全 文 :Vol. 35 高 等 学 校 化 学 学 报 No. 10
2014 年 10 月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2119 ~ 2123
doi:10. 7503 /cjcu20140089
禹州漏芦均一多糖的结构分析及其
硫酸化衍生物的抗补体活性
鲍 斌,王辉俊,王宏伟,施松善,王顺春
(上海中医药大学中药研究所,中药标准化教育部重点实验室,
中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室,上海 201203)
摘要 以禹州漏芦为原料,经沸水提取、乙醇沉淀、DEAE-Cellulose 和 SuperdexTM75 凝胶柱层析分离纯化,
得到一种水溶性的酸性均一多糖(EPS-2A). 采用单糖组成、甲基化及绝对构型等方法对其进行了结构解析.
结果表明,该均一多糖主要由 D-半乳糖醛酸组成,并含有少量的 Rha和 Ara. 该均一多糖经不同条件硫酸衍
生化后的衍生物(Sul-2A-1 和 Sul-2A-2)与阳性药肝素[CH50 =(103. 0 ± 9. 0)μg /mL(mean ± SD,n = 3),CH50
为出现 50%溶血时的样品浓度]相比,均表现出很强的抗补体活性[Sul-2A-1 的 CH50 =(74. 1 ± 4. 6)μg /mL;
Sul-2A-2 的 CH50 =(35. 7 ± 2. 8)μg /mL].
关键词 禹州漏芦;多糖;结构分析;硫酸衍生化;抗补体
中图分类号 O629. 12 文献标志码 A
收稿日期:2014-01-27. 网络出版日期:2014-09-15.
基金项目:国家自然科学基金(批准号:81373951)和重大新药创制专项(批准号:2012ZX09301001-003)资助.
联系人简介:王顺春,男,博士,研究员,博士生导师,主要从事糖化学和糖生物学研究. E-mail:shunchunwang@ 126. com
禹州漏芦为菊科植物蓝刺头(Echinops latifolius Tausch.)的干燥根,具有清热解毒、排脓止血和消
痈下乳等功效. 目前,从禹州漏芦中分离得到的化合物主要包括噻吩类、挥发油类、三萜类及甾体类
成分[1]. 对于多糖成分的研究,目前仅包括粗多糖的提取、单糖组分分析及含量测定[2],尚未见其均
一多糖的报道.
补体系统作为人体重要的免疫防御系统之一,在消灭外来微生物及维持机体的平衡等生理过程中
起着重要作用[3]. 然而,该系统的过度激活或非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应,造成正常
组织的损伤,参与多种疾病的病理过程,如类风湿性关节炎、老年性痴呆以及系统性红斑狼疮等[4],
因此此类疾病常以补体活性的变化作为一项重要的检测指标. 肝素是一种较成熟的补体抑制剂,是由
葡萄糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和 D-葡萄糖醛酸交替组成的硫酸化多糖. 由于肝素具有很
强的抗凝血作用,限制了其在临床上作为补体抑制剂的应用. 近年来,研究者相继从天然中草药中提
取并分离得到一些高效、低毒的黄酮和三萜类等小分子和均一的大分子多糖类补体抑制剂[5,6],发现
其抗补体活性较好,且无抗凝血作用. 中药多糖通过硫酸化修饰提高其生物活性已经成为一种探索开
发新药的有效途径[7].
本文对天然中草药禹州漏芦进行提取,分离得到了一种均一多糖,经结构鉴定和硫酸衍生化获得
了具有良好的抗补体效果的硫酸化多糖,且不具有抗凝血副作用,具有广阔的应用前景.
1 实验部分
1. 1 试剂与仪器
禹州漏芦购自河南禹州,经鉴定为菊科植物蓝刺头的干燥根;乙醇、氯化钠、苯酚和硫酸均为国
产分析纯试剂,购自国药集团上海试剂有限公司;不同分子量的葡聚糖标准品(Mw = 5900,11800,
212000,404000,788000)购自 Shodex SHOWA DENKO公司;二乙胺基乙基纤维素(DEAE cellulose)购
自 Amersham Biosciences公司.
SuperdexTM75 凝胶柱(GE Healthcare);BS-100A型自动部分收集仪和 HL-2S型恒流泵(上海沪西分
析仪器厂有限公司);UV754N型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);高速冷冻离心
机(美国 BECKMAN公司);N-1001 EYELA型旋转蒸发仪;Ez Purifier纯化系统(苏州利穗科技有限公
司);Perk-Elmer IR 2000 型傅里叶变换红外光谱仪;Bruker AM-400 型核磁共振波谱仪;Agilent 1100 型
高效液相色谱仪;Agilent 7000 QQQ型气相色谱-质谱联用仪.
1. 2 实验过程
1. 2. 1 EPS-2A的提取、分离与纯化 取 5 kg禹州漏芦根置于提取罐中,加入 10 L 95%乙醇回流脱脂
2 h,挥发除去乙醇,加入 50 L蒸馏水煮沸提取 3 h,过滤,残渣加 50 L水再提取 2 次. 合并 3 次提取
液,浓缩、离心(4000 r /min)后取上清液,待冷却至室温,搅拌下加入3 倍体积的 95%乙醇,过夜. 将
醇沉物复溶于水中,透析 72 h,冷冻干燥后得到禹州漏芦粗多糖(EPS). 禹州漏芦粗多糖经蒸馏水溶
解后,经 DEAE纤维素柱层析,分别以蒸馏水及 0. 2,0. 5 和 2. 0 mol /L NaCl溶液洗脱,用苯酚-硫酸法
检测收集. 其中 0. 2 mol /L NaCl洗脱组分(EPS-2)再经 SuperdexTM75 凝胶柱纯化,用 0. 2 mol /L氯化钠
溶液洗脱,得到 EPS-2A.
1. 2. 2 EPS-2A的纯度及相对分子量测定 采用文献[8]方法测定 EPS-2A 的纯度及相对分子量,以
Agilent GPC软件计算其分子量.
1. 2. 3 单糖组成分析 参照文献[9]报道的还原水解法对 EPS-2A进行单糖组成分析.
1. 2. 4 糖醛酸含量测定及糖醛酸还原 取 30 mg多糖样品,分别参照文献[10,11]方法进行糖醛酸含
量测定及糖醛酸还原.
1. 2. 5 甲基化分析 由于含大量糖醛酸的多糖在 DMSO 中的溶解性极差,很难进行甲基化反应,因
此对糖醛酸还原后的样品进行甲基化. 取还原后的多糖样品,在放有 P2O5 的干燥器中真空干燥过夜.
加入 1 mL无水 DMSO,于 80 ℃油浴及搅拌下溶解 30 min,再参照文献[12]方法进行甲基化分析.
1. 2. 6 绝对构型测定 参照文献[13 ~ 15]方法进行绝对构型测定.
1. 2. 7 硫酸衍生化及硫酸基含量测定 参照文献[16]方法得到硫酸化衍生物,再参照文献[17]方法
进行硫酸化取代度的测定.
1. 2. 8 IR和 NMR测定 IR数据测定采用 KBr压片法;将 50 mg干燥样品溶于 2 μL丙酮(C3H6O)及
500 μL D2O中,于 70 ~ 80 ℃测定 NMR谱图.
1. 2. 9 抗凝血及抗补体活性分析 采用文献[5]方法进行抗凝血实验,采用文献[16]方法对硫酸化
后的多糖样品进行抗补体活性研究.
2 结果与讨论
2. 1 EPS-2A分离纯化
禹州漏芦粗多糖经 DEAE cellulose分别以蒸馏水及 0. 2,0. 5 和 2. 0 mol /L NaCl溶液洗脱分离后,
被依次分为 4 个部分:EPS-W,EPS-2,EPS-5 和 EPS-20,分别占洗脱量的 45%,24%,21%和 10% .
EPS-2 再经过 SuperdexTM75 凝胶柱进一步纯化得到 EPS-2A.
2. 2 纯度及分子量测定
采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对 EPS-2A 进行纯度及相对分子量测定. 多糖样品的 HPGPC
谱图仅有 1 个单一对称峰,表明其为均一多糖. 以不同分子量的葡聚糖为标准品,经 HPGPC软件测得
EPS-2A相对平均分子量为 1. 18 × 104 .
2. 3 单糖组成分析
采用 Stevenson等[9]报道的还原水解法,对单糖组成进行分析. 结果表明,EPS-2A主要由鼠李糖、
阿拉伯糖和半乳糖组成,三者的摩尔比为 1∶ 1∶ 1. 对 EPS-2A进行糖醛酸还原,还原后单糖组成分析结
果显示,其中鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为 1∶ 1∶ 11,表明还原后的样品主要由半乳糖组成,
仅含有极少量的鼠李糖和阿拉伯糖,结合13 C NMR 分析结果,进一步说明 EPS-2A 原糖主要由半乳糖
醛酸组成.
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2. 4 糖醛酸含量测定、糖醛酸还原及甲基化分析
采用文献[10]方法,测得 EPS-2A 样品中的半乳糖醛酸含量[(87. 8 ± 0. 5)%]很高,不利于甲基
化反应的进行,因此对 EPS-2A多糖样品采用文献[11]报道的方法进行糖醛酸还原反应 3 次,再对还
原后的多糖样品进行甲基化分析. GC-MS 结果表明,EPS-2A 只含有 2,3,6-Me3-Gal,而鼠李糖和阿拉
伯糖含量很少,故在甲基化中未显示出来. 由此可知,EPS-2A 半乳糖醛酸的连接方式为 1→4 连接的
直链.
2. 5 绝对构型测定
以标准 D型及 L 型 Gal 为参照的 GC-MS 结果显示,还原后的 EPS-2A 样品中只含有 D-Gal,说明
EPS-2A只含有 D-GalpA.
2. 6 硫酸衍生化及硫酸基含量测定
由表 1 可见,得到 2 个硫酸化衍生物(按硫酸化试剂中加入氯磺酸的体积比分别命名为 Sul-2A-1
和 Sul-2A-2),Sul-2A-1 和 Sul-2A-2 的取代度分别为 0. 49 和 1. 64.
Table 1 Reaction conditions of preparation of each sulfated derivatives
Sample V(Pyridine)∶ V(Chlorosulfonic acid) Reaction temperature /℃ Reaction time /h
Sul-2A-1 1∶ 1 20 3
Sul-2A-2 1∶ 2 20 3
2. 7 IR分析
多糖样品硫酸化后,在红外光谱的指纹区可见 S O(1257 cm -1)和 C—O—S(830 cm -1)2 个特
征吸收峰[18],表明 Sul-2A-1 和 Sul-2A-2 均为硫酸化多糖;Sul-2A-2 中 2 个特征吸收峰的峰高明显高于
Sul-2A-1,与硫酸基含量测定结果相符.
2. 8 NMR分析
参照文献[19 ~ 21]结果,由 EPS-2A 的13 C NMR 图谱(见本文支持信息)可见,位于 δ 177. 0 的低
场信号归属于 1→4 链接的 GalpA的 C6;δ 172. 3 和 54. 3 信号表明有部分 GalpA的 6 位羧基被甲酯化;
在异头碳区域 δ 100. 4 信号归属于 1,4-α-GalpA 的 C1;δ 79. 4,72. 5,70. 1 及 69. 3 信号分别归属于
1,4-α-GalpA的 C4,C5,C3 和 C2. 根据13C NMR图谱的化学位移[21,22]可知,硫酸基团取代在 C2 和 C3
上. 硫酸化产物 Sul-2A-2 的 C2 和 C3 分别从 δ 69. 3 和 70. 0 向低场移动到 δ 71. 8 和 73. 1. 同时,C2 上
的硫酸取代基团使异头碳信号从 δ 100. 0 ~ 101. 7 向高场移动到 δ 97. 3 ~ 95. 4. C3 硫酸化使 C4 信号从
δ 78. 9 ~ 79. 2向高场移动到 δ 76. 0 ~ 77. 6. 而 δ 74. 1 为硫酸化产物 C5 的信号.
Fig. 1 Anticomplement activity(A)and effects on clotting system(B)of Sul-2A-1 and
Sul-2A-2(mean ± SD,n =3)
(B)Concentration of Heparin:5. 2 μg /mL;concentration of Sul-2A-1 and Sul-2A-2:1500 μg /mL;
**P < 0. 01,***P < 0. 001,compared with the blank group.
2. 9 抗凝血及抗补体活性分析
补体经典途径结果如图 1(A)所示,Sul-2A-1[CH50 =(74. 1 ± 4. 6)μg /mL]和 Sul-2A-2[CH50 =
(35. 7 ± 2. 8)μg /mL]表现出很强的抗补体活性,且 CH50值{溶血抑制率计算公式:Inhibition of lysis
1212No. 10 鲍 斌等:禹州漏芦均一多糖的结构分析及其硫酸化衍生物的抗补体活性
(%)=[1 -(ODsample - ODsample control)/OD]× 100%}均明显低于阳性对照肝素组[CH50 =(103. 0 ± 9. 0)
μg /mL],表明硫酸化后的多糖样品的抗补体活性要优于肝素钠,且 Sul-2A-2 的抗补体活性比 Sul-2A-1
高. 肝素被广泛用于补体抑制剂[23],然而抗凝血作用限制了其在临床上的应用. 抗凝血实验结果如
图 1(B)所示,与空白对照相比,Sul-2A-1 和 Sul-2A-2 并未表现出抗凝血作用,但肝素(5. 2 μg /mL)的
抗凝作用明显. 与空白组相比,肝素能显著地延长复钙时间[Rt =(167. 7 ± 4. 6)s]和凝血酶时间[Tt =
(192. 0 ± 10. 6)s],而 Sul-2A-1 和 Sul-2A-2 即使在高剂量(1500 μg /mL)下,对复钙时间和凝血酶时间
也没有影响.
3 结 论
EPS-2A是一种新发现的禹州漏芦酸性多糖,相对分子量为 11800,主要由 α-D-1,4-GalpA 组成.
与阳性对照药肝素相比,硫酸化后的产物 Sul-2A-1 和 Sul-2A-2 表现出很强的抗补体活性,而 EPS-2A
本身并未表现出抗补体活性,表明硫酸基团在 Sul-2A-1 和 Sul-2A-2 的抗补体活性上发挥很重要的
作用.
支持信息见 http:/ /www. cjcu. jlu. edu. cn /CN /10. 7503 /cjcu20140089.
参 考 文 献
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Structural Characterization of One Homogeneous Polysaccharide from
Echinops latifolius Tausch. and Anti-complementary
Activity of Its Sulfated Derivatives
BAO Bin,WANG Huijun,WANG Hongwei,SHI Songshan,WANG Shunchun*
(Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines,Ministry of Education,Key Laboratory for New Resources and
Quality Evaluation of Chinese Medicines of SATCM,Institute of Chinese,Institute of Chinese Materia Medica,
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China)
Abstract To isolate and characterize the anti-complementary polysaccharide from the root of Echinops
latifolius Tausch.,bioactivity-guided fractionation and purification was used to obtain the anti-complementary
polysaccharide from the hot-water extract of the root of Echinops latifolius Tausch. The polysaccharide was
characterized by various chemical and spectral analyses. The anti-complementary activities were evaluated by
hemolytic assay in vitro. The action targets were identified in the system with individual complement-depleted
sera. A homogenous water-soluble polysaccharide(EPS-2A)was obtained from Echinops latifolius Tausch.,
which average molecular weight was estimated to be 118000. A combination of monosaccharide composition,
methylation and configuration analysis,as well as NMR spectroscopy,indicated that EPS-2A was poly-(1-4)-
α-D-galactopyranosyluronic acid in which (87. 8 ± 0. 5)% of uronic acid existed as methylester. Two sulfated
derivatives(Sul-2A-1 and Sul-2A-2) from EPS-2A were prepared after sulfation with 1 ∶ 1 and 2 ∶ 1 of
chlorosulfonic acid and pyridine,respectively. The anti-complementary assay showed that Sul-2A-1 and
Sul-2A-2 demonstrated a stronger inhibitory effect[CH50 =(74. 1 ± 4. 6)μg /mL for Sul-2A-1;CH50 =(35. 7
± 2. 8)μg /mL for Sul-2A-2]on the complement activation through the classic pathway,compared to that of
heparin[CH50 =(103. 0 ± 9. 0)μg /mL]. The results suggested that the sulfated derivatives Sul-2A-1 and
Sul-2A-2 might be promising drug candidates in case of necessary therapeutic complement inhibition.
Keywords Echinops latifolius Tausch.;Polysaccharide;Structure analysis;Sulfated derivative;Anti-
complement
(Ed.:P,H,N,K)
Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 81373951)and the Key New Drug Creation and Manufacturing Program
of China(No. 2012ZX09301001-003).
3212No. 10 鲍 斌等:禹州漏芦均一多糖的结构分析及其硫酸化衍生物的抗补体活性