全 文 ：研究论文
木中槲皮素 、山奈酚和杨梅素含量的高效液相色谱法测定
游璐茜1 　吴 　振2 　赵玉芬＊1 , 2
(1 厦门大学化学化工学院;2 厦门大学医学院　厦门　361005)
国家自然科学基金青年基金面上项目(20805037)和国家自然科学基金重点项目(20732004)资助
2009-06-30收稿 , 2009-06-06接受
摘　要　建立了同时测定 木中槲皮素 、山奈酚和杨梅素含量的反相高效液相色谱测定方法 ,色谱柱为
UltimateTM XB-C18(150mm×4.6mm , 5μm),流动相是体积比为 32∶68 的乙腈 0.4%磷酸 , 淋洗速度 1.0mL min , 检
测波长 360nm , 对 3种样品的线性工作范围均为 0.072～ 2.16(μg)(R2=0.9999), 平均加样回收率(n=6)分别
为99.1%、97.0%和 97.9%,回收率测定标准偏差分别为 1.45%、1.38%和 2.04%。所建方法稳定可靠 ,可用
于 木的质量控制。
关键词　 木　槲皮素　山奈酚　杨梅素　反相高效液相色谱测定
Simultaneous Determination of Quercetin ,Kaempferol and Myricetin
in Loropetalum chinense(R.Brown)Oliv.by High
Performance Liquid Chromatography
You Luqian
1 , Wu Zhen2 , Zhao Yufen＊1 , 2
(1College of Chemistry and Chemical Engineering , Xiamen University;
2Medical College of Xiamen University , Xiamen University , Xiamen 361005)
Abstract　A method based on reversed phase high performance liquid chromatography was developed to simultaneously
determine the content of Quercetin , Kaempferol and Myricetin in the Loropetalum chinense(R .Brown)Oliv.UltimateTM
XB-C18(150mm×4.6mm , 5μm) column was used and eluted at 25 ℃ with a mobile phase of acetonitrile and 0.4%
phosphoric acid(32∶68 , v v)at a flow rate of 1.0 mL min.The calibration curves were constructed between peak area
measured at 360 nm and the injected quantity , giving a linear working rang of 0.072 ～ 2.16(μg)(R2=0.9999)for all the
three analytes.The spiked recoveries (n =6)were 99.1%, 97.0% and 97.9% with RSD of 1.45%, 1.38% and
2.04%, respectively.This method is considered to be stable , accurate , reproducible and suitable for quality control of
Loropetalum chinense(R .Brown)Oliv.
Keywords　Loropetalum chinense(R.Brown)Oliv., Quercetin , Kaempferol , Myricetin , RP-HPLC
木(Loropetalum chinense(R.Brown)Oliv .,表格中简写为 L .chinense)为金缕梅科金缕梅属植物 ,
收载于《中国药典》1977年版(一部)[ 1] ,以根 、叶和花入药 ,其中 , 木叶具有止血 、止泻 、止痛 、生肌的功
效 ,用于子宫出血 、腹泻 、烧伤和外伤出血的治疗。资源初步调查的结果表明 , 木在我国许多省市都有
大面积的种植 ,在皖 、苏 、浙 、赣 、湘 、鄂 、川 、黔 、闽 、粤 、桂 、滇都有着丰富的资源。而同属的红花 木
(Lorpetalum chinense (R.Br.)Oliv.var.rnbrum Yieh , 表格中简写为 L .chinense var.rubrum),也在这些
地区有着大量的野生资源 ,可见 木这一民间药材的开发潜力相当大 。
目前关于 木中有效成分的研究报道非常少 ,且仅限于 木花叶中的没食子酰黄酮甙和没食子丹
宁的报道[ 2]以及 木叶中槲皮素的含量测定[ 3] 。槲皮素(Quercetin)及其衍生物是植物界分布最广泛的
黄酮类化合物 ,是最强的抗癌剂之一 ,对肿瘤有化学预防和治疗双重作用 ,对多种致癌剂 、促癌剂有拮抗
作用 ,且可以抑制多类恶性肿瘤细胞的生长[ 4] 。然而 ,笔者在对 木中的有效成分进行分离鉴定后 ,发
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DOI :10.14159/j.cnki.0441-3776.2009.10.015
现 木中还含有另外两种黄酮类化合物-山奈酚(Kamepferol , 学名:4′, 5 , 7-二羟黄酮醇)和杨梅素
(Myricetin),以及其他一些多酚类化合物 。山奈酚有着逆转肿瘤细胞多药耐药作用 、对神经细胞的保护
作用以及对蛋白激酶的抑制作用等[ 4] ;而杨梅素则是能起到降血糖和对血小板活化因子拮抗的作
用[ 5 ,6] 。因此 ,仅仅测定 木中的槲皮素含量 ,并不能代表 木中黄酮的含量 ,也未能在开发 木这一民
间药用资源的过程中有效地进行质量控制。为此 ,本文采用了反相高效液相色谱(RP-HPLC),建立了
同时测定 木中槲皮素 、山奈酚和杨梅素含量的新方法 。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪(自动进样器 ,四元泵 ,柱温箱 , DAD检测器 ,Agilent Chemstation 数据处
理系统 ,Agilent公司 ,美国);UltimateTM XB-C18(150mm×4.6mm , 5μm)色谱柱;高速药物粉碎机 wk-600A
(上海新诺仪器设备有限公司 ,上海精胜仪器厂);电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9240A(上海精宏实验设备
有限公司);电热恒温水浴锅 HWS-12(上海一恒科技有限公司);电子天平(METTLER-TOLEDO仪器有限
公司 ,瑞士);3号筛(355μm , 50目 ,上海东方药品科技实业有限公司)。
木采于福建省三明市建宁县 。乙腈(色谱醇)购自美国Tedia公司 。甲醇(分析纯)为汕头市达濠
精细化学品有限公司出品 。磷酸(85%,分析纯)购于上海联合化工厂 。盐酸(36 ～ 38%,分析纯)为汕头市
西陇化工厂有限公司产品 。水为自制重蒸水。槲皮素(批号:100081-200406)、山奈酚(批号:110861-200808)
来自中国药品生物制品检定所。杨梅素自制 ,由NMR鉴定结构 ,HPLC分析后确定纯度大于98%。
1.2　色谱条件
色谱柱:UltimateTM XB-C18(150mm×4.6mm , 5μm);流动相:乙腈-0.4%磷酸水溶液(32∶68 ,体积
比);检测波长:360nm;流速:1.0mL min;柱温:25 ℃;进样量:10μL。
1.3　对照品溶液的制备
精密称取干燥的槲皮素 、山奈酚和杨梅素对照品各 14.4mg ,用甲醇配成浓度分别为 0.144mg mL和
0.0228mg mL 的溶液 ,并于 4℃保存。
1.4　供试品溶液的制备[ 3]
取 木叶 ,粉碎后过 3号筛 ,称取粉末 1.0g ,置 100mL 圆底烧瓶中 ,加入 80%甲醇 50mL ,称重;回流
提取 1h ,取出放冷 ,再称重 ,以 80%甲醇补足减失的重量 ,过滤;吸取滤液 25mL ,置 100mL 圆底烧瓶中 ,
加入 5%盐酸 10mL 及甲醇5mL ,回流 30min ,取出放冷 ,转移至 50mL 量瓶中 ,并用甲醇洗涤圆底烧瓶 3
次 ,每次约 3mL ,一并转移至量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀;过 0.45μm 微孔滤膜 ,即得。
2　实验结果
2.1　色谱分离效果
图1和图 2示出了在 1.2节所述色谱条件下的分离效果。
2.2　线性关系的考察
分别吸取浓度为 0.0228mg mL 的槲皮素 、山奈酚和杨梅素对照品溶液 2.5 、5 、10 、15 、20 、25 、75μL ,注
入液相色谱仪 ,测定其峰面积。以槲皮素 、山奈酚和杨梅素的进样量(μg)为横坐标 ,峰面积为纵坐标 ,
绘制标准曲线。回归方程分别为:
槲皮素:Y =2.82×103 X -1.99(R2 =0.9999)
山奈酚:Y =2.85×103 X +0.614(R2=0.9999)
杨梅素:Y =3.02×103 X -0.0866(R2=0.9999)
结果表明槲皮素 、山奈酚 、杨梅素在 0.072 ～ 2.16(μg)的范围内均具有良好的线性关系 。
2.3　精密度试验
分别精密吸取浓度为 0.0228mg mL 的槲皮素 、山奈酚和杨梅素对照品溶液各 10μL ,分别重复进样 6
次 ,峰面积的 RSD分别为 0.30%、0.27%和 0.36%,由以上数据表明本方法精密度良好。
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图 1　对照品槲皮素 、山奈酚和杨梅素的 HPLC 图谱
Fig.1　Chromatogram for reference substance of Quercetin , Kaempferol and Myricetin
1.杨梅素(Myricetin);2.槲皮素(Quercetin);3.山奈酚(Kaempferol)
图 2　 木叶提取样品的 HPLC图谱
Fig.2　chromatogram for the extract of Loropetalum chinense(R.Brown)Oliv.
1.杨梅素(Myricetin);2.槲皮素(Quercetin);3.山奈酚(Kaempferol)
2.4　重复性试验
取同一批 木叶 ,粉碎后过3号筛 ,精密称定药品粉末 6份 ,每份约 1.0 g ,按1.4节所示方法制备样
品溶液 ,进行槲皮素 、山奈酚和杨梅素的含量测定 。结果见表1 。
表 1　重复性试验结果
Tab.1　Results of the repeatability test
对照品 测出含量 %
1 2 3 4 5 6
平均含量 % RSD %
槲皮素 0.180 0.181 0.172 0.179 0.173 0.181 0.178 2.1
山奈酚 0.121 0.126 0.116 0.121 0.116 0.122 0.120 2.9
杨梅素 0.0110 0.0117 0.0113 0.0113 0.0111 0.0116 0.0113 2.2
由以上数据得出槲皮素 、山奈酚和杨梅素的 RSD分别为 2.1%、2.9%和 2.2%,表明本方法具有较
好的重复性。
2.5　稳定性试验
取同一批 木叶的供试品溶液 ,每隔1h 进样 1次 ,连续进样12次 ,每次10μL。结果表明 ,槲皮素和
山奈酚在 12h 内稳定 ,其峰面积的 RSD 分别为 0.29%, 0.84%。而杨梅素在 10h 内稳定 ,其峰面积的
RSD为 2.2%。
2.6　回收率试验
取已知含量(槲皮素 、山奈酚 、杨梅素的含量分别为 0.178%、0.120%、0.0113%)的 木叶 ,粉碎后
过3号筛 , 精密称定 6 份 ,每份约 0.5g , 置 100mL 圆底烧瓶中 , 分别精密加入槲皮素对照品溶液
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(0.144mg mL)1.89mL 2份 , 2.60mL 2 份 , 3.10mL 2 份;山奈酚对照品溶液(0.144mg mL)0.96mL 2 份 ,
1.10mL 2份 ,1.15mL 2份;杨梅素对照品溶液(0.144mg mL)0.16mL 2份 ,0.20mL 2份 ,0.24mL 2份 ,水浴
挥干 ,按 1.4节所述方法制备供试品溶液 ,按 1.2节所述色谱条件测定槲皮素 、山奈酚和杨梅素的含量 ,
计算回收率 ,结果(表2 ～ 表4)分别为:槲皮素的平均回收率为 99.1%,RSD=1.45%;山奈酚的平均回收
率为 97.0%,RSD=1.38%;杨梅素的平均回收率为 97.9%,RSD=2.04%。上述结果表明本方法可以满
足 木中 3个指标含量测定的要求。
表 2　槲皮素回收率试验结果
Tab.2　Resul ts of the Recovery Experiments of Quercetin
称取样品
g
样品中的量
mg
加入对照品
mg
总测得量
mg
回收率
%
平均回收
率 %
RSD
%
1
2
3
4
5
6
0.5004
0.5005
0.5116
0.5115
0.5010
0.4901
0.889
0.889
0.909
0.909
0.890
0.871
0.272
0.272
0.374
0.374
0.446
0.446
1.16
1.16
1.28
1.28
1.32
1.32
99.6
99.6
99.2
99.2
96.4
100.7
99.1 1.45
表 3　山奈酚回收率试验结果
Tab.3　Results of the Recovery Experiments of Kaempferol
称取样品
g
样品中的量
mg
加入对照品
mg
总测得量
mg
回收率
%
平均回收
率 %
RSD
%
1
2
3
4
5
6
0.5004
0.5005
0.5116
0.5115
0.5010
0.4901
0.603
0.603
0.616
0.616
0.603
0.590
0.138
0.138
0.158
0.158
0.166
0.166
0.734
0.738
0.771
0.771
0.762
0.751
94.9
97.8
98.1
98.1
95.8
97.0
97.0 1.38
表 4　杨梅素回收率试验结果
Tab.4　Results of the Recovery Experiments of Myricetin
称取样品
g
样品中的量
mg
加入对照品
mg
总测得量
mg
回收率
%
平均回收
率 %
RSD
%
1
2
3
4
5
6
0.5004
0.5005
0.5116
0.5115
0.5010
0.4901
0.0566
0.0567
0.0579
0.0579
0.0567
0.0555
0.0230
0.0230
0.0288
0.0288
0.0346
0.0346
0.0792
0.0792
0.0851
0.0868
0.0904
0.0898
98.3
97.8
94.4
100.3
97.4
98.1
97.9 2.04
2.7　样品测定
按拟定的含量测定方法测定了白花 木的树叶 、红花 木的树枝 、花朵中的槲皮素 、山奈酚和杨梅
素的含量 ,按外标法计算 ,结果见表 5。
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表 5　样品测定结果(n=3)
Tab.5　Results of the Samples Detection(n=3)
品种 提取部位 槲皮素的含量 %
槲皮素的
RSD %
山奈酚的
含量 %
山奈酚的
RSD %
杨梅素的
含量 %
杨梅素的
RSD %
白花 木 树叶 0.180 0.56 0.121 0.34 0.0112 1.05
红花 木 树枝 0.0347 0.17 0.0384 0.40 0.0199 0.87
花朵 0.125 2.02 0.0328 2.03 0.0487 0.43
3　讨论
3.1　色谱柱的选择
使用不同厂家生产的不同型号的色谱柱对 木样品溶液中槲皮素 、山奈酚和杨梅素等 3个成分的
分离效果表明 ,以 UltimateTM XB-C18(150mm×4.6mm , 5μm)色谱柱的分离效果最好 ,因此采用其来进行
测定 。
3.2　流动相的选择
采用酸性流动相 ,可有效提高柱效 ,减少槲皮素 、山奈酚和杨梅素的色谱峰拖尾 。因此实验中考察
了不同浓度的磷酸水溶液的分离效果 ,其中以 0.4%磷酸水溶液的分离效果最佳。同时 ,当“甲醇-水”体
系和“乙腈-水”体系流动相洗脱能力相差不大时 ,“甲醇-水”体系的泵压很大 ,而“乙腈-水”体系的泵压适
当。通过对不同体积比的分离效果的比较 ,发现以使用由乙腈∶0.4%磷酸=32∶68所组成的流动相的
分离效果最佳。
3.3　供试品溶液制备方法的选择
实验中对超声波萃取法 、冷浸法和回流提取法分别进行了考察 ,发现采用回流提取的方法能获得较
高的提取效率 ,并且提取出来的有效成分具有较好的线性关系 、稳定性和重复性 。随后比较了回流提取
时间为1 、2和 3h 时的提取效率 ,发现回流时间超过 1h时 ,3个成分的含量不再明显增加 ,故本实验选择
回流时间为 1h。实验还发现以 5%盐酸水解 30min效果最好 。综合考虑 ,最终确定用 80%甲醇回流提
取1h以及 5%盐酸水解 30min的方法来制备供试品溶液。
采用以上所考察的分离条件和供试品溶液制备方法测定了 木中槲皮素 、山奈酚和杨梅素的含量:
在重复性试验中 ,这 3种成分的 RSD分别为 2.1%、2.9%和 2.2%;在回收率试验中 ,这 3种成分的 RSD
分别为1.45%、1.38%和 2.04%。可见我们所采用的分离条件和样品溶液制备方法较为适合 ,并且能更
有效地对 木这一民间药用资源的开发进行质量控制 。
参 考 文 献
[ 1] 　国家药典委员会.中华人民共和国药典 , 1977:528～ 529.
[ 2] 　刘延泽 ,吴养洁 ,袁珂等.天然产物研究与开发 , 1997 , 9(3):12～ 18.
[ 3] 　李雪晶 ,高叶 ,周小江.湖南中医药大学学报 , 2008 , 28(2):46～ 50.
[ 4] 　张文志 ,周新 ,赵学增.中国误诊学杂志 , 2007 , 7(22):5219～ 5220.
[ 5] 　钟正贤 ,陈学芬 ,周桂芬等.中国现代应用药学杂志 , 2003 ,20(6):466～ 468.
[ 6] 　臧宝霞 ,金鸣 ,吴伟等.药学学报 ,2003 , 38(11):831～ 833.
游璐茜
1983年 10月生于福建漳州
2006年毕业于四川大学本科
现系厦门大学化学化工学院硕士生
从事天然药物化学方面的研究
Email:maggie-0-yuan@163.com
赵玉芬
1975年获美国纽约州立大学石溪分校化学博士
中国科学院院士 ,厦门大学医学院药学系主任
长期从事生命有机化学 、有机磷化学 、生命起源 、药
物化学 、化学生物学研究
Email:yfzhao@xmu.edu.cn
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