全 文 ：收稿日期:2014-09-22
作者简介:周婷(1990-) ，女，在读硕士研究生，主要从事中药活性物质基础研究;E-mail:jsnjjxzs@ 163. com。
* 通讯作者:谭晓斌，Tel:025-85608672，E-mail:njtxb@ hotmail. com。
HPLC法同时测定漏芦中 6 个成分含量
周 婷1，2，谭晓斌1，2* ，封 亮3，贾晓斌2，3
(1. 南京中医药大学，江苏 南京 210046;2. 南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028;3.
江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，江苏 南京 210028)
摘要 目的:建立 HPLC法同时测定漏芦中咖啡酸、甘草苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇的含量。方
法:采用 Agilent Zorbax SB-C18(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)色谱柱;流动相为甲醇-0. 04%磷酸，梯度洗脱;流速 1. 0
mL /min;检测波长 220 nm;柱温 30 ℃。结果:咖啡酸、甘草苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇分别在 0. 52 ～
104. 12 μg /mL、0. 51 ～ 101. 23 μg /mL、1. 01 ～ 201. 31 μg /mL、0. 52 ～ 103. 21 μg /mL、0. 51 ～ 100. 26 μg /mL、0. 52 ～
103. 67 μg /mL范围内与相应的峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率的 ＲSD分别为 0. 77%、1. 50%、0. 75%、
1. 82%、1. 89%、2. 02%。结论:该方法能准确、快速分析漏芦中 6 个活性成分，灵敏度高，重现性好，为质量评价奠
定了基础。
关键词 HPLC;咖啡酸;甘草苷;迷迭香酸;齐墩果酸;β-谷甾醇;豆甾醇
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)03-0544-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 03. 030
漏芦为菊科植物祁州漏芦 Ｒhaponticum uniflo-
rum (L. )DC. 的干燥根，味苦，性寒，归胃经，具有
清热解毒、消痈、下乳、舒筋通脉的功效〔1〕。漏芦含
有萜类、酚酸类、黄酮类、甾体类、噻吩类、挥发油等
多种成分〔2〕。现代药理研究表明其具有抗肿瘤、抗
氧化、抗衰老、改善记忆、抗炎镇痛等作用〔3〕。β-蜕
皮甾酮在漏芦中含量较高，中国药典记载该成分为
指标性成分〔1〕，功效主要为抗氧化和改善记忆。然
而漏芦中还有很多和功效密切相关的化学成分，况
且中药是多成分、多环节、多靶点的整体作用机制，
应该选择多个指标成分来评价漏芦的质量。因此，
本文采用咖啡酸、甘草苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷
甾醇、豆甾醇这 6 个药效较为显著的活性成分为评
价指标〔4，5〕，建立漏芦中 6 个活性成分的 HPLC测定
方法，以期为漏芦的质量控制和物质基础研究提供
参考依据。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 Agilent HP1260 高效液相色谱仪(包括
四元泵，自动进样器，DAD 检测器，美国 Agilent 公
司);KQ5200 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有
限公司) ;AG135 万分之一分析天平(瑞士梅特勒-
托利多公司)。
1. 2 材料 对照品:咖啡酸 (批号:110885-
200102)、迷迭香酸(批号:110839-200403)、齐墩果
酸(批号:110709-200505)购自中国食品药品检定研
究院;甘草苷(批号:MUST-13020901)、β-谷甾醇(批
号:MUST-13101515 )、豆 甾 醇 (批 号:MUST-
13060501)购自成都曼思特生物科技有限公司。实
验用漏芦药材(批号:13060701、131001、140301，产
地为河北)购自河北安国市万联中药饮片有限公
司，经南京中医药大学吴德康教授鉴定为菊科植物
祁州漏芦 Ｒhaponticum uniflorum(L. )DC. 的干燥
根。甲醇、乙腈(TEDIA，色谱纯) ，水为超纯水，其他
试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(250
mm × 4. 6 mm，5 μm);流动相:甲醇(A)-0. 04%磷
酸(B) ，梯度洗脱(0 ～ 5 min，15% A;5 ～ 15 min，
15% ～ 28% A;15 ～ 30 min，28% A;30 ～ 35 min，
28% ～ 43% A;35 ～ 50 min，43% A;50 ～ 75 min，
43% ～ 100% A);流速:1. 0 mL /min;检测波长:220
nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。在此条件下 6 个活
性成分均达到基线分离，HPLC图见图 1。
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 对照品溶液:精密称取对照品咖啡酸 1. 04
mg、甘草苷 1. 01 mg、迷迭香酸 2. 02 mg、齐墩果酸
1. 03 mg、β-谷甾醇 1. 01 mg 、豆甾醇 1. 03 mg，置于
10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，备
用。
2. 2. 2 供试品溶液:称取漏芦样品粉末(过三号
筛)约 1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入
30%甲醇 20 mL，密塞，称定重量，加热回流提取 1
h，放冷，再称重，用 30%甲醇补足减失的重量，摇
匀，滤液经 0. 45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，备用。
·445· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 3 期 2015 年 3 月
图 1 混合对照品(A)和漏芦样品(B)的 HPLC图
1. 咖啡酸 2. 甘草苷 3. 迷迭香酸 4. 齐墩果酸 5. β-
谷甾醇 6. 豆甾醇
2. 3 线性关系考察 精密量取“2. 2. 1”项下对照
品溶液 0. 05、0. 1、1、2、5 mL 分别置于 10 mL 量瓶
中，用甲醇分别稀释定容，摇匀，与对照品储备液组
成系列对照品溶液。按照“2. 1”项下色谱条件进样
20 μL，以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为
纵坐标，绘制标准曲线，得 6 个成分的回归方程、相
关系数及线性范围，见表 1。
2. 4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液(咖
啡酸、甘草苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾
醇质量浓度分别为 10. 41、10. 12、20. 23、10. 32、
10. 13、10. 37 μg /mL)20 μL，按“2. 1”项下色谱条件
连续进样 6 次，测定其峰面积，计算咖啡酸、甘草苷、
表 1 漏芦样品中 6 个活性成分的线性关系
化学成分 回归方程 r 线性范围
/
(μg /mL)
咖啡酸 Y = 98. 37X + 13. 53 0. 9996 0. 52 ～ 104. 12
甘草苷 Y = 53. 78X + 20. 23 0. 9991 0. 51 ～ 101. 23
迷迭香酸 Y = 29. 38X － 13. 85 0. 9992 1. 01 ～ 201. 31
齐墩果酸 Y = 29. 33X － 10. 31 0. 9995 0. 52 ～ 103. 21
β-谷甾醇 Y = 43. 92X － 13. 20 0. 9993 0. 51 ～ 100. 26
豆甾醇 Y = 23. 83X － 9. 49 0. 9994 0. 52 ～ 103. 67
迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇峰面积的
ＲSD 分 别 为 1. 35%、1. 81%、1. 05%、2. 12%、
1. 98%、1. 94%，表明仪器精密度良好。
2. 5 稳定性试验 精密称取漏芦样品(批号:
13060701)，按“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，
于 0、2、4、6、8、10、12 h 分别进样 20 μL，计算咖啡
酸、甘草苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇
峰面积的 ＲSD 分别为 1. 16%、1. 31%、1. 96%、
1. 95%、1. 34%、1. 62%，表明供试品溶液在 12 h 内
稳定。
2. 6 重复性试验 精密称取漏芦样品(批号:
13060701)6 份，按“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶
液。每份精密吸取 20 μL进样测定，计算咖啡酸、甘
草苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇含量平
均值(n = 6)分别为 287. 26、472. 80、1 045. 81、664. 42、
535. 66、381. 58 μg /g;ＲSD 分别为 2. 45%、1. 35%、
1. 53%、1. 71%、1. 60%、1. 82%，表明该方法重复性
良好。
2. 7 加样回收率测定 称取 9 份已知含量的漏芦
样品(批号:13060701)约 1 g，精密称定，分别精密
加入咖啡酸、甘草苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾
醇、豆甾醇对照品适量，设置低、中、高 3 个浓度，各
平行 3 次，按“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，精
密吸取 20 μL进样测定，计算咖啡酸、甘草苷、迷迭
香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇的平均加样回收
率(n = 9)分别为 99. 38%、99. 63%、99. 46%、
100. 46%、100. 90%、99. 78%，ＲSD 分别为 0. 77%、
1. 50%、0. 75%、1. 82%、1. 89%、2. 02%，结果见表 2。
表 2 漏芦样品中 6 个活性成分的加样回收率
化学成分 取样量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均值 /% ＲSD /%
咖啡酸 1 0. 2896 0. 2317 0. 5211 99. 90 99. 38 0. 77
2 0. 2879 0. 2303 0. 5170 99. 49
3 0. 2894 0. 2316 0. 5225 100. 66
4 0. 2882 0. 2801 0. 5681 99. 94
5 0. 2880 0. 2802 0. 5678 99. 86
6 0. 2883 0. 2803 0. 5650 98. 69
·545·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 3 期 2015 年 3 月
续表 2
化学成分 取样量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均值 /% ＲSD /%
7 0. 2885 0. 3462 0. 6295 98. 49
8 0. 2901 0. 3481 0. 6330 98. 52
9 0. 2888 0. 3465 0. 6315 98. 92
甘草苷 1 0. 4767 0. 3813 0. 8576 99. 90 99. 63 1. 50
2 0. 4738 0. 3790 0. 8539 100. 28
3 0. 4764 0. 3811 0. 8603 100. 74
4 0. 4743 0. 4701 0. 9519 101. 59
5 0. 4740 0. 4702 0. 9431 99. 77
6 0. 4745 0. 4713 0. 9454 99. 89
7 0. 4748 0. 5698 1. 0280 97. 08
8 0. 4774 0. 5729 1. 0512 100. 15
9 0. 4753 0. 5703 1. 0299 97. 25
迷迭香酸 1 1. 0544 0. 8435 1. 8858 98. 57 99. 46 0. 75
2 1. 0480 0. 8384 1. 8925 100. 73
3 1. 0538 0. 8430 1. 8839 98. 47
4 1. 0492 1. 0489 2. 0945 99. 66
5 1. 0484 1. 0487 2. 0899 99. 31
6 1. 0497 1. 0491 2. 0940 99. 55
7 1. 0503 1. 2604 2. 3134 100. 21
8 1. 0561 1. 2673 2. 3083 98. 81
9 1. 0512 1. 2615 2. 3100 99. 79
齐墩果酸 1 0. 4000 0. 3200 0. 7274 102. 31 100. 46 1. 82
2 0. 3976 0. 3181 0. 7150 99. 81
3 0. 3998 0. 3198 0. 7187 99. 72
4 0. 3980 0. 3912 0. 8000 102. 76
5 0. 3977 0. 3909 0. 7886 100. 00
6 0. 3982 0. 3923 0. 7791 97. 10
7 0. 3984 0. 4781 0. 8829 101. 33
8 0. 4006 0. 4808 0. 8914 102. 09
9 0. 3988 0. 4786 0. 8728 99. 04
β-谷甾醇 1 0. 3847 0. 3078 0. 6938 100. 43 100. 90 1. 89
2 0. 3824 0. 3059 0. 6883 100. 00
3 0. 3845 0. 3076 0. 6875 98. 52
4 0. 3828 0. 3812 0. 7642 100. 04
5 0. 3825 0. 3809 0. 7602 99. 15
6 0. 3830 0. 3823 0. 7657 100. 11
7 0. 3832 0. 4599 0. 8573 103. 10
8 0. 3853 0. 4624 0. 8653 103. 81
9 0. 3836 0. 4603 0. 8574 102. 94
豆甾醇 1 0. 5401 0. 4320 0. 9735 100. 32 99. 78 2. 02
2 0. 5368 0. 4294 0. 9633 99. 33
3 0. 5397 0. 4318 0. 9703 99. 71
4 0. 5374 0. 5312 1. 0595 98. 29
5 0. 5370 0. 5309 1. 0539 97. 36
6 0. 5376 0. 5323 1. 0892 103. 62
7 0. 5380 0. 6456 1. 1741 98. 55
8 0. 5409 0. 6491 1. 1804 98. 53
9 0. 5384 0. 6461 1. 1994 102. 29
·645· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 3 期 2015 年 3 月
2. 8 样品含量测定 取 3 份不同编号的漏芦样品
粉末 1 g，精密称定，按“2. 2. 2”项下方法平行制备
供试品溶液 3 份，精密吸取“2. 2. 1”项下制备的对
照品溶液 20 μL，各供试品溶液 20 μL，按“2. 1”项下
色谱条件进行测定，并计算各样品中咖啡酸、甘草
苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇的含量，
结果见表 3。
表 3 漏芦样品中 6 个活性成分的含量测定结果(μg /g，n =3)
编号 咖啡酸 甘草苷 迷迭香酸 齐墩果酸 β-谷甾醇 豆甾醇
13060701 282. 38 425. 92 1377. 55 705. 24 377. 42 554. 40
ＲSD /% 1. 95 1. 76 1. 05 1. 45 1. 43 1. 69
131001 243. 91 365. 63 1178. 52 535. 63 351. 37 493. 30
ＲSD /% 1. 24 1. 45 2. 04 1. 75 1. 03 2. 02
140301 224. 51 334. 10 1005. 33 503. 73 296. 36 422. 10
ＲSD /% 1. 57 1. 29 2. 00 1. 62 1. 61 1. 26
3 讨论
选择甲醇-0. 04%磷酸系统作为流动相，6 个活
性成分的分离效果、基线稳定性、峰形较为理想。实
验中还比较了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0. 1%磷酸、甲
醇-0. 1%磷酸等流动相体系，并调整梯度洗脱的比
例，经多次试验表明，使用甲醇-水和乙腈-水系统进
行洗脱，各峰的对称性和分离度比较差;以乙腈-
0. 1% 磷酸系统为流动相进行洗脱，被分析物的色
谱峰分离度不能满足要求;使用甲醇-0. 1%磷酸系
统进行洗脱，色谱峰的基线漂移，最后选定甲醇-
0. 04%磷酸溶液系统。
选择 220 nm作为检测波长，检测的各色谱峰分
离度及峰形均佳，灵敏度也较高。齐墩果酸、β-谷甾
醇、豆甾醇在 210 nm 处有最大吸收波长，甘草苷在
275 nm 处有最大吸收波长，迷迭香酸和咖啡酸在
330 nm处有最大吸收波长;实验过程中选择了 210、
220、250、275、330 nm 5 个波长，最后选定较合适的
220 nm。
选择 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，分析时间较
短，分离度较好。实验中还比较了 PlatisilTM ODS-C18
(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)和 Chrom-Matrix XB-C18
(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)两者均展现了较好的分
离效果，但出于减少分析时间和分离度等方面的考
虑，最终选用了 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱。
选择和漏芦药效密切相关的 6 个活性成分(咖
啡酸、甘草苷、迷迭香酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾
醇)进行含量测定和分析，为漏芦物质基础研究提
供了方法和参考。
参 考 文 献
［1］国家药典委员会 . 中华人民共和国药典［S］．一部 . 北
京:中国医药科技出版社，2010:348.
［2］ Zhang XP，Zhang J，Dong M，et al. Constituents of plants
from the genus Ｒhaponticum［J］． Chem Biodivers，2010，7:
594-560.
［3］包小妹，罗素琴 . 祁州漏芦化学成分和药理学研究进展
［J］．亚太传统医药，2011，7(9):176-177.
［4］ Wang J，Gu SS，Pang N，et al. Alkyl caffeates improve the
antioxidant activity，antitumor property and oxidation stabil-
ity of edible oil［J］． Plos One，2014，9(4) :959.
［5］ Liu H，Schmitz JC，Wei J，et al. Clove extract inhibits tumor
growth and promotes cell cycle arrest and apoptosis［J］．
Oncol Ｒes，2014，21(5) :247-259.
·745·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 3 期 2015 年 3 月