全 文 ： 科技之窗
血清药漏芦对 ox-LDL诱导 U937细胞形成泡沫细胞过程
中 PPARγ表达的影响*
柴欣楼　王　伟　张永生　王　谦
　柴欣楼 ,女 , 31岁 ,在读医学博士生
*国家自然科学基金资助项目(No.39970907)
(北京中医药大学　北京 100029)
摘要:目的　观察血清药漏芦对 ox-LDL诱导 U937细胞形成泡沫细胞过程中 PPARγ表达的影响。
方法　用 ox-LDL与 U937细胞孵育造成泡沫细胞模型 ,采用免疫组织化学染色方法观察 PPARγ的
表达情况。结果　光镜下 ,正常对照组细胞内无明显棕染颗粒 ,模型组棕色颗粒粗大 ,见于胞膜和
胞浆中;用药组棕色颗粒色浅 ,且数量明显少于模型组 。结论　血清药漏芦能抑制 ox-LDL诱导
U937细胞形成泡沫细胞过程中 PPARγ的表达。
关键词:血清药漏芦;泡沫细胞;过氧化物酶体增生物激活受体;氧化低密度脂蛋白;U937细胞系
中图分类号:R285.5
　　漏芦为菊科植物 Rhapon ticumun iflorum (L. )
DC的干燥根 ,是较为常用的中药 ,广泛分布于我
国华北 、东北和西北诸省 ,其功效为清热解毒 、排
脓消肿 、通乳等 。主要用于治疗乳汁不通 、痈疮
肿痛 、乳腺炎 、淋巴结核 、痔漏 。目前研究认为漏
芦含有丰富的植物蜕皮激素以及黄酮 、噻吩等化
合物 ,具有明显的抗动脉粥样硬化 、抗氧化和免
疫促进作用 ,在防治心血管疾病方面具有潜力 ,
但其作用机制不甚明确 。
单核 /巨噬细胞摄取脂质主要通过受体途径 ,包
括清道夫受体 。清道夫受体 (Scavenge r Receptor,
SR)分 A、B 2型 ,即 SR-A和 SR-B ,此 2型受体分布
于巨噬细胞膜上 ,均可结合并内化 ox-LDL[ 4] , CD36
是另一个 SR-B亚型 ,它可与氧化低密度脂蛋白结
合 ,与泡沫细胞的形成密切相关 。
PPARγ最先被定义为调节脂肪细胞特定基因
表达和诱导前脂细胞分化的转录因子 。目前认为
PPARγ在心血管保护 、炎症形成的抑制 、胰岛素抵
抗的治疗 、肿瘤生长的控制中起关键作用。 PPARγ
被来自 ox-LDL的配基激活后促进巨噬 /泡沫细胞的
形成 ,从而促进 AS的进程。
本实验以 ox-LDL诱导的 U 937细胞形成的
泡沫细胞为实验模型 ,观察血清药漏芦对 ox-LDL
诱导 U937细胞形成泡沫细胞过 程中 CD 36 、
PPARγ表达的影响 。
1　材料与方法
1.1　试剂和仪器
U937细胞株由协和医科大学病理室提供 ,
RPM I- 1640培养基购自 G IBCO公司 , CFBS购
自 Cyclone公司 ,双缩脲试剂盒 、MDA试剂盒购
自南京建成生物工程研究所 , JA1003电子天平 、
722型分光光度计 、BDFACS G LIBUR流式仪 、低
密度离心机 、免疫组化专用载玻片购自博士德公
司 。一抗购自 San ta C ru z公司 。
1. 2　氧化型低密度脂蛋白制备
低密度脂蛋白购自协和医科大学生化室 ,浓度
为 1 g /L,将 LDL置于含 10 μmo l /L CuSO4的 PBS
中的 37 ℃透析 24 h后 , 0. 25 μm微孔滤膜过滤除
菌备用 ,用硫代巴比妥酸反应物质含量来鉴定 LDL
的修饰程度。以四乙氧基丙烷为标准品 ,用每毫克
LDL蛋白中丙二醛的含量表示 ,按说明书操作 ,测得
新鲜 LDL的丙二醛为 2. 2μmo l /g,经 CuSO 4处理的
LDL即 ox-LDL的丙二醛含量为 37. 22 μmol /g。
1.3　药物制备
通过水提法对祁州漏芦进行粗提。提取物与峰
蜜按 1∶1比例制成蜜丸备用 。血清药制备 15 kg纯
种彼格犬正常饮食预适应 1周 ,空腹 24 h后 ,漏芦
水提物蜜丸 10 g灌胃 ,无菌取给药前 、给药后 20 m in
血清各 10 mL, 注意抗凝 , 静止 0. 5 h后 37 ℃
3 000 r /m in,离心 10 ～ 15 m in,取血清 56 ℃, 0. 5 h
41
第 28卷第 5期 2005年 9月
Vo.l 28 No. 5 Sep. 2005
　 　 北京中医药大学学报
Journal o f Be ijing Unive rsity o f T raditiona l Chine seM edic ine
灭活分装 ,置 -30℃冰箱保存 , 1个月内使用。
1.4　U937细胞的培养及分组
U937细胞常规法培养 。取对数生长期细
胞 ,离心 , PBS液洗涤 2次 , 用含 10%CFBS的
RPM I-1640培养液配成细胞密度 1×106 L - 1左右
细胞悬液 , 24孔培养板 ,每孔加入细胞悬液 1 000
μL,继续培养 24 h后 ,去培养液 , 按组别分别加
入各种培养液:正常对照组加入 10%CFBS的
RPM I-1640培养基 ,无血清培养组加入无血清的
RPM I-1640培养基 ,模型组培养液中含 100 m g /L
的 ox-LDL无血清 RPM I-1640培养基 , 5%、 10%、
15%、30%犬血清组加入含不同浓度犬血清的无
血清 RPM I-1640培养基 。各组均设 6个重复孔 ,
于 37 ℃含 5%CO 2和 95%空气的培养箱中培养 ,
24 h后检测 。
1.5　经 ox-LDL处理的 U937细胞 CD36表达用流式
细胞仪测定
将上述经 ox-LDL处理的 U937细胞收集低速
离心弃上清 ,加入 PBS 5mL制成悬液 ,漂洗 2次 ,弃
上清后加入 FITC -CD 36 10 μL,避光 30 m in后 ,于
流式细胞仪检测 。
1.6　PPARγ的免疫组织化学染色方法
将上述各组 U937细胞收集 , 3 000 r /m in离心
5 ～ 10 m in,弃上清 ,加入 PBS 5 mL制成悬液 ,漂洗
2 ～ 3次 ,弃上清后制成悬液 ,涂于备好的免疫组化
专用载玻片上。
免疫组织化学染色方法:①3%过氧化氢阻断反应
15m in;②PBS冲洗 10 m in;③10%山羊血清预孵育
10m in;④加一抗:倾去山羊血清 ,不要冲洗 ,直接加一
抗。一抗为 200∶1稀释 ,在湿盒中 ,冰箱 4 ℃环境 12 h
孵育;⑤PBS冲洗 3次 ,每次 3m in;⑥滴加 1∶200稀释
的生物素标记二抗(1%BSA -PBS稀释),室温 30m in;
⑦PBS冲洗 ,每次 3m in;⑧滴加 1∶200稀释的辣根酶标
记链霉卵白素 (PBS稀释), 37 ℃温箱环境 60 m in;
⑨PBS冲洗 3次 ,每次 3m in;⑩DAB显色:使用 DAB显
色试剂盒 , 1mL双蒸水加显色剂 A、B、C各 1滴 ,加至
标本上 ,显微镜下观察 ,显色后立即终止反应;○1苏木
素复染;○12常规脱水透明 ,树胶封片。
1.7　统计学处理
CD36表达情况用 –x±s表示 ,多组比较用单因素
方差分析。
2　结果
2.1　不同浓度 ox-LDL诱导 U937表面 CD36表达情况
结果见表 1。
表 1　血清药漏芦对 ox-LDL诱导 U937表面
CD36表达的影响(n =6, –x±s)
组别 CD36正常组 22. 02±0. 18**
无血清组 24. 42±1. 28**
模型组 79. 65±3. 60
5%犬血清组 68. 05±3. 02*
10%犬血清组 59. 04±2. 80*
15%犬血清组 49. 17±2. 27*
30%犬血清组 63. 12±3. 76*
　　注:与模型组比较*P <0. 05, **P <0. 01
2.2　细胞形态学改变
光镜下 ,正常对照组棕色颗粒粗大 ,见于胞膜和
胞浆中 ,无血清培养组棕色颗粒较大 ,散见于胞膜和
胞浆中 ,而 15%的犬血清组棕色颗粒色浅 ,且数量
明显少于对照组。
3　讨论
漏芦由多种化学成分组成并具有不同的药理作
用。目前认为:正常情况下 ,血中的 LDL与肝细胞
膜的 LDL受体相结合 ,通过胞饮入肝细胞 ,肝细胞
内 LDL -胆固醇的积聚可使 LDL受体下调 ,这是由
于单核 /巨噬细胞摄取 LDL受体的活性受细胞内胆
固醇浓度的反馈调节 ,因而细胞外 LDL水平增加并
不能引起细胞内胆固醇含量增加。特异的 LDL受
体能够识别 A poB上的赖氨酸 、精氨酸及组氨酸残
基构成的正电荷区域。当血管壁受损时 , LDL可以
直接迁入动脉壁 ,该过程呈 LDL依赖性且无需受体
介导 。在受损的动脉内膜处 ,巨噬细胞 、内皮细胞 、
平滑肌细胞有很强的氧化能力 ,加快迁入动脉壁的
LDL中脂质被氧化 ,蛋白被修饰 , LDL的赖氨酸残基
被氧化修饰后会导致 LDL负电荷的增加 ,并且理化
特性发生了很大的变化 , LDL颗粒变细 ,表面的蛋白
分子折叠 、断裂 ,载脂蛋白 B变构形成新的抗原决
定簇 ,这种经修饰的 LDL不被 LDL受体识别 ,却可
被清道夫受体所识别 、摄取 ,且不受细胞内胆固醇的
反馈抑制 ,结果细胞内大量脂质聚集形成泡沫细胞。
同时 , ox-LDL可释放大量的细胞因子使大量单核细
胞趋化到受损的内皮处 ,形成恶性循环 。
CD 36是清道夫受体 B I(SR-BI)的成员 ,主要在
单核细胞 /巨噬细胞 、血小板 、微血管内皮细胞等上
表达 ,其配体包括 ox-LDL、多聚阴离子磷脂 、凋亡细
胞等 。 CD36抗原在与肿瘤坏死因子激活的内皮细胞
相互作用后表达明显增加 ,单核细胞向巨噬细胞分
化时 CD36抗原的表达也增加 。巨噬细胞集落刺激
因子和白细胞介素 -4也可使单核细胞表达 CD36抗
原增加 , γ-干扰素和脂多糖能下调 CD36抗原的表
42 北京中医药大学学报　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　第 28卷
达 。 CD36是 ox-LDL的主要受体的原因是:大部分人
的成熟巨噬细胞都表达 CD36;CD36表达在受损的巨
噬细胞上 ,该巨噬细胞存在于 AS深层及其周围 AS
残渣上;从对 CD 36缺乏的病人的研究结果中得出
CD36在泡沫细胞的形成中具有重要作用 。
ox-LDL的组成部分亚麻酸的氧化代谢产物 9-
HODE, 13-HODE均是 PPARγ的天然配体 ,可以活化
PPARγ依赖性的转录活动。而巨噬细胞的分化抗原
CD36被认为是清道夫受体 B型 , CD36基因是 PPARγ的
目标基因 ,因为在 CD36基因启动子上有一个类似的
DR1序列 AAGTCA -G -AGGCCA ,经过嵌合基因表达
证实了 PPARγ可以活化 CD36的转录。研究表明[ 1, 2] ,
PPARγ和其配基 RXR共同处理 THP-1及原代外周单
核细胞后 ,导致细胞形态的改变 ,表明单核细胞分化的
细胞表面标志物的表达增加。总之 , ox-LDL颗粒中特
异成分能结合和激活 PPARγ,而用 PPARγ处理 THP-1
细胞可诱导 CD36的表达。由此得出 ox-LDL—
PPARγ—CD36调节环路的假说。该假说解释了 AS病
变区的泡沫细胞中 PPARγ的高峰度表达 ,并解释了本
实验模型组中 PPARγ高表达的原因。
目前现有的和新的治疗 AS的方法很多 ,包括
药物 、疫苗 、基因治疗 ,这些方法可通过改变吸收 、转
运 、代谢等不同环节过程 ,预防氧化 ,抑制血管局部
的炎性反应 ,达到治疗 AS的目的。其中 PPAR激活
剂是一类新型的治疗 AS的药物 。 PPARγ已知是调
节脂代谢基因的表达 ,并且已证明能抑制炎性细胞
因子的产生[ 3] ,这种作用被认为可以阻抑 AS的发
病。由于 PPARγ的活化 ,能抑制单核细胞分泌 IL-
1β , IL-6和 TNFα等 ,同时阻断 AP-1, NF-κB信号通
路 ,从而导致 SR-A的表达减少及因 NF-κB的抑细
胞凋亡作用阻断 ,从而促进巨噬细胞的凋亡 ,即阻抑
AS的发病。这解释了本实验用药组为何效果不明
显。其最终结果也许取决于在巨噬细胞中哪一条通
路的活化占优势 ,这些均有待于在体内 、体外粥样斑
块中进行进一步研究探讨。
参　考　文　献
1　Nagy L, Ton tono z P, A lvarez JGA, e t a.l Oxidized LDLregu-
lates m acrophage gene ex re ssion th rough ligand activ ation of
PPARγ. C ell, 1998, 93:229 ～ 240
2　Tontnoz p, N agy L, A lvarez JGA, e t a.l PPARγp rom o te s moo-
cy te /m acrophage diffe rentia tion and uptake o f oxidized LDL.
Ce ll, 1998, 93:241～ 252
3　Pasce ri V,W uHD,W ille rson JT, e t a .l M odu lation of vascu-
lar inflamm a tion in vitro and in vivo by perox isom e pro life ra-
tor - ac tivated receptor - gamma activa to rs. Circulation ,
2000, 101:235 ～ 238
(收稿日期:2005-03-05)
Effect of serum ofRhapon ticum un iflorum on PPARγexpression in
formation of foam cell of U937 cells induced by ox-LDL
Cha iX inlou(柴欣楼 ),W angW ei(王　伟 ), Zhang Yongsheng(张永生), et a.l
(Be ijing University of TraditionalCh ineseM ed icine, Beijing 100029)
Abstract:Objective　To observe the effect of serum o fRhaponticum un iflorum on PPARγexpression in for-
ma tion of foam cell of U937 ce lls induced by ox id ized low-density lipoprote in (ox-LDL). M ethod　U937 cells
w ere stimu lated by ox-LDL to establish themode l of foam ce l.l The exp ression o f PPARγwas observed by immuno-
h istochem ica l stain. Result　By the lightm icroscope no brown g ranules we re observed in foam cells o f the morma l
group.M any thick brown granu lesw ere observed in ce llmembrane and cy toplasma in themodel g roup, while only a
few light brow n g ranulesw ere obse rved in themode l group. Conclusion　The serum of Rhapon ticum uniflo rum can
inh ib it PPARγexp ression in the forma tion of foam cell o fU937 ce lls induced by ox-LDL.
KeyW ords:serum o fRhapon ticum un iflorum;foam ce ll;PPARγ;low - density lipoprote in;U937 ce lls
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