全 文 ：中国药物与临床 2013年 5月第 13卷第 5期 Chinese Remedies & Clinics，May 2013,Vol.13,No.5
多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）又称浆细胞骨髓
瘤，是浆细胞恶性克隆性增生，出现以广泛溶骨病变和（或）
骨质疏松为特征的恶性肿瘤［1］。MM老年人多见，但中青年也
可发病［2］，瘤细胞增殖比例低（通常＜1．5%）、多药耐药，且治
疗反应较差，最终因耐药而复发。迄今，MM作为一种不可治
愈的恶性肿瘤正严重地危害着人们的身体健康，因此，寻找
新的植物来源的药物治疗 MM显得非常必要。
禹州漏芦 （Radix Echinopsis） 为菊科植物蓝刺头
Echinops latifolius Tausch 或华东蓝刺头 Echinops grijisii
Hance的干燥根，主产于我国华北及华东地区。禹州漏芦味
苦、性寒，归胃经，具有清热解毒、排脓止血、消痈下乳的功
效，用于治疗乳痈肿痛，痈疽发背，瘰疬疮毒，乳汁不通，湿痹
拘挛。现代药理学研究表明，禹州漏芦中噻吩类化合物具有
体外抗肿瘤活性。但是禹州漏芦提取物作用于 MM的研究目
前尚无报道。本实验通过血清药理学的方法观察禹州漏芦
95％乙醇提取物对 U266细胞株的诱导凋亡的作用，观察含
药血清作用后细胞凋亡的形态及凋亡率，探讨其与浓度及时
间的依赖性及诱导凋亡的机制，为 MM的治疗寻找一种有效
低毒的中草药制剂，有助于新药的开发和应用。
1 材料与方法
1．1 试剂与仪器
人 MM细胞株 U266 由石家庄白求恩国际和平医院提
供，胎牛血清为北京元亨公司产品，RPMI 1640培养基购自
美国 Gibco BRL 公司，Hoechst33258购自 Sigma公司，Annex-
inV/碘化丙啶（PI）双染试剂盒购自欣博盛公司，抗荧光淬灭
封片液购自碧云天公司，激光扫描共焦显微镜为 Olympus FV
1000，流式细胞仪为 Cytomics FC 500。
1．2 药物制备
禹州漏芦干燥根购自安徽亳州，经山西省中药研究院药
理实验室检验证实为禹州漏芦后，取干燥根 5 kg粉碎，用
95％的乙醇（5 kg×8倍量）热提 3次，每次 3 h，回收乙醇，合
并、抽滤、减压、浓缩，控制生成含生药量 4，2，1 g/ml 3种浓
度梯度的粗提液，4 ℃冰箱储存备用。
1．3 含药血清的制备
禹州漏芦含药血清对人多发性骨髓瘤细胞株
U266凋亡影响的研究
吕 红 马艳萍 康 影 常明星 雷鹏云
DOI：10.11655/zgywylc2013.05.013
作者单位：030001 太原，山西医科大学研究生学院（吕红、康影、
常明星、雷鹏云）；山西医科大学第二医院血液科（马艳萍）
通信作者：马艳萍，Email：myanp18＠163．com
导通路来抑制或加快细胞凋亡。本研究通过测定 bax和 bcl-2
蛋白和 mRNA的量的变化来反映脂联素对高糖环境下肾小
管细胞的保护作用。
实验结果显示：肾小管上皮细胞在高糖环境下的凋亡率
明显上升，且 bax mRNA表达增多，bcl-2 mRNA表达下降，说
明高糖可通过诱导 bax和抑制 bcl-2的表达，导致肾小管上
皮细胞凋亡、损伤，从而导致肾功能的损害，并且这种损伤于
24 h之内便开始形成，且呈时间依赖性。而在加入浓度为
2．5 μg/ml脂联素的干预组中，细胞凋亡率明显下降，但仍然
略高于对照组的正常血糖环境下的凋亡率，且 bax和 bcl-2
的 mRNA表达分别较高糖组下降和上升，同时 bax/bcl-2显
著减低，有研究证明 bax/bcl-2比率可以作为反映细胞凋亡程
度的指标，并且这种保护作用是通过 bax和 bcl-2的凋亡调
控系统来完成的：当 bax表达增多，bax-bax二聚体大量形成，
启动凋亡程序，细胞增殖减少凋亡增多；当 Bcl-2蛋白表达量
上升，bax表达减少，越来越多的 bax二聚体分开，与 bcl-2形
成比 bax-bax更稳定 bax-bcl-2 异源二聚体，从而 “中和”了
bax-bax 诱导凋亡的作用，并促进细胞的增殖。说明脂联素可
以通过抑制细胞的凋亡对肾小管上皮细胞起到保护作用，但
不可完全抵消高糖环境对其造成的损害，随着细胞在高糖环
境中生存的延长，脂联素的保护作用逐渐减弱甚至消失，可
能由于脂联素受体敏感性下降或者是细胞功能严重受损导
致。
综上所述，高糖环境可通过上调 bax和下调 bcl-2的表
达促使肾小管上皮细胞凋亡，导致肾小管上皮损伤和肾小管
功能丧失，是糖尿病肾病发生发展的重要参与因素。但脂联
素可下调 bax以及上调 bcl-2的表达，使 bax/bcl-2降低，从而
达到在高糖环境下对肾小管细胞的保护作用，为糖尿病肾病
的治疗提供了新的思路。
参 考 文 献
［1］ Vallon V，Thomson SC． Renal function in diabetic disease mod-
els： the tubular system in the pathophysiology of the diabetic
kidney． Annu Rev Physiol，2012，17（74）：351-375.
［2］ Scherer PE，Williams S，Foglinano M，et al． A novel serum pro-
tein similar to C1q， produced exclusively in adipocytes． J Biol
Chem，1995，270（45）：26746-26749.
（收稿日期：2013-01-25）
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中国药物与临床 2013年 5月第 13卷第 5期 Chinese Remedies & Clinics，May 2013,Vol.13,No.5
取健康大鼠 48只，雄性，体质量 200~240 g，随机分成空
白血清组 12只，高、中、低浓度含药血清组各 12只。含药血
清组每日分别给予禹州漏芦粗提液 4、2、1 g/ml 浓度 4 ml/d
灌胃，每日 1次，空白血清组每日给予等量 0.9%氯化钠注射
液灌胃（灌药前禁食 12 h，不禁水），于给药第 6天，最后 1次
灌胃后 1 h腹主动脉无菌采血，室温下 3000 r/min离心 10
min，无菌分离血清，经 56 ℃、30 min灭活处理，同组混合，分
装小瓶，置-20 ℃冰箱保存备用（2个月内使用）。
1.4 试验方法
1.4．1 细胞培养：人 MM细胞株 U266培养于含 10％胎牛血
清及青霉素、链霉素（100 U/ml）的 RPMI1640 培养液，置 37
℃、体积分数为 5％ CO2细胞培养箱中传代培养。每 2 d换
液，取对数生长期的细胞进行以下实验。
1.4．2 分组及给药量：①空白对照组：培养液为 10％胎牛血
清及青霉素、链霉素（100 U/ml）的 RPMI1640培养液；②10％
正常大鼠血清组：培养液中加入了 10％正常大鼠血清；③
10％高浓度大鼠血清组：培养液中加入了 10％高浓度大鼠血
清；④10％中浓度大鼠血清组：培养液中加入了 10％中浓度
大鼠血清；⑤10％低浓度大鼠血清组：培养液中加入了 10％
低浓度大鼠血清。
1.4．3 激光扫描共焦显微镜观察凋亡细胞形态：取对数生长
期的 U266细胞制备 2×106细胞悬液，加入不同浓度的禹州
漏芦含药血清（控制含药血清浓度在 10％），对照组中加入含
10％胎牛血清的 RPMI 1640，置 37 ℃、体积分数为 5％CO2细
胞培养箱中培养 48 h后，收集细胞用冷的 Buffer A洗涤细胞
2次（1000 r/min，5 min），加入 1 ml的 4％甲醛溶液，4 ℃固定
细胞过夜，离心去固定液，Buffer A洗 2次；弃上清，Buffer A
重悬细胞，取上述细胞悬液 50 μl涂片，自然晾干，滴加 100
μl Hoechst 33258工作液室温染色 30 min，水冲晾干；激光扫
描共聚焦显微镜下观察发蓝色荧光的细胞核 （激发波长在
350 nm左右，发射波长在 460 nm左右），每组细胞观察 5个
视野，每个视野下计数 10个细胞数，估算细胞凋亡比例。
1.4．4 流式细胞术检测细胞凋亡率：U266细胞以 1×106个/ml
接种 6孔培养板，分别加入不同浓度禹州漏芦含药血清，对
照组加入等量培养液，分别在 24、48 h后收获细胞，收集细
胞，4 ℃预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 2次（1000 r/min离心，
7 min）弃上清。将细胞重悬于结合缓冲液，使其浓度为（2~5）
×105/ml，取 195 μl细胞悬液加入 5 μl Annexin V-异硫氰酸荧
光素（FITC），轻轻混匀后间隔 3 min，再加入 10 μl浓度为 20
μg/ml的 PI，混匀后于室温避光孵育 10 min，加 300 μl结合
缓冲液，轻轻混匀，上流式细胞仪检测，分析细胞凋亡比例。
1．5 统计学处理
采用 SPSS 13．0软件，计量资料用 x±s表示，各组计量资
料进行方差分析，以 P＜0．05为差异有统计学意义。
2 结 果
2．1 激光扫描共焦显微镜下观察细胞凋亡形态：不同浓度禹
州漏芦含药血清处理 U266细胞 48 h后，经 4％多聚甲醛、
hoechst 33258处理后，激光扫描共焦显微镜下观察空白对照
组及正常大鼠血清组细胞核形态基本一致，细胞膜完整，细
胞核呈圆形，密度均匀一致。低、中、高浓度含药血清组细胞
表现出凋亡特征：细胞核皱缩，染色质浓缩边集，个别细胞出
现极不规则的花瓣状或星形细胞核，有的呈新月状贴于细胞
膜周边，且随浓度增高细胞核凋亡形态明显，中浓度组和高
浓度组出现凋亡小体。
2．2 流式细胞仪检测禹州漏芦含药血清诱导 U266细胞凋
亡：Annexin V-FITC/PI双染标记细胞后流式细胞仪检测凋亡
结果经方差分析可知（表 1），不同浓度禹州漏芦含药血清作
用 24、48 h 后，U266 细胞凋亡率不相同 （F＝131．131，P＜
0．001），即随着禹州漏芦含药血清浓度的增加细胞凋亡率逐
渐增加，空白对照组和正常大鼠血清对照组差异无统计学意
义；而且随着作用时间的延长细胞凋亡比例增高，作用 48 h
细胞凋亡率高于 24 h，差异有统计学意义 （F＝130．537，P＜
0．05）。
3 讨 论
MM细胞能分泌大量的单株免疫球蛋白，会产生具有细
胞毒性的错误折叠蛋白，在肿瘤细胞中，无论是靶向蛋白酶
体通路还是聚集体通路都可导致大量的泛素化蛋白在细胞
累积，从而引起细胞凋亡。MM细胞为了生存，需要有效的蛋
白降解系统来清除这些多余的蛋白。聚集体和蛋白酶体通路
是负责降解细胞毒性错误折叠蛋白。组蛋白去乙酰化酶（hi－
stone decetylase，HDAC）促进骨髓瘤产生的错误折叠的蛋白
通过聚集体通路降解，因此降低 HDAC的活性可以抑制错误
折叠的蛋白通过聚集体通路降解，发挥抗骨髓瘤作用。
既往研究表明，多个 HDAC 带有含半胱氨酸的区域，
HDAC6在其 C端有一段富含半胱氨酸和组氨酸的区域，半
胱氨酸的 S-亚硝基化可导致 HDAC活性下降。禹州漏芦提取
物中的噻吩环可被体内精氨酸代谢产生的一氧化氮（NO）转
变为低相对分子质量巯基亚硝基化化合物，进而向组蛋白去
乙酰化酶提供 NO基团，从而使 HDAC被亚硝基化而活性下
降。因此我们推断禹州漏芦可以通过亚硝基化作用降低
HDAC的活性，发挥抗骨髓瘤作用。
本实验研究结果表明：禹州漏芦含药血清对 MM细胞
U266具有诱导凋亡的作用，免疫荧光染色结合激光共聚焦
扫描显微镜观察禹州漏芦含药血清作用后细胞核可见明显
的形态异常，中浓度和高浓度含药血清作用 48 h后可见凋亡
小体，流式细胞术检测凋亡率结果表明禹州漏芦含药血清诱
表 1 禹州漏芦含药血清作用 24 48 h细胞凋亡率（％）比较（x±s）
组别 样本数 24 h 48 h
空白对照组 3 0．9a±1．2 3．1±1．1
正常血清组 3 1．3a±0．4 2．8±0．7
低剂量组 3 6．4b±1．7 12．2±1．18
中剂量组 3 12．0c±3．3 18．9±2．3
高剂量组 3 19．3d±3．4 44．2±4．4
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中国药物与临床 2013年 5月第 13卷第 5期 Chinese Remedies & Clinics，May 2013,Vol.13,No.5
本研究通过免疫组织化学检测大肠癌中二氢嘧啶脱氢
酶（DPD）的表达情况，结合体外药敏试验，探讨 DPD表达水
平与 5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗敏感性的相关性，从中分析药物
代谢相关酶的表达情况，为临床开展耐药指标筛查，指导大
肠癌个体化疗提供理论依据。
1 资料与方法
1．1 临床资料
收集 2010年 9月至 2012年 3月忻州市人民医院住院
手术切除的大肠癌 56例，所有患者术前均未接受过化、放
疗。男性 36例，女性 20例，年龄 30~81岁，中位年龄 57岁；
管状腺癌 36例（高分化 16例，中分化 12例，低分化 8例），
乳头状腺癌 8例，黏液腺癌 12例；低级别 36例，高级别 20
例；其中 34例无淋巴结转移，22例有淋巴结转移；Duke′s A
期 11例，B期 23例，C期 19例，D期 3例。每例新鲜标本分
为两部分，一部分用于药敏试验；另一部分石蜡切片用于免
疫组织化学染色检查相关基因的表达情况。同时取距癌组织
5 cm以上的远切端正常组织作为对照，经常规苏木素-伊红
（HE）染色确定有转移的 22例淋巴结连续切片用于免疫组织
化学染色检查相关基因的表达情况。
1．2 方法
1．2．1 肿瘤细胞培养：无菌条件下取手术根治切除的新鲜大
肠癌组织约 1 g，直径 1 cm3大小放入含 10％胎牛血清的达
氏修正依氏培养基（DMEM）培养液的小瓶内，立即于超净工
作台中制备单细胞悬液，并将单细胞悬液种于 96孔培养板
中（180 μl/孔），设空白对照组（培养液＋化疗药液）、细胞对照
组（肿瘤细胞＋培养液）、实验组（肿瘤细胞＋化疗药液），实验
组药物分低、中、高 3个浓度 6个复孔，每孔加药 10 μl，细胞
对照组各孔不加化疗药物。试验药物 5-FU以 0.9%氯化钠注
射液配制成人体内国际用血浆峰浓度 22．5 μg/ml，4 倍 PPC
90 μg/ml，10倍 PPC 225 μg/ml 3种浓度为试验浓度。将 96
孔培养板在 5％CO2、37 ℃培养箱中培养 48 h，每孔加入噻唑
蓝（MTT）应用液孵育 4 h 后，加二甲基亚砜（DMSO）终止反
应，摇匀，用酶标仪测定每孔吸光度（A）值（测定波长 490
nm）。
1．2．2 免疫组织化学染色方法：新鲜标本常规 10％中性甲醛
固定、石蜡包埋、连续切片，采用 PV6000通用型二步法，二氨
基联苯胺（DAB）显色进行 DPD相关抗原的免疫组织化学染
色，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，鼠抗人 DPD
单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1．3 结果判断
分别计算出对照组与实验组的 A值均数，按如下公式可
计算出被测化疗药物对肿瘤细胞的抑制率，公式：抑制率＝
［（对照组平均 A值-实验组平均 A值）/（对照组平均 A值-
空白对照组平均 A值）］×100％。按照实体瘤体外敏感标准抑
制率≥30％定为敏感，＜30％定为耐药。
免疫组织化学结果判定：参照 Fromowitz等综合计分法，
由阳性着色细胞所占百分数与细胞着色强度二者结合起来
计算。阳性细胞百分数为 10个视野阳性细胞的平均数占这
10个视野中细胞数的百分比：＜5％计 0分；5％～25％计 1分；
26％～50％计 2分；51％～75％计 3分；＞75％计 4分。细胞着色
强度：不着色计 0分；淡黄色计 1分；棕黄色计 2分；棕褐色
计 3分。二者积分相加：0～1分为阴性，≥2分为阳性。
1．4 统计学处理
利用 SPSS 13．0 软件进行统计学处理，药物对不同临床
病理组的抑制率比较、不同临床组的基因表达比较、不同表
达组的抑制率比较采用 χ2检验，药物对细胞生长的抑制率与
癌细胞中基因表达的相关性应用 Spearman相关分析，P＜0．05
为差异有统计学意义。
2 结 果
二氢嘧啶脱氢酶在大肠癌的表达及其与 5-氟尿嘧啶
化疗敏感性的研究
司志英 王长征 靳 英
DOI：10.11655/zgywylc2013.05.014
作者单位：034000 忻州职业技术学院医学系检验教研室 （司志
英、王长征）；忻州市人民医院病理科（靳英）
导作用具有时间及浓度依赖性，高浓度组细胞培养 48 h后凋
亡率显著高于同一时间段其他组细胞。本实验初步探讨禹州
漏芦含药血清诱导人多发性骨髓瘤 U266 细胞株凋亡的作
用，为临床应用禹州漏芦治疗多发性骨髓瘤提供理论依据。
但禹州漏芦是否是通过阻断聚集体通路实现抗骨髓瘤作用？
对其他骨髓瘤细胞株及耐药细胞株是否具有抑制增长作用？
我们将进一步对禹州漏芦含药血清诱导骨髓瘤细胞凋亡的
机制进行实验研究。
参 考 文 献
［1］ 韦中玲，汪兴洪．NF-κB在多发性骨髓瘤的研究进展．医学研究
杂志，2007，36（11）：98-101．
［2］ 杨佳，杨波，黄燕，等．多发性骨髓瘤形态学分型与临床特点及
预后分析．中国药物与临床杂志，2012，12（3）：313-315．
（收稿日期：2012-12-28）
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