全 文 ：2005 年 7 月第 12 卷第 7 期 中国中医药信息杂志 ·35·
血清药漏芦对 oxLDL 诱导 U937 细胞表面
CD36 表达的影响
柴欣楼 1,王 伟 1,王 谦 1,张永生 2
(1.北京中医药大学,北京 100029；2.北京中医药大学东方医院,北京 100078)
摘要：目的 观察血清药漏芦对 oxLDL 诱导 U937 细胞表面 CD36 表达的影响。方法 先用 oxLDL 与 U937 细胞
孵育造成泡沫细胞模型,同时用血清药漏芦对泡沫细胞进行干预,采用流式细胞仪检测 CD36 的表达情况。结果 漏
芦提取液 1000、500、250 mg/L 可不同程度地抑制 CD36 的表达,且三者呈剂量依赖关系(P <0.01)。结论 漏芦抗
AS 作用机理可能与其抑制 CD36 的表达有关。
关键词：血清药漏芦；泡沫细胞；CD36；oxLDL；U937
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2005)07-0035-03
The Effect on CD36 Expression Induced by oxLDL on U937 Cell Surface by the Dog-serum of
Rhaponticum Uniflorum Extraction CHAI Xin-lou, WANG Wei, WANG Qian, et al (Beijing University of
TCM, Beijing 100700, China)
Abstract：Objective The CD36 expression induced by oxLDL on the U937 cell surface by
dog-serum of rhaponticum uniflorum extraction is observed. Method Incubate U937 cell with the
oxLDL together to make the model of foam cell, and use the dog-serum of rhaponticum uniflorum
extraction to affect CD36 expression on U937 cell surface. Then use the flow cytometer to detect the
amount of CD36 expression on the cell surface by marking CD36 with the anti-IgG. Result The kinds
of concentration of dog-serum 1000, 500, 250 mg/L all can inhibit CD36 expression, and
depend on a good dosage-effect relationship (P <0.01). Conclusion The inhibition of CD36 expression
maybe one of the mechanism that dog-serum of rhaponticum uniflorum extraction can be used to
cure the artherosclerosis.
Key words：dog-serum；rhaponticum uniflorum；foam cell；CD36；oxLDL U937 cell
中药血清药理学的运用,使单体药通过含药血清进行体
外研究比药物直接接触培养体系更具有体内药物作用的可拟
性,因此,通过给培养体系加用含药的血清进行研究日益受到
重视。但是,由于在实验中常规制备的血清本身也会对培养体
系起作用,而且体系中的血清量越大,这种背景作用也越明显,
甚至当血清浓度超过一定限度时,会产生对培养体系的毒损
作用。为此,我们尝试通过对 U937 细胞株细胞系的基础性指
标研究,探讨常规法制备的不同浓度犬血清对体外培养体系
的背景作用[1]。
1 材料与方法
1.1 试剂、药物和仪器
U937 细胞株由协和医院病理室提供,RPMI-1640 培养基
购自GIBCO公司,CFBS购自 Hyclone公司,双缩脲试剂盒、MDA
试剂盒购自南京建成生物工程研究所,氧化型低密度脂蛋白
(oxLDL)购自协和医院生化室,CD36 购自精美生物制品有限
公司。祁州漏芦粗提物由本校药化室提供。MTT、台盼蓝及二
甲基亚砜(DMSO)购自 Sigma公司。岛津MultiSpec 1501 型紫外
可见光分光光度计,GDV DV990BV4 酶标仪,瑞士 METTLER
TOLEDO-320 型数字式精密酸度计,JA1003 电子天平,722 分光

基金项目：国家自然基金资助项目(39970907)
光度计,Heraeus Hera cell 培养箱,BDFACS GLIBUR 流式
仪,OLYMPUS 倒置相差显微镜。
1.2 氧化型低密度脂蛋白的制备
低密度脂蛋白购自北京协和医科大学生化室,测其浓度为
1 g/L,将 LDL 置于含 10 μmL/L CuSO4 的 PBS 中 37 ℃氧化 24
h 后。然后,在 4 ℃,含 100 mg/L EDTA 的 PBS 中透析,每 8 h
换液 1 次,透析 24 h。用 0.25 μm 微孔滤膜过滤除菌备用。
用硫代巴比妥酸反应物质含量来鉴定 LDL 的修饰程度。以四乙
氧基丙烷为标准品,用每毫克 LDL 蛋白中丙二醛的含量表示,
按说明书操作,测得新鲜 LDL 的丙二醛为 2.2 μmol/g 经
CuSO4处理的 LDL 即 oxLDL 的丙二醛含量为 37.22 μmol/g。
1.3 血清药制备
15 kg 纯种彼格犬正常饮食预适应 1 周,空腹 24 h 后,无
菌取空白血清10 mL(注意防止凝血),静止0.5 h后37 ℃3 000
r/min,离心 10～15 min,血清呈现透明清亮淡黄色无沉淀无
溶血,取血清 56 ℃,30 min 灭活,30 ℃保存,1 个月内使用。
1.4 U937 细胞的培养及分组
U937 细胞常规法培养,培养液为 10% CFBS 的 RPMI-1640
培养基内含青、链霉素各 100 u/mL,无血清的 RPMI-1640 培
养基内含青霉素,链霉素各 100 u/mL,含犬用药前的血清的
RPMI-1640 培养基内含青霉素、链霉素各 100 u/mL(无血清的
·36· Chinese Journal of Information on TCM Jul.2005 Vol.12 No.7
RPMI-1640 培养基与血清药浓度分别为 5%、10%、15%、30%
的犬血清按体积比配制)。正常对照组：10%CFBS 的 RPMI-1640
培养基。
无血清培养组：无血清的 RPMI-1640 培养基。5%的犬血
清组：含 5%的犬血清的无血清的 RPMI-1640 培养基。10%的
犬血清组：含 10%的犬血清的无血清的 RPMI-1640 培养基。
15%的犬血清组：含 15%的犬血清的无血清的 RPMI-1640 培养
基。
30%的犬血清组：含 30%的犬血清的无血清的 RPMI-1640
培养基。5%的犬血清 oxLDL 组：含 5%的犬血清的无血清的
RPMI-1640 培养基与 100 u/L 的 oxLDL。10%的犬血清 oxLDL
组：含 10%的犬血清的无血清的 RPMI-1640 培养基与 100 u/L
的 oxLDL。15%的犬血清 oxLDL 组：含 15%的犬血清的无血清
的 RPMI-1640 培养基与 100 u/L的 oxLDL。30%的犬血清 oxLDL
组：含 30%的犬血清的无血清的 RPMI-1640 培养基与 100 u/L
的 oxLDL。
1.5 MTT 测定
取对数生长期细胞,离心,PBS液洗涤2次,离心,弃上清,
用含10% CFBS的 RPMI-1640培养液配成细胞密度1×106个/L
左右细胞悬液,96 孔培养板,每孔加入细胞悬液 100 μL 继续
培养36 h后,去培养液,按组别分别加入各种培养液,各组均设
6个重复孔,于 37 ℃含 5% CO2和 95%空气的培养箱中培养,24 h
后检测。将培养各组细胞每孔加入 MTT 溶液(5 mg/mL)20 μ
L,37 ℃,继续孵育 4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,
每孔加入 150 μL DMSO,震荡 10 min,使结晶物充分溶解,选择
490 nm 波长,在酶标仪上测定各孔 OD 值。
1.6 CD36 测定
将上述经处理的各组 U937 细胞收集低速离心弃上清,加入
PBS 5 mL 制成悬液,漂洗2次,弃上清后加入FITC-CD36 10μL
避光,30 min 后,于流式细胞仪检测。
1.7 统计学处理
实验数据用—x±s 表示,多组比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 细胞形态学改变
倒置相差显微镜下观察细胞,正常组细胞形态呈典型的
单核细胞生长特征,细胞透亮,呈悬浮状,胞核居中呈圆形或
椭圆形,核仁明显。无血清 24 h 培养组与 5%组细胞形态相似,
细胞瘦小,胞核变小,胞膜不清楚,有突起。10%、15%两组细胞
生长较好,细胞形态正常,30%组细胞形态未见明显损伤,胞膜
不清楚,有突起。
2.2 不同浓度犬血清对 U937 细胞 MTT 的影响(见表 1)
3 讨论
由于中药复方成分复杂,粗制剂直接用于体外药理实验
时,所含的各种杂质或鞣质成分以及其本身的酸碱度都会影
响体外细胞的生存环境,经常造成一些假阴性或假阳性结果,
因而其实验结论科学性较差,难以得到认可。但将中药粗制剂
给动物口服,取其血清进行体外实验,比较接近药物在体内

表 1 不同浓度漏芦血清对 U937 细胞 MTT 的影响
(—x±s,n =6)
组别 MTT(OD)
正常对照组 0.60±0.044
无血清培养组 0.20±0.014#
5%含药血清组 0.33±0.008#
10%含药血清组 0.38±0.024#
15%含药血清组 0.49±0.014#
30%含药血清组 0.40±0.008#
注：与正常对照组比较,#P <0.01
2.3 各组 CD36 表达情况(见表 2、图 1)
表 2 不同浓度漏芦血清药对泡沫细胞 CD36 表达的影响
组别 CD36
正常对照组 22.12±0.28**
无血清培养组 25.42±1.18**
模型组 79.65±3.60
5%含药血清组 68.05±3.02*
10%含药血清组 59.04±2.80*
15%含药血清组 49.17±2.27*
30%含药血清组 63.12±3.76*
注：与模型组比较,*P <0.05,**P <0.01
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
CD
36
e
xp
re
ss
io
n
正常组 无血清组 模型组 对照组 2 h 3 h 6 h 24 h
图 1 不同时间漏芦血清药对泡沫细胞 CD36 表达的影响
环境中产生药理效应的真实过程,其原有成分或在体内转化
为活性成分,或代谢后失活,或没有被吸收入体内,或通过第
二信使而间接起作用都可以通过血清药理学反映出来,理论
上更具备科学性、真实性[1]。另外,在新药研究领域内,国外
目前也日益重视体外实验,包括在细胞模型上的观察,一是由
于所需样品量较少,实验效率高,另一方面则是从保护动物的
角度看,可以减少动物的使用量。
合适的给药剂量对保证实验的成功很重要。由于加入反
应系统的血清要被稀释,应尽可能增大剂量。李氏[2]提出两种
方法：①增大给药剂量,给药剂量=在体实验的给药剂量×反
应系统中被稀释的倍数(实际等同上述参考公式)；②血清冻
干粉法,此法最大的优点是可在较大范围内控制实际加入反
应系统中的药量。刘氏[3]建议采用整体模型动物的有效剂量。
我们认为,剂量最好通过预试验决定,如本实验目的就在于探
索用彼格犬做实验时所用血清药的浓度的大小。
血清作为体外组织及细胞培养中重要的天然培养基,它
含有丰富的营养物质,包括大分子的蛋白质和核酸等,对促进
细胞生长繁殖、粘附及中和某些毒性物质的毒性起着一定作
2005 年 7 月第 12 卷第 7 期 中国中医药信息杂志 ·37·
补阳还五汤对缺氧-复氧损伤内皮细胞的保护作用
成细华,喻 嵘,邓奕辉,梅志刚
(湖南中医学院,湖南 长沙 410007)
摘要：目的 探讨补阳还五汤(BHD)对缺氧-复氧损伤内皮细胞(ECV)的保护作用。方法 体外培养人脐静脉内
皮细胞株 ECV304,缺氧-复氧造成 ECV 损伤,同时加入不同剂量 BHD,检测细胞丙二醛(MDA)、培养上清液中乳酸脱氢
酶(LDH)、内皮素-1(ET-1)及一氧化氮(NO)的含量变化。结果 ECV304 缺氧-复氧后,与空白组比较,LDH、MDA 及
ET-1 含量显著升高(P <0.01),而 NO 含量显著下降(P <0.05)。当加入低、中、高剂量的 BHD 或尼莫地平阳性对照
药后,与缺氧-复氧模型组比较,LDH、MDA及ET-1含量下降(P <0.01或P <0.05),而NO含量升高(P <0.01)。结论 BHD
能抑制缺氧-复氧对 ECV 的损伤,对缺氧-复氧环境下的 ECV 起保护作用。
关键词：补阳还五汤；缺氧-复氧；人脐静脉 ECV
中图分类号：R289.11 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2005)07-0037-03
Protective Effects of Buyang Huanwu Decoction on Endothelial Cells Cultured in Hypoxia
Reoxygenation Circumstance CHENG Xi-hua, YU Rong, DENG Yi-hui, et al (Hunan College of TCM,
Changsha 410007, China)
Abstract：Objective To investigate protective effects of Buyang Huanwu decoction (BDH) on
endothelial cell line ECV304 cultured in hypoxia reoxygenation circumstance. Methods The effects of
ECV304 were determined by measuring MDA in cells and LDH, ET-1, NO in the supernatant.
Results In the circumstance of hypoxia reoxygenation, the contents of LDH, MDA, ET-1 were
markedly increased (P<0.01), and the contents of NO were markedly reduced (P<0.05).
Treatment with different concentrations of BHD or controlling drug either caused a reduction in
the LDH, MDA, ET-1 contents and an increase in the NO contents (P<0.01 or P<0.05).
Conclusions BHD can inhibit the release of LDH, MDA, ET-1 and promote the release of NO

用。因此,高质量的血清往往成为体外培养体系能否建立的关
键因素。在运用血清药理学进行体外含药血清的制备时,由于
技术等方面的原因,只能采用常规的实验条件和方法,这样所
制备的血清势必对细胞具有一定的基础影响作用。为此,我们
采用常规制备的犬血清,观察了不同浓度的家犬血清对细胞
的影响。
MTT 实验结果表明,当用无血清诱导细胞 24 h 后,细胞增
殖受到抑制(OD 值降低),而加用各种浓度的犬血清后,则表
现出明显的血清促生长、促增殖作用,但这种促增殖作用一旦
超过了一定的浓度(15%)后,其毒损作用就开始明显增加,MTT
实验反应的既有血清的促增殖作用,也有对细胞的毒损作用,
所以表现为 MTT 细胞毒试验不呈现剂量依赖关系。
另外,从对单核细胞表面 CD36 表达的定量分析角度观察,
我们用流式细胞仪来检测 CD36 的表达情况,U937 是美国 ATCC
公司认证的人单核细胞的一种永生化细胞系,由于其培养时不
需要特异的生长因子,并且保持有单个悬浮的单核细胞的生长
特征,这样既可以在不对细胞造成损伤的前提下进行无血清培
养,将其作为对照,也可以起到降低实验背景和实验误差的作
用。目前已公认 CD36 抗原为一种清道夫受体,可与 oxLDL 等许
多配体高效结合,但不受 AcLDL 抑制,且结构与经典的清道夫
受体不同,故不属于经典的清道夫受体。CD36 抗原与单核细胞
向巨噬细胞分化及单核细胞泡沫化有关。oxLDL 通过 CD36 抗
原受体与单核细胞结合后,可产生一些细胞因子,作用于单核
细胞及血管壁细胞,促进动脉粥样硬化病变的形成。本研究观
察 CD36 的表达情况目的在于下一实验中可以更好地了解漏芦
在体内的代谢情况,为了解漏芦的药代学作准备。该实验结果
表明,在浓度为 15%时,CD36 的表达受到明显抑制。
总之,从我们的实验结果来看,常规制备的犬血清在没有
污染和没有溶血的情况下,其对细胞的作用浓度是有一定限
制的,当达到 30%时有较为明显的损伤特征和表现。所以,在
中药血清药理学研究中,应进行常规制备正常血清及含药血
清的细胞毒实验,以确定最大的给血清浓度,尽量减少血清本
身带给实验的影响。同时我们观察到有效抑制泡沫细胞中
CD36 表达的漏芦血清药的浓度为 15%,这为我们下一个实验
的顺利进行提供了依据。
参考文献：
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(收稿日期：2004-10-14)