671±0.085
0.668±0.048
0.008±0.002
77.12*
69.39*
68.33*
35.45*
11.06
1.36
0
–
–
表 1 蒌蒿提取物乙酸乙酯部位对 HepG2.2.15细胞及其分泌 HBsAg、HBeAg的抑制作用（x±s）
注：与空白对照组比较，*P＜0.05。
4 讨论
由表 1的结果可见，蒌蒿提取物乙酸乙酯部位
对 HepG2.2.15 细胞及其分泌 HBsAg、HBeAg具有
明显的抑制作用，并且抑制率的大小与浓度成正比。
这为进一步分离、纯化、鉴定乙酸乙酯部位抗乙型肝
炎病毒的活性成分提供了理论依据和技术支持。本
课题组前期研究了蒌蒿乙酸乙酯部位的化学成分，
并首次从蒌蒿药材中分离鉴定出反式白藜芦醇等
11种化学成分[8]。白藜芦醇是一种生物活性很强的
天然多酚类物质，查阅相关文献[9]，也发现白藜芦醇
及其衍生物有一定的抗乙型肝炎病毒的作用。
乙型肝炎是一种损害肝脏的病毒感染，可造成
急性或慢性疾病。从中国疾病预防控制中心获悉，
我国现有约 9000万慢性乙肝病毒感染者，其中约
2800万为慢性乙肝患者，每年约有 90万发展为肝
硬化，约 30万发展为原发性肝癌。在全球肝癌发病
和死亡人数最多的 20个国家中，我国排在首位。我
国人口约占全球人口的 20%，但肝癌发生及死亡人
数占全球的 50%以上。虽然我国中药资源非常丰
富，但从广阔的中药资源库中研究并开发出一种高
效低毒的抗 HBV的药物，还有很长一段路要走。
目前，通常是利用活性指导下的靶向追踪分离
技术，把目标药物作用于 HBV-DNA 转染的
HepG2.2.15 细胞，用 MTT 法检测目标药物对
HepG2.2.15细胞的 IC50，用 ELISA法观察目标药物
对 HepG2.2.15 细胞分泌 HBsAg和 HBeAg表达的
抑制作用。本研究结果为进一步研究抗乙型肝炎病
毒的活性化学物质基础，得到一系列抗乙型肝炎病
毒的活性成分，研究和开发具有自主知识产权的高
效低毒的抗肿瘤药物奠定了基础。
参考文献
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第七十六卷第二
册)[M].北京:科学出版社,1991.144
[2] 仲雨, 秦明珠. 蒌蒿的研究进展 [J]. 中医药学刊 ,2006,24(9):
1749-1750
[3]李晓明,刘跃钧,邓荣华,等.芦蒿不同部位清除自由基活性研究[J].
食品与机械,2012,28(5):116-119
[4]宇宙,胡居吾,付俊鹤,等.野生藜蒿提取物降压作用研究[J].食品工
业科技,2010(6):306-309
[5]Lu Zhang,Zong-cai Tu,Tao Yuan,et al.Solvent optimization,
antioxidant activity, and chemical characterization of extracts from
Artemisia selengnesis Turcz [J].Industrial Crops and Products,
2014,56(5):223-230
[6]Sandra Gouveia,Paula C.Castilho.Antioxidant potential of Artemisia
argentea LHer alcoholic extract and its relation with the phenolic
composition[J].Food Research International,2011,44(6):1620-1631
[7]Chen Ze-yu,Li Shui-qing,Liu Yun.Microwave-assisted Extraction and
Biological Activity Determination of Insecticidal Components of
Seleng Wormwood (Artemisia selengensis Turcz.)[J].Plant Diseases
and Pests,2010,1(6):51-53
[8]段和祥,罗文艳,杨毅生,等.蒌蒿醋酸乙酯部位化学成分研究[J].中
草药,2015,46(10):1441-1444
[9]周侠,吕秋军,王林,等.白藜芦醇及其衍生物抗乙型肝炎病毒体外
实验研究[J].中国药学杂志,2005,40(24):1904-1906
（收稿日期：2016-06-02）
85· ·