全 文 ：四倍体菘蓝基因组 DNA提取方法的比较
段英姿 ,客绍英 ,马艳芝 ,张胜珍 ,马作东　(唐山师范学院生命科学系 ,河北唐山 063000)
摘要　[目的]探讨四倍体菘蓝组培苗高质量DNA的提取方法。 [方法]分别采用CTAB法 1、CTAB法 2、SDS法 1、SDS法 2和碱裂解法
对四倍体菘蓝组培苗DNA进行提取试验 ,通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳 ,比较了 5种DNA提取方法对四倍体菘蓝组培苗的提
取效果。 [结果] CTAB法 2提取 DNA的OD260 /OD230值为 2.311, OD260 /OD280值为 1.774, DNA纯度最大 , 浓度最大 ,提取率最高 , PCR扩
增条带清晰 , 重复性好 ,所得 DNA的质量最好。 [结论 ]CTAB法 2是提取四倍体菘蓝组培苗基因组DNA最有效的方法。
关键词　四倍体菘蓝;DNA;提取;CTAB法;SDS法
中图分类号　S567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)17-08869-02
TheComparativeStudyofGenomicDNAExtractionMethodsfortheTetraploidIsatis
DUANYing-zietal　(DepartmentofBiology, TangshanTeacher sColege, Tangshan, Hebei063000)
Abstract　[ Objective] Theaimwastoresearchthemethodofhigh-qualityDNAextractionfromleavestissuecultureofthetetraploidIsatis.
[ Method]TheextractioneffectsoffivediferentDNA-extractingmethodssuchasCTABmethod1, CTABmethod2, SDSAct1, SDSFrance2
andthealkalinelysismethodwerecomparedbytheUVspectrophotometryandagarosegelelectrophoresis.[Result] TheresultsshowedthatCTAB
method2wasthebestmethod, OD260 /OD230valuewas2.311, OD260 /OD280valuewas1.774, DNAwasthemostpure, andithadthelargestcon-
centrationwasthehighestrateofextractionandthebestDNAguality, PCRbandsamplifiedclearandreproducible.[ Conclusion] CTABmethod
2wasanefectivewayforDNAextractionfromleavestissuecultureoftheteproducibleIsatis.
Keywords　TetraploidIsatis;DNA;Extraction;CTABmethod;SDSmethod
基金项目　唐山市科技攻关项目(04360701B-10)。
作者简介　段英姿(1974-),女 ,山东济宁人 ,硕士 ,讲师 ,从事植物育
种与生物技术研究。
收稿日期　2010-03-08
　　高质量 DNA的获得是进行分子遗传图谱的构建 、品种
遗传多样性及稳定性分析等分子生物学研究的首要步骤。
虽然目前许多文献已报道了多种 DNA提取的方法 ,如 CTAB
法 [ 1] 、SDS法 [ 2] 、碱裂解法等 ,但是在具体研究中仍需要根据
植物材料的不同情况进行 DNA提取方法的改进及筛选。
菘蓝(IsatisindigoticaFort.)为十字花科菘蓝属 2年生草
本植物 ,其根和叶均可入药 ,干燥根入药称板蓝根 ,干燥叶入
药称大青叶 ,具有清热 、解毒 、凉血 、止血之功效 ,对流感病毒
和多种病毒均有抑制作用。在临床上主要用于治疗流行性
感冒 、流行性腮腺炎 、流行性乙型脑炎 、急性传染性肝炎及咽
喉肿痛等症 ,市场需求量较大。为适应生产需要 ,提高药用
化学成分含量 ,唐山师范学院生命科学系药用植物学实验室
已对菘蓝进行多倍体诱导 ,并得到四倍体植株 ,但目前尚未
见菘蓝 DNA提取方法的研究报道。因此 ,笔者在总结前人
试验的基础上 ,以四倍体菘蓝组培苗幼芽为试验材料 ,探讨
适合四倍体菘蓝 DNA提取的最佳方法 ,为菘蓝分子的遗传
多样性和稳定性研究奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　供试材料　3 ～ 4cm的四倍体菘蓝组培苗 ,保存于 -70
℃冰箱中备用。
1.2　主要试剂的配制
1.2.1　2%×CTAB抽提液。称取 CTAB4.0g, NaCl16.364
g, 1.0 mol/LTris-HCl(pH值为 8.0)20ml, 0.5mol/LEDTA8
ml,先用 70 mlddH2 O溶解 ,再定容至 200ml,灭菌 ,冷却后加
入 1%巯基乙醇 400 μl,摇匀。
1.2.2　2%×SDS抽提液。称取 SDS0.4 g, 5 mol/LNaCl5
ml、1 mol/LTris-HCl(pH值为 8.0)1.0 ml、0.5 mol/LEDTA
2ml、0.2ml巯基乙醇 ,用灭菌的去离子水定容至 20ml。
1.2.3　10mg/mlRNaseA。取 1 mgRNaseA粉末溶于 1 μl1
mol/LNaAc溶液(pH值为 5.2)中 ,加入 89 μl灭菌去离子
水 , 100℃煮沸 15min,冷却至室温后加入 10μl1mol/LTris-
HCl(pH值为 7.4), -20 ℃贮存。
1.2.4　1×TE缓冲液。Tris-HCl(pH值为 8.0)1.0 mmol/L、
EDTA(pH值为 8.0)1.0 mmol/L。
1.3　方法　取出超低温冰箱保存的幼叶 ,分别采取以下方
法提取总 DNA。
1.3.1　CTAB法 1[ 3] 。①取 0.2 g菘蓝叶片置于预冷的研钵
中磨至粉状 ,加入 500 μl预热的 2%CTAB抽提缓冲液 ,轻轻
搅动摇匀;置于 65℃的水浴槽 ,每隔 10min轻轻摇动 , 40min
后取出。②加入等体积的氯仿 -异戊醇(24∶1),轻摇混匀 ,
12 000 r/min离心 10 min,将上清转入新的离心管中。③向
管中加入 1/4体积 5 mol/LNaAc, 0.7体积预冷的异丙醇 ,
-70 ℃放置 10min,混匀 , 11 000r/min离心 10min;弃上清 ,
用 70%乙醇洗涤沉淀 2 ～ 3次 ,吹干后加入 200 μl1 ×TE溶
解 。④向管中加入等体积的氯仿 -异戊醇(24∶1), 12 000
r/min离心 10min。 ⑤取上清 ,加入 1/10体积 3mol/LNaAc,
2倍体积预冷的异丙醇 , -70 ℃放置 10 min,混匀 , 12 000
r/min离心 3min;加入 4μlRNaseA, 37℃保温 30 min,除去
RNA。⑥回收 DNA沉淀 ,用 70%的乙醇洗涤 2 ～ 3次 ,吹干
后溶于 50μl1×TE中 , -20℃贮存。
1.3.2　CTAB法 2。 ①同 CTAB法 1。 ②加入等体积的 Tris
饱和酚温和摇匀 ,静置 1 min,在 4 ℃、12 000r/min条件下冷
冻高速离心 15 min,吸取上层清液。③加入等体积的苯酚 -
氯仿(1∶1)温和摇匀 ,静置 1min,在 4℃下冷冻。高速 12 000
r/min离心 15 min,取上层清液。④、⑤、⑥均同 CTAB法 1。
1.3.3　SDS法 1[ 4] 。①取 200 mg菘蓝叶片于预冷的研钵中
研磨至粉末状 ,加入 500 μl2%SDS抽提液 , 65 ℃水浴 40
min。②加入 150μl5mol/LKAc,混匀 , -70℃放置 10min。
③12 000 r/min离心 10 min,转移上清到另一离心管中 ,加入
2倍体积的无水乙醇 ,混匀 , -70 ℃沉淀 10 min。④12 000
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(17):8869-8870, 8885 责任编辑　马树梅　责任校对　况玲玲
r/min离心 10 min,回收基因组 DNA沉淀 ,用 70%乙醇洗涤 2
～ 3次 ,吹干后加入 200 μl的灭菌 1×TE溶解 DNA;加入 4
μl的 RNaseA, 37℃保温 30 min,除去 RNA。⑤加入等体积
的氯仿 -异戊醇(24∶1), 12 000 r/min离心 10 min;吸取上
清 ,加入 1/10体积 3 mol/LNaAc, 2倍体积预冷的异丙醇 ,
-70 ℃放置 10 min。⑥ 12 000 r/min离心 5 min,回收 DNA
沉淀 ,用 400μl70%乙醇洗 1次后 ,吹干 ,加入适量的灭菌 1
×TE溶解 DNA。
1.3.4　SDS法 2。 ①同 SDS法 1。 ②加入 500 μl氯仿 -异
戊醇(24∶1),混匀后 12 000 r/min离心 10 min;取上清 ,向其
中加入 3/5体积预冷的异丙醇 ,混匀 ,置于 -70 ℃沉淀 10
min。③12 000 r/min离心 5min,弃上清 ,用 70%乙醇洗涤 2
～ 3次 ,吹干后 200 μl×TE溶解 ,加入 4 μlRNaseA, 37℃保
温 30min,除去 RNA。 ④加入等体积的氯仿 -异戊醇(24
∶1), 12 000 r/min离心 10min。⑤、⑥同 SDS法 1。
1.3.5　碱裂解法 [ 5] 。①取 200 mg菘蓝叶片于预冷的研钵
中 ,加入 0.25 mol/LNaOH500 μl研磨至粉末状。②将粉末
转移至离心管中 ,置于沸水中煮沸 2 min,加入 0.25 mol/L
HCl50μl中和 ,再加入 0.5 mol/LTris-HCl(pH值为 8.0)50
μl,沸水浴 5min。③将离心管转移至 65 ℃水浴锅中预热 40
min。④、⑤、⑥同 SDS法 1。
1.4　总 DNA的定性 、定量检测　将提取的 DNA样品做适
当稀释后 ,分别测定 OD230 、OD260 、OD280 ,计算 OD260 /OD230、
OD260 /OD280以检验纯度 ,并根据 OD260计算 DNA浓度和提取
率。用 0.1%琼脂糖凝胶电泳做定性分析 。
DNA浓度(g/L)=OD260 ×50×稀释倍数 /1 000
DNA提取率(μg/g)=浓度 ×体积 /取材量(g)
1.5　PCR扩增及电泳检测　即 25 μl体系中含 1 ×bufer
2.5(不含 MgCl2 ), MgCl2 2.0 mmol/L、引物浓度为 0.76
μmol/L、dNTPs190 μmol/L、TaqDNA聚合酶 1.5 U。引物
为:ACACACACACACACACYT(ISSR引物 M61144)。扩
增程序为:95 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min, 52 ℃退火 1
min, 72℃延伸 2 min,共 39个循环;72 ℃延伸 5 min, 4 ℃保
温 。最后通过 1.8%琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物 ,在紫
外凝胶成像系统下观察成像。
2　结果与分析
2.1　不同方法提取的四倍体菘蓝基因组 DNA的浓度及提
取率比较　将不同方法提取的四倍体菘蓝基因组 DNA于紫
外分光光度计上进行浓度及纯度分析 ,结果如表 1所示。因
为高质量 DNA的 OD260 /OD280值为 1.8左右 , OD260 /OD230值
为 2.0左右 , 由表 1可知 , 5种方法结果差异较大 , CTAB法
1、CTAB法 2和 SDS法 2的 OD260 /OD280值接近 1.8 ,说明这
3种方法提取的 DNA中的蛋白质 、酚类等干扰物质较少 ,
DNA浓度较高 ,其中 CTAB法 2的浓度和提取率最高;但是
OD260 /OD230的值差别较大 , CTAB法 1和 SDS法 2均远小于
2,说明这 2种方法未能除去盐类和小分子杂质的干扰;SDS
法 1和碱裂解法的 OD260 /OD280值和 OD260 /OD230值与标准值
相比差异最大 ,可能原因是裂解不充分或纯化效率低;SDS
法 1的 OD260 /OD280值大于 2,说明 RNA未去除干净 , DNA浓
度也较低。综上所述 , CTAB法 2提取的四倍体菘蓝 DNA最
纯 ,浓度最大 ,颜色和形态正常。
表 1　不同方法提取 DNA的浓度及提取率
Table1　DNAconcentrationandextractionratewithdifferentmethods
处理
Treatment OD260 /OD230 OD260 /OD280
DNA浓度
μg/μl
DNAconcentration
DNA浓度差异显著性 LSD法
SignificantdiferencesinDNAconcentration
α=0.05 α=0.01
DNA提取率∥μg/g
DNAextraction
rate
DNA颜色和形态
Colorandmorphology
ofDNA
CTAB法 1 1.852 1.728 1.537 b B 256.111 白色丝状
CTAB法 2 2.311 1.774 1.748 a A 291.389 白色丝状
SDS法 1 1.495 2.129 0.675 d D 112.500 白色絮状
SDS法 2 1.647 1.754 0.930 c C 155.000 白色絮状
碱裂解法 0.781 1.376 0.473 e E 78.889 透明　　
2.2　琼脂糖凝胶电泳　由图 1可知:①CTAB法 1、CTAB法
2、SDS法 2提取的四倍体菘蓝基因组 DNA主带均比较明显 ,
注:1～ 3.CTAB法 1;4～ 6.CTAB法 2;7～ 9.SDS法 1;10～ 12.SDS
法 2;13～ 15.碱裂解法。
Note:1-3.CTABmethod1;4-6.CTABmethod2;7-9.SDSmethod
1;10-12.SDSmethod2;13-15.Alkalinelysismethod.
图 1　不同方法提取的四倍体菘蓝基因组DNA琼脂糖电泳图
Fig.1　AgaroseelectrophoresisoftetraploidIsatisgenomicDNA
withdifferentextractingmethods
且无明显的拖尾现象 ,说明所得的 DNA完整性均较好;SDS
法 1不太稳定 ,有拖尾现象;碱裂解法更不稳定 ,只有 1条微
弱条带 ,重复性差。②各种方法的点样孔均残留一些杂质 ,
其中 SDS法 1和碱裂解的点样孔最亮 ,说明该 DNA样品中
含有较多的未被去除的蛋白质 、RNA、多糖及一些其他次生
代谢产物。由于这些物质具有粘连特性 ,常与 DNA结合成
复合物 ,使得 DNA分子无法离开点样孔或电泳速度较慢。
相比较而言 , CTAB法 2的效果最好 ,点样孔基本无异物 ,且
重复性好。
　　将 CTAB法 2提取的四倍体菘蓝 DNA通过 PCR扩增
(ISSR引物为 M61144),电泳图谱如图 2所示。结果表明 ,通
过紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测 ,筛选出的 CTAB法 2
提取的DNA经PCR扩增 ,条带清晰 ,重复性好 ,所得 DNA
(下转第 8885页)
8870 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
果稳定性 、准确性和可靠性的重要条件。
表 4　SRAP引物的筛选
Table4　SelectionofSPARprimers
引物
Primers ME1 ME2 ME3 ME4 ME5 ME6
EM1 √ √ √
EM2 √
EM3
EM4 √ √
EM5 √ √
EM6 √ √ √
　注:“√”表示筛选出的引物组合;空白表示被淘汰的引物组合。
　Note:“√” standsforscreeningprimercombination;blankstandsforelim-
inatedprimercombination.
　　PCR反应首先要确定合适的退火温度。只有在退火温
度适宜的情况下 ,引物才能与模板上相应的位点结合 。该试
验中确定第 2次退火温度为 49 ℃。此外 ,还需要调节 PCR
反应中各成分的浓度以提高引物与模板的结合效率 ,提高
Taq酶活力。与模板浓度 、dNTPs浓度相比 , Mg2+浓度 、引物
浓度 、Taq酶用量对扩增结果的影响略微明显。通过单因素
水平的优化设计 ,得到了油茶 SRAP-PCR的最优反应体系
为:在 30 μl反应体系中 , Mg2+1.5 mmol/L,模板 DNA90 ng,
引物 0.21μmol/L, dNTPs110μmol/Ls, TaqDNA聚合酶 1.5
U,退火温度 49℃。为了验证程序的可行性 ,又用 1对引物
对部分样品进行扩增 ,也得到较好的扩增效果 ,从而为 SRAP
技术在油茶种质资源中的应用提供基础。
　　为了下一步工作的顺利开展 ,该研究还对 SRAP引物组
合进行了筛选。筛选出的引物扩增条带平均为 5.8个 ,多态
性条带最多有 8个。所以 ,该研究结果可以用于分析油茶的
遗传多样性 。
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(上接第 8870页)
图 2　ISSR扩增结果
Fig.2　ISSRamplificationresults
3　结论与讨论
高质量的基因组 DNA是进行各项分子操作的基础。在
提取基因组 DNA的过程中 ,多糖 、蛋白质及酚类等次生代谢
物的去除直接决定了 DNA的质量。提取植物 DNA的方法
很多 ,目前 ,主要采用 CTAB法和 SDS法来提取植物基因组
DNA, CTAB既能裂解细胞又能有效地沉淀多糖 ,适用于多糖
类含量较高的植物 ,且改良后效果更佳 。而 SDS适用于含酚
类较多的植物 [ 6] 。由该研究结果可知 , CTAB法比 SDS法更
适合四倍体菘蓝 DNA的提取。
　　研究中发现 , CTAB法 1提取的 DNA的 OD260 /OD280和
OD260 /OD230均偏低 ,说明纯化效果不好 ,蛋白质 、氨基酸等杂
质含量较高;在 CTAB法 2中加入 Tris饱和酚和苯酚氯仿 ,
离心的转数增加到 12 000 r/min,且离心时间和抽提次数增
加 , OD260 /OD280和 OD260 /OD230均趋于标准 ,提取纯度和产量
明显优于 CTAB法 1, DNA带整齐明亮 ,杂质少 ,点样孔内滞
留物质少 , PCR扩增条带清晰。SDS法和碱裂解法也可提取
到四倍体菘蓝 DNA,但效果和 CTAB法相比 DNA提取量少 ,
不能彻底去除蛋白质 、糖类等物质 ,其中 SDS法 2增加了抽
提次数 ,仍不能较好地提高 DNA的纯度和产量。另外 ,
CTAB法 2中均是冷冻离心 ,而其他方法都是常温 ,推测离心
温度对 DNA产量可能也有一定影响。
从 DNA纯度 、浓度 、完整性及 ISSR扩增结果来看 ,
CTAB法 2是提取四倍体菘蓝基因组 DNA的适宜方法 ,提取
样品的质量较高 ,完全能满足分子生物学试验对 DNA的质
量要求。
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