全 文 ：收稿日期:2003-06-02
基金项目:国家自然基金资助项目(39970907)
漏芦对OLDL诱导U937细胞系形成泡沫细胞
过程中 CD36表达抑制作用的研究
柴欣楼 ,王　伟 ,张　壮 ,崔　巍 ,闫颜芳 ,牛福玲
(北京中医药大学教育部中医内科学重点实验室 ,北京　100700)
　　摘要:目的:观察漏芦提取液对 OLDL诱导 U937 细胞表面 CD36 表达的影响。方法:先用 OLDL与 U937 细胞孵育造成泡沫
细胞模型 ,同时用漏芦提取液对泡沫细胞进行干预 , 采用流式细胞仪检测 CD36 的表达情况。结果:漏芦提取液 1g L、500mg L、
250mg L可不同程度地抑制 CD36的表达, 且三者呈剂量依赖关系。结论:漏芦抗 AS 作用可能的机理与其抑制 CD36的表达有关。
关键词:漏芦;泡沫细胞;CD36;OLDL;U937
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1005-9903(2003)05-0053-02
　　脂肪条纹是动脉粥样硬化的早期表现[ 1] ,脂肪
条纹由成群泡沫细胞组成 ,泡沫细胞主要来源于血
液中的单核细胞 ,停留在病灶内的巨噬细胞能吞噬
过量脂质 ,并演变为泡沫细胞。研究表明[ 2 , 3] :单核
细胞 巨噬细胞摄取脂质主要通过受体途径 ,包括清
道夫受体 ,CD36即为清道夫受体 ,其可结合并内化
OLDL
[ 4] ,它可与氧化低密度脂蛋白结合 ,与泡沫细
胞的形成密切相关。以往的研究表明漏芦具有抗粥
样硬化的作用 ,但其详细机理未明 ,本研究观察不同
浓度漏芦对泡沫细胞表面 CD36表达的影响 ,并对其
形成机制做初步探讨 ,以期进一步研究漏芦抗 AS 的
机理 。
1　实验材料与方法
1.1　试剂和仪器 　U937 细胞株由协和病理室惠
赠 ,RPMI-1640培养基购自 GIBCO 公司 , CFBS 购自
Cyclone公司 ,双缩脲试剂盒 、MDA试剂盒购自南京
建成生物工程研究所 , JA1003电子天平 ,722型分光
光度计 , BDFACS GLIBUR流式仪 ,低速离心机 。漏
芦提取物由本校药化室提供。
1.2　氧化型低密度脂蛋白的制备　低密度脂蛋白
购自协和生化室 ,测其浓度为 1g L ,将 LDL 置于含
10μmol L CuSO4 的 PBS中 ,37℃透析 24h后 ,0.25μm
微孔滤膜过滤除菌备用 ,用硫代巴比妥酸反应物质
含量来鉴定 LDL 的修饰程度 ,按说明书操作。以四
乙氧基丙烷为标准品 ,用每毫克 LDL蛋白中丙二醛
的含量来表达 LDL 的修饰程度。测得新鲜 LDL 的
丙二醛为 2.2μmol g 经 CuSO 4 处理的 LDL 即 OLDL
的丙二醛含量为 37.22μmol g 。
1.3　漏芦提取液的制备　取漏芦干燥根 ,经过水煮
醇沉 ,取上清液 ,真空干燥得漏芦粗提物 。取漏芦粗
提物 200mg溶入 200ml无血清的 RPMI-1640 培养基
中(pH7.2),配为1mg ml漏芦提取液 ,在此基础上按
倍比稀释依次得到 1 2mg ml 、1 4mg ml 、1 8mg ml……
1 210mg ml的漏芦提取液。
1.4　MTT测定漏芦提取液对 U937细胞的影响　取
对数生长期细胞 ,离心 、PBS 液洗涤 2次 ,离心 ,弃上
清 ,用含无血清的 RPMI-1640培养液配成细胞密度 1
×106 个 L左右细胞悬液 ,种植于 96孔培养板 ,每孔
加入细胞悬液 100μl继续培养 24h后 ,轻轻吸去培养
液 ,按组别分别加入各种培养液各 100μl , 共分 12
组 ,各组均设 8个重复孔。第 1组浓度为 1mg ml漏
芦提取液 ,第 2-11组的漏芦提取液浓度按倍比稀释
得到 , 第 12 组为无血清的 RPMI-1640 培养基。于
37℃, 5%CO2 和 95%空气的培养箱中培养 , 24h 后
检测。
将培养各组细胞的培养液中加入 MTT 溶液
(5mg ml)20μl , 37℃,继续孵育 4h ,终止培养 ,小心吸
弃孔内培养上清液 , 每孔加入 150μl DMSO , 震荡
10min ,使结晶物充分溶解 ,在酶标仪上于 490nm 波
长下测定各孔OD值 。
1.5　U937细胞的培养及处理　U937细胞常规法培
养 ,培养液为 10%CFBS 的 RPMI-1640 培养基(内含
青 、链霉素各100u ml),U937细胞置于 37℃,5%CO2
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第 9卷第 5 期
2003年 10 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol.9 , No.5
Oct., 2003
DOI :10.13422/j.cnki.syf jx.2003.05.022
和95%空气的培养箱中培养 ,细胞密度 1×106 个 L
左右 ,每 2d换液 1次。
1.6　细胞分组　正常对照组:在 10%CFBS 的 RP-
MI-1640培养基中培养。无血清培养组:在无血清的
RPMI-1640培养基中培养 。OLDL处理组(模型组):
经无血清的 RPMI-1640 培养基培养 24h 后 ,换液后
加OLDL到无血清的 RPMI-1640培养基(OLDL 终末
浓度为 100μg ml)中培养。漏芦组:经无血清的 RP-
MI-1640培养基培养 24h后 ,换液后加漏芦提取液到
终末浓度分别为 1g L、500mg L 、250mg L , (OLDL 终
末浓度为100μg ml)的无血清的RPMI-1640培养基中
培养 。各组培养于 24孔板中 ,每组6孔 ,24h后收集
细胞 。
1.7　流式细胞仪测定　将上述经处理的 U937细胞
收集低速离心弃上清 ,加入 PBS 5ml制成悬液 ,漂洗
2次 ,弃上清后加入 FITC-CD36 10μl ,避光 30min 后 ,
于流式细胞仪检测。
1.8　统计学处理　结果用 x ±s表示 ,多组比较用
单因素方差分析 。
2　结果
2.1　大体形态　在倒置相差显微镜下观察细胞 ,正
常组细胞形态呈典型的单核细胞生长特征 ,细胞透
亮 ,呈悬浮状 ,胞核居中呈圆形或椭圆形 ,核仁明显。
无血清 24h培养组细胞瘦小 ,胞核变小 ,胞膜不清
楚 ,有突起 。终末浓度 100μg ml的 OLDL 组可见细
胞透亮 ,呈悬浮状 ,胞核有的偏于一侧呈圆形或椭圆
形 ,染色质明显增粗 ,胞膜模糊 ,胞浆肥大 ,有大量空
泡出现 。治疗组可见单核细胞生长未见明显异常 ,
细胞透亮 ,呈悬浮状 ,胞核居中呈圆形或椭圆形 ,核
仁明显 ,胞膜完整 ,胞浆中有少量空泡出现。
2.2　MTT 测定漏芦提取液对 U937细胞的影响　经
检测发现漏芦提取液对 U937细胞的增殖没有影响 ,
各组与无血清的 RPMI-1640 细胞组相比 ,无明显差
异。
2.3　处理的 U937细胞 CD36表达　正常组及无血
清组与模型组相比差异显著(P <0.01),治疗组与正
常组比较无明显差异 ,治疗组与模型组比较差异显
著(P<0.01),具体结果见表 1。
3　讨论
漏芦具有多种化学成分 ,并具有不同的药理作
用 ,且漏芦在降血脂 、抗动脉粥样硬化方面有重要作
用。卢泳才[ 5] 等报道 ,漏芦水煎剂可使胆固醇下降 ,
AS病变减轻 ,发生率降低。CD36为巨噬细胞表面
表 1　漏芦对泡沫细胞 CD36表达情况
的影响( x±s , n=6)
组别 CD36
正常组 22.12±0.28＊
无血清培养组 25.42±1.18＊
模型组 55.53±3.60
1g L组 26.16±7.68＊
0.5g L组 30.09±4.58＊
0.25g L组 35.26±3.33＊
　　注:与模型组比较＊P<0.01。
的膜受体 ,能识别并内化 OLDL ,使巨噬细胞转化为
富含脂质的泡沫细胞 ,OLDL 有细胞毒作用 ,可使泡
沫细胞崩解 ,释放大量脂质 ,在内膜下形成斑块 ,因
此抑制巨噬细胞表面 CD36的表达 ,可能抑制斑块形
成 。本研究通过 MTT 法观察漏芦提取液对单核细
胞的影响 ,发现漏芦提取液对单核细胞未表现出细
胞毒性反应及促增殖作用 ,表明漏芦提取液对泡沫
细胞的作用不是通过抑制单核 巨噬细胞的增殖反
应 ,但通过对 OLDL诱导 U937 细胞表面 CD36 表面
影响的研究 ,结果表明正常组 、无血清组与模型组有
显著性差异(P<0.01),与漏芦组无明显差异 ,治疗
组与模型组有显著性差异 , 说明漏芦提取液 1g L 、
500mg L、250mg L可不同程度地抑制 CD36的表达 ,
且呈剂量依赖关系 。提示漏芦抗 AS的机理可能与
其抑制 CD36 的表达有关。由此推断 ,漏芦抑制 AS
的形成机制之一可能是通过影响清道夫受体途径 ,
通过抑制CD36的表达来抑制脂质条纹的形成 ,发挥
抗AS的作用 ,这为我们将来进一步研究漏芦的药
代 、药动学奠定了实验基础 。
参考文献:
[ 1] 　Alan D , Simon ER.Lipoproteon oxidation as a medicator of
atherogenesis:insights from pharmacological studies[ J] .Card-
iovsa Res , 1995 , 29(3):297-311.
[ 2] 　Van der Wal Ac.Macrohage differcntiation in atherosclerosis
An in situ immunohistochemical analysis in humans[ J] .Am J
pathol , 1992 , 141:161.
[ 3] 　Feng C.The receptor-mediated accumulation of triglyceride in
macrexpoeed to very low density lipoproteins[ J] .Acta Acad
MedMuhan , 1983 , 3:8.
[ 4] 　Jihong Han.Native and Moditied Low Density Lipoproteins
Increase the functional Expression of the Macrophage Class B
Scavenger Receptor CD36[ J] .J Biol Chwm , 1997 , 272(34):
21654.
[ 5] 　卢泳才 , 翁玉椿 ,刘小青 , 等.中药漏芦抗动脉粥样硬化
的实验研究[ J] .中华医学杂志 , 1985 , 65(12):75.
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第 9卷第 5 期
2003年 10 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol.9 , No.5
Oct., 2003