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宽叶菘蓝体细胞无性系根腐病抗性的RAPD初步分析



全 文 :(9):1375-1382.
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·栽培与育种·
宽叶菘蓝体细胞无性系根腐病
抗性的 RAPD初步分析
陈桂平 ,客绍英 ,陈玉芹
(唐山师范学院生命科学系 ,河北 唐山 063000)
  摘要 目的:初步鉴定宽叶菘蓝体细胞无性系植株的抗病突变体。方法:在一定浓度根腐病菌粗毒素的胁迫
下诱导抗性植株。选取同一个无性系植株及其亲本进行随机扩增多态性 DNA(RAPD)分析。结果:初步获得有抗
性的植株 , 12个引物获得较为清晰的扩增谱带。其中大部分引物扩增产物无差异 , 但也有少部分引物扩增产物有
差异。无性系植株的遗传背景一致性很好 ,但也发生了 DNA水平的变异。结论:本项结果可为进一步鉴定宽叶菘
蓝抗性突变体和分离抗病基因提供参考。
关键词 菘蓝;无性系;根腐病;随机扩增多态性 DNA
中图分类号:R282.2  文献标识码:A  文章编号:1001-4454(2009)03-0326-03
InitialRAPDAnalysisofIsatisindigoticaSomaticClones′ResistancetoRootRotDisease
CHENGui-ping, KEShao-ying, CHENYu-qin
(DepartmentofBiologyScience, TangshanTeachersColege, Tangshan063000, China)
Abstract Objective:TomakeinitialidentificationonIsatisIndigoticaSomaticClones′resistantmutant.Methods:Theresistant
plantswereselectedunderthetreatmentofroot-rotdiseasecrudetoxin.TheDNAofthesameclonesandtheirparentswereanalysedby
RAPDtechnology.Results:Wegotinitialresistanceoftheplantsandselected12 primersofwhichmostwereidenticalbuttheless
weredifferent.ThegeneticbackgroundofthesomaticcloneswasidenticalbuttheindividualsweremutatedontheDNAlevel.Conclu-
sion:Itprovidesexperimentalfoundationforfurtherstudyonseparatingresistantmutantandresistantgene.
Keywords IsatisindigoticaFortune.;Clones;Rootrotdisease;RAPD
收稿日期:2008-09-16基金项目:唐山市科技局资助项目(06234501A-9)作者简介:陈桂平(1972-),女,副教授 ,硕士 ,主要从事植物分子遗传学工作;Tel:0315-3863212, E-mail:chenguiping968@sohu.com。
  菘蓝是一种有重要开发前景的药用植物 〔1〕 ,近
年来 ,菘蓝在种植过程中常患根腐病 ,严重影响产量
和品质 。利用植物组织培养技术筛选抗病突变体 ,
一般采用将病原菌毒素加入培养基中作为选择因
子 ,正向筛选抗病细胞和植株 〔2〕。本文运用 RAPD
技术分析经一定浓度根腐病菌粗毒素处理的宽叶菘
蓝亲本及无性系植株的基因组 DNA,为进一步分离
抗性基因和培育抗病品种打下基础。
1  材料与方法
1.1 材料 挑选饱满的宽叶菘蓝种子 ,流水浸泡 3
h。在超净工作台上 ,无菌水冲洗 3 ~ 4次 , 70%乙醇
表面消毒 30s, 0.1%升汞消毒 6 ~ 12min,无菌水冲
洗 4次 ,接种于 1/2MS培养基 。 5 ~ 7 d幼苗长至 4
~ 5 cm时 ,切取下胚轴 ,转入继代培养基促芽;将幼
芽接入 MS培养基中留作亲本;21 d继代一次 , 4次
继代后壮苗 21 d,然后接入含有不同浓度根腐病粗
毒素的生根培养基 ,待植株出现差异后作为实验材
料。最后选取来自同一颗种子 ,经过 100个孢子 /
mL的孢子菌悬液侵染过的无性系 K13的苗(由第
13颗种子繁殖成的无性系)作 RAPD分析 。
1.2 试剂 TaqDNA聚合酶 、dNTPs、DNA标准分
子量均购自北京宝生生物有限公司;随机引物购自
·326· JournalofChineseMedicinalMaterials  第 32卷第 3期 2009年 3月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.03.001
北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;其它化学试
剂均为国产分析纯。
1.3  模板 DNA提取及浓度测定 菘蓝总 DNA提
取采用改良的 SDS微量提取法提取 DNA〔3〕。用紫
外分光光度计测定浓度并稀释成 50 ng/μL,用于
PCR扩增 。
1.4  RAPD扩增及电泳分析 DNA模板 2 μL,引
物 1 μL(0.4 mol/L), 10 ×PCRbufer2 μL, dNTPs
1.6μL(2.5 mmol/L), Taq酶 0.5 μL(1U), SD水
12.9μL。反应程序为 94℃预变性 5min;94℃变性
1 min, 34℃退火 1 min, 72℃延伸 1 min, 35个循环;
最后 72℃延伸 10 min。反应完成后取 10 μL扩增
样品进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳分析 ,在凝胶成像
系统(美国 Bio-Red公司)上观察并照相 。
2  结果与分析
2.1  实验植株长势 表 1为无性系 K13的亲本
(编号 1)及其系内的六棵苗(编号 2 ~ 7)的长势 ,从
强到弱依次为 2>1>5>6>3、4>7。
 表 1  根腐病粗毒素侵染过的无性系 K13七棵植株长势
编号 形态特征
1
植株健壮 , 苗高 7 ~ 8cm,叶多且叶片大 ,鲜绿色 , 根发黄长 1cm
2
植株健壮 , 苗高 10 ~ 12cm, 叶多且叶片大 , 鲜绿色 ,根系大长 4cm
3
植株高 5 ~ 6cm, 叶片深绿色 , 根部腐烂 ,根部茎段发紫 , 下部有枯叶 ,但上部健康
4
植株高 5 ~ 6cm, 叶片深绿色 , 根部腐烂 ,根部茎段发紫 , 下部有枯叶 ,但上部健康
5
植株健康 , 苗高 5 ~ 6cm,叶少但叶片大 ,颜色鲜绿 ,根部发达 , 根长 5厘米
6
植株健壮 , 苗高 4~ 5cm,叶多 ,叶片大小适中 , 绿色 ,根部发达 , 根长 4cm
7
亲本植株矮小 , 苗高 2 ~ 3cm, 叶少且叶片小 , 深绿色 , 没生根 ,培养基上有细菌污染
2.2  引物筛选 实验选取某一 DNA样品稀释至
50 ng/μL的模板 DNA,用 A系列的 20个引物对其
进行扩增 , 12个引物扩增产物有条带 ,详见表 2。
 表 2  RAPD分析所用随机引物编号和序列
引物编号 序列(5′-3′) 引物编号 序列(5′-3′)
A03 AGTCAGCCAC A10 GTGATCGCAG
A04 AATCGGGCTG A13 CAGCACCCAC
A05 AGGGGTCTTG A14 TCTGTGCTGG
A07 GAAACGGGTG A15 TTCCGAACCC
A08 GTGACGTAGG A18 AGGTGACCGT
A09 GGGTAACGCC A20 GTTGCGATCC
2.3  扩增结果的电泳检测 用以上 12个引物对
宽叶菘蓝无性系 K13七棵植株进行扩增 ,其中大部
分引物扩增后的条带一致 。图 1、图 2分别为随机
引物 A05和 A18扩增结果 ,图 1中的七个样品都在
300 bp到 500 bp之间扩增出四条带 ,图 2中亲本植
株与无性系植株都在 517 bp到 1 000 bp之间扩增
出两条主亮带 ,其他条带也一致。由此可见 ,无性系
内植株的遗传背景具有高度一致性。
图 1 随机引物 A05对 K13七个样品的扩增结果
1.亲本 2 ~ 7.无性系 K13的植株 M.Marker
图 2 随机引物 A18对 K13七个样品的扩增结果
1.亲本 2 ~ 7.无性系 K13的植株 M.Marker
  引物 A03、A04、A10对七个样品扩增后的条带
有差异 ,图 3是引物 A03对无性系 K13的扩增结
果:亲本植株与无性系植株在 230bp~ 517 bp间都
扩增出四条主亮带 ,其他扩增条带基本一致;有的扩
增条带表现出一定差异 ,如图所示 2、3、4、5号植株
比亲本及 6、7号在大约 1 800 bp处多出一条带 , 4、5
号植株比亲本及其他植株在大约 2 000bp处又多出
一条带。
图 3 随机引物 A03对宽叶菘蓝
K13七个样品的扩增结果
1.亲本 2 ~ 7.无性系 K13的植株 M.Marker
·327·JournalofChineseMedicinalMaterials  第 32卷第 3期 2009年 3月
  引物 A04对无性系 K13的扩增结果(图 4):亲
本植株与无性系植株在大约 400 bp以上都扩增出
了五条带 。 2、3号植株比亲本及其他植株在大约
600bp处少了一条带。
图 4 随机引物 A04对宽叶菘蓝
K13七个样品的扩增结果
1.亲本 2 ~ 7.无性系 K13的植株 M.Marker
3  讨论
本实验通过组织培养 ,经丛生芽途经建立了多
个宽叶菘蓝体细胞无性系 。在根腐病粗毒素的胁迫
下 ,正向筛选抗病植株 ,初步获得了具有表型抗性的
植株。以表型抗性植株为实验材料 ,利用 RAPD技
术对体细胞无性系进行分析 ,找出无性系植株与亲
本植株的差异条带 ,推断其与根腐病抗性的关系。
DNA样品的 RAPD检测结果表明:多数引物对
无性系 K13七棵植株的扩增条带没有差异说明同
一无性系植株的遗传基础相近 ,基因组 DNA有高度
的同源性;引物 A03、A04、A10对无性系 K13七棵
植株的扩增条带出现多态性 ,说明在继代过程中会
发生一定程度的 DNA水平的变异。这些差异条带
可能与根腐病的抗性有关。黄茶英等 〔4〕用 19个引
物检测 18棵刺槐组培移栽苗之间存在着体细胞无
性系变异 。Michael等 〔5〕利用 RAPD技术测出了葡
匐翦股颖无性系之间的差异;王晓丽等 〔6〕利用
RAPD标记进行杉木无性系的识别都说明 RAPD技
术能够成功检测出无性系的基因变异。孙光祖
等〔7〕利用 RAPD技术验证了小麦抗赤霉病突变体
选育 。因此 ,利用 RAPD技术筛选和鉴定抗病突变
体是一种有效的方法 ,但是真核生物 DNA分子大部
分是调节基因 、重复序列或内含子 ,能够表达的基因
序列很少 , 扩增量可能达不到检测的水平 , 所以
RAPD的多态性不直接等同于基因水平上的多态
性。这些差异带是否在基因内 ,是内含子 、还是一些
不表达的重复序列 ,与根腐病抗性是否有关 ,还有待
于进一步的研究。
参 考 文 献
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  2006年 《中药材 》杂志在 “中国知网 ”发行情况:《中药材 》期刊机构用户总计 2096
个 ,国际个人读者分布在 23个国家和地区。
·328· JournalofChineseMedicinalMaterials  第 32卷第 3期 2009年 3月