全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2007年 6月, 29(6): 745―750
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告

收稿日期: 2006−08−25; 修回日期: 2006−11−01
基金项目: 国家自然科学基金项目(编号: 30370902)和 SRT计划资助[Supported by National Natural Science Foundation of China (No.30370902) and SRT
Plan of NAU]
作者简介: 姜淑慧(1982−), 女, 硕士, 专业方向: 作物遗传育种。E-mail: jsh1982@eyou.com
通讯作者: 管荣展(1964−), 男, 博士, 专业方向: 油菜遗传育种。E-mail: guanrzh@njau.edu.cn
DOI: 10.1360/yc-007-0745
甘蓝型油菜与蔊菜的原生质体融合与植株再生
姜淑慧, 管荣展, 唐三元, 忻如颖, 张红生, 赵立茜, 潘琴燕
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 南京 210095
摘要: 以甘蓝型油菜下胚轴和蔊菜叶片为外植体提取原生质体, 采用 PEG-高 pH、高 Ca2+附加 DMSO的原生质
体融合方法, 用液体浅层静置培养融合体, 获得了 10株融合杂种, 观察了杂种形态学和细胞学。结果表明：1%
纤维素酶+0.2%离析酶+3 mmol/L MES 酶解 14 h 可获得较高产率的油菜原生质体, 0.25% 纤维素酶+0.5%离析
酶+5 mmol/L MES 酶解 12 h 可获得较高产率的　菜原生质体; 30% PEG + 0.3 mol/L 葡萄糖+50 mmol/L
CaCl2•2H2O +15%DMSO的融合条件下, 获得了 10.4%的融合率; 实验所获的原生质体融合材料可作为新种质。
关键词: 甘蓝型油菜; 　菜; 原生质体融合; 原生质体培养
Somatic hybrids between Rorippa indica (Linn.) Hiern and Brassica
napus L. through protoplast-fusion system
JIANG Shu-Hui, GUAN Rong-Zhan, TANG San-Yuan, XIN Ru-Ying,
ZHANG Hong-Sheng, ZHAO Li-Qian, PAN Qin-Yan
State Key Lab of Crop Genetics and Germpalsm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: High yield of protoplast isolation was achieved from hypocotyls of B. napus L. and leaves of Rorippa indica
(Linn.) Hiern. The isolated protoplasts were used to establish an efficient protoplast-fusion system between the two cruci-
ferous species by PEG-DMSO method and culturing with MS liquid medium. Ten somatic fusion hybrids between B. napus
and R. indica were obtained. The enzyme combinations for isolating protoplast from B. napus L. and R. indica were 1%
cellulase + 0.2% macerozyme + 3 mmol/L MES and 0.25% cellulase + 0.5% macerozyme + 5 mmol/L MES, respectively.
Fusion percentage of 10.4% was obtained on the condition of 30% PEG + 0.3 mol/L glucose +50 mmol/L CaCl2·2H2O +
15% DMSO. Seeds plants obtained from protoplast fusion are new germplasm derived from R. indica.
Keywords: Brassica napus L.; Rorippa indica (Linn.) Hiern; protoplast fusion; protoplast culture
原生质体融合能够在细胞水平上进行种内(间)、
属间甚至科间[1～5]的远缘体细胞杂交,可将野生种的
性状转移到栽培种中。　菜(Rorippa indica (Linn.)
Hiern)为十字花科　菜属一年生植物 , 具有油菜中
不具备“无喙”性状, 还具有抗旱、耐渍、耐瘠薄、
抗菌核病、结实率高等优异性状[6] , 本研究试图通

过原生质体融合, 为将　菜特异特性转移到甘蓝型
油菜中提供材料基础。尽管油菜原生质体培养及融
合成功的事例报道较多[7～11], 但还未见油菜与　菜
原生质体融合的报道。本文报道了甘蓝型油菜和　
菜原生质体融合培养技术体系的建立、再生植株的
获得。
DOI:10.16288/j.yczz.2007.06.016

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1 材料和方法
1.1 材料
甘蓝型油菜(NJ5280)和　菜江苏野生种。
1.2 　菜和甘蓝型油菜无菌苗的获得
分别将甘蓝型油菜和　菜的种子经 70%乙醇表
面消毒 30 s, 然后用 0.1% HgCl2溶液灭菌处理 15
min, 用无菌水冲洗 3~5 次, 滤纸吸干后接种到无激
素 MS培养基上, 置培养室发芽。
接种后的甘蓝型油菜种子经 15℃暗处理 4 d后
转入弱光室温下培养 1～3 d, 待苗高约 4～5 cm时,
取其下胚轴提取原生质体; 　菜长出 7～9 片叶时,
取其叶片(4℃处理 24 h)提取原生质体。
1.3 质壁分离液、清洗液、酶解液、融合液和培养
基的制备
质 壁 分 离 液 和 原 生 质 体 清 洗 液 分 别 为
CPW-13M 和 CPW-10M、CPW-9M 即 CPW 溶液附
加 13%和 10%、9%的甘露醇, pH值为 5.8, CPW溶
液成份 27.2 mg/L H2PO4、101 mg/L KNO3、246 mg/L
MgSO4·7H2O、0.16 mg/L KI、0.025 mg/L CuSO4·
5H2O、1480 mg/L CaCl2·2H2O。酶解液为 CPW-9M、
CPW-10M 附加纤维素酶、离析酶和 MES, pH 值为
5.6。融合液为聚乙二醇(PEG)溶液附加 0.3 mol/L葡
萄糖、50 mmol/L的 CaCl2·2H2O、DMSO, pH值为
10.5。
本实验中 MS 基本培养基用于原生质体的培
养、愈伤组织的分化以及植株再生, 其激素配比见
表 1。所有试剂及原生质体培养基、稀释培养基均
经 0.22 µm 微孔滤膜抽滤灭菌, 增殖、分化和生根
培养基为高温高压灭菌, 所有培养基 pH 值调整为
5.8。
1.4 原生质体制备、融合及培养
1.4.1 原生质体制备
取经过预处理的甘蓝型油菜无菌苗下胚轴(　
菜无菌苗叶片), 切成 1~2 mm的小段加入 CPW-13M
溶液, 质壁分离 30 min(1 h)后, 转入酶解液中于摇
床上轻摇(30 r/min)酶解(室温黑暗); 酶解后用 45 µm
孔尼龙网过滤酶解分离的原生质体; 滤液于 10 mL
离心管中 500 r/min 下离心 5 min, 吸除上清, 加入
CPW-9M溶液(CPW-10M), 离心清洗 5 min, 弃上清,
重复 2 次; 最后用原生质体培养基离心清洗 1 次,即
可获得纯净的甘蓝型油菜(　菜)原生质体。0.1 mm
血球计数板计数原生质体产量, 0.01% FDA 检验原
生质体活力。原生质体活力=(发黄绿色荧光的原生
质体数/观察的原生质体总数)×100%。
1.4.2 原生质体融合与培养
将纯化后的油菜和　菜原生质体调整为等密度
后, 等比例在离心管中混匀(各约 0.5 mL), 然后加
入 0.5 mL融合液静置融合。融合后, 加入 50 mmol/L
CaCl2·2H2O溶液离心清洗 PEG, 弃上清液, 然后用
原生质体培养基离心清洗 1 次, 离心速度、离心时
间同上。用原生质体培养基悬浮融合后的原生质体,
根据油菜下胚轴原生质体较大、叶绿体含量少、颜
色浅, 　菜叶片原生质体较小、叶绿体含量高、颜
色较深, 能从形态上明显区别融合原生质体, 用显
微操作仪挑取完全融合的融合原生质体 200 个, 悬
浮在 20 mL 原生质体培养基中, 进行液体浅层培
养。液体培养阶段, 每隔 7 天添加一次不同的新鲜
液体培养基, 第 8 天添加 1 次原生质体培养基, 第
15天和第 22天时添加分别添加稀释培养基 1、稀释
培养基 2, 每次约加 0.5 mL。前 3周暗培养, 3周后
将培养物置于弱光下培养。
1.5 愈伤组织分化与植株再生
当出现肉眼可见愈伤组织时, 将其转移至增殖
培养基上弱光培养, 长至约 5 mm时, 转移至分化培
养基上光照培养; 分化出不定芽后, 将其连同愈伤
组织一起转至无激素的MS培养基中培养, 长至 2~3
cm 时, 切下无根苗移入生根培养基中生根; 待再生
植株长出约 10~15 条次生根时取出再生植株移栽,
经 2~3个星期的炼苗后, 移至田间。
1.6 形态学观察
从苗期至成熟期 ,对属间体细胞融合杂种的长
势、长相等进行形态学观察。
1.7 细胞学观察
花蕾期, 取减数分裂旺盛的合适的幼蕾, 用卡
诺氏固定液固定处理 24 h 后, 转入 70%酒精, 储藏
于 4℃冰箱中备用。将花药从中部切断, 用镊子轻轻
挤压出花粉母细胞, 改良苯酚品红染色液染色、涂
片, 进行花粉母细胞减数分裂观察。

第 6期 姜淑慧等: 甘蓝型油菜与蔊菜的原生质体融合与植株再生 747


表 1 培养基的激素配比
Table 1 Media with different plant growth regulators
培养基 Medium 6-BA (mg/L)
2.4-D
(mg/L)
NAA
(mg/L)
IBA
(mg/L)
Glucose
(mmol/L)
Hydrolyzed
casein (g/L)
MES
(mmol/L)
Sucrose
(%)
Agar
(g/L)
原生质体培养基
Protoplast medium
2.0 0.2 0.2 0.6 5
稀释培养基 1
Diluting medium 1
2.0 0.1 0.1 0.4 5 1.0
稀释培养基 2
Diluting medium 2
2.0 0.1 0.2 5 2.0
增殖培养基
Proliferating medium
2.0 0.1 5 3.0 6.0
分化培养
Shooting medium
2.0 0.1 0.25 3.0 5.6
生根培养
Rooting medium 0.1 0.1 3.0 5.6

2 结果与分析
2.1 酶解条件对原生质体分离效果的影响
酶种类、浓度及酶解时间均会影响原生质体的
产率和质量, 酶液及时间不同处理对甘蓝型油菜和
　菜原生质体分离效果的影响如表 2 所示。由表 2
可知：纤维素酶和离析酶配合使用, 原生质体的产
率较高, 当其中的一种酶单独使用时, 均不能获得
此效果。除了酶种类, 酶浓度和酶解时间对于获得
高产率的原生质体也有较大影响, 酶解时间过短酶
浓度过低 , 酶解均不充分 , 影响产率和质量 ; 但酶
解时间过长浓度过大, 原生质体产率和质量也会随
之下降, 出现破碎现象。实验结果表明：1%纤维素
酶+0.2%离析酶+3 mmol/L MES 酶解 14 h(即处理
VI)适合油菜高产量原生质体的分离; 0.25%纤维素
酶+0.5%离析酶+5 mmol/L MES 酶解 12 h(处理 V)
是适合获得高产量　菜叶片原生质体。
2.2 不同 PEG浓度以及 DMSO对融合率的影响
本实验在 PEG-高 pH、高钙的化学融合方法的
基础上附加二亚基甲砜(DMSO)。未加 DMSO之前,
融合率随着 PEG浓度的增加而提高, 分别为 0.3%、
1.6%、4.0%、6.4%、8.2%, 但 PEG浓度高于 30%时,
原生质体高度聚集, 减少了异质原生质体的融合机
率, 融合率随之下降(融合率为 6.7%), 30%PEG+0.3
mol/L葡萄糖+50 mmol/L CaCl2·2H2O为适宜处理,
获得了 8.2%的融合率(图 1)。
为了提高融合率, 在 30%PEG 中加入浓度分别
为 0%、5%、10%的 DMSO, 其融合率分别为 8.2%、
8.8%、9.5%, 当 DMSO 浓度为 15%时, 融合率提高
到 10.4%, 由此可见, DMSO能够明显地提高融合率,
但当DMSO浓度高于 15%, 融合率又呈下降趋势(融
合率为 8.4%), 见图 2。结果显示：30%PEG+0.3 mol/L
葡萄糖+50 mmol/ L CaCl2·2H2O附加 15%的 DMSO
为所设处理中的最佳处理。由此认为, DMSO的使用
对于提高融合率有促进作用。
2.3 形态学特征以及细胞学观察
实验共获得 10株再生植株(图 3)。移至田间后,
幼苗在形态上偏　菜(图 4: A), 全部植株表现为生
长缓慢、生长势相对较弱; 叶片缺刻较多, 叶缘裂痕
表 2 酶种类、酶浓度和酶解时间对甘蓝型油菜和蔊菜原生质体产量的影响
Table 2 Effects of combination, concentration, and treatment duration of enzymes for protoplast isolation of B.napus L. and R.indica
(Linn.) Hiern
处理 Treament 材料
Material
酶解条件
Enzyme condition Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ
纤维素酶(%) Cellulase 0 0.2 0.8 0.8 1.0 1.0 1.2 1.2
离析酶(%) Macerozyme 0.2 0 0 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2
MES (mmol/L) 3 3 3 3 3 3 3 3
酶解时间(h) Incubation time 16 16 16 14 14 14 16 16
甘蓝型油菜
B.napus L.
产量(个/gFW) Protoplast yield <104 <104 105 1.5×105 5×105 106 5×105 2×105
纤维素酶(%) Cellulase 0.1 0 0.1 0.25 0.25 0.5 0.75 0.75
离析酶(%)Macerozyme 0 0.2 0.2 0.25 0.5 0.5 0.5 0.75
MES (mmol/L) 5 5 5 5 5 5 5 5
酶解时间(h) Incubation time 10 10 10 12 12 12 14 14
　菜
R.indica (Linn.)
Hiern
产量(个/gFW) Protoplast yield <104 <104 5×105 106 3×106 <106 5×105 105

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图 1 PEG浓度对融合率的影响
Fig. 1 Effects of PEG concentration on fusion frequency


图 2 DMSO浓度对融合率的影响
Fig. 2 Effects of DMSO concentration on fusion frequency


图 3 甘蓝型油菜与蔊菜原生质体融合及植株再生
A: 融合的原生质体; B: 融合的原生质体; C: 增殖培养形成的愈伤组织; D: 愈伤组织分化出小苗; E: 再生植株; F: 盆栽苗。
Fig. 3 Plant regeneration from fused protoplasts between B.napus and R.indica
A: Fusing protoplast; B:Fused protoplast; C:Calli formed on the proliferation medium; D:Shoot regenerated from enlarged calli;
E:Regenerated plantlet; F:Plant growing in the pot.



图 4 甘蓝型油菜与蔊菜原生质体融合杂种植株
A: 苗期杂种; B: 抽薹杂种。
Fig. 4 Intergeneric fusion hybrids between B.napus and R.indica in the field
A: Hybrid at seedling stage; B: Hybrid at shooting stage.

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较深(图 4: B); 开花较晚, 花较小。杂种植株成熟较
晚 , 为丛生型 , 角果有短喙 , 不同于　菜的无喙特
征, 长度介于两亲本之间(图 5)。对杂种植株的株高、
丛生枝数、角果长度、每角果粒数进行了考种, 结
果如下：杂种植株平均高度为 107.6 cm, 平均丛生
枝为 13.3 个, 角果平均长度为 3.7 cm; 每角果结实
不均, 且有空角果出现, 平均每角果粒数为 7.8 个;
种子有的圆滑, 有的干瘪, 大小不整齐。
杂种花粉母细胞经染色、涂片后, 其染色体减
数分裂行为见图 6。分裂中期 I(MⅠ), 染色体配对不
正常, 有偏离赤道板的单价体出现(图 6: A-C); 分裂
后期 I (AⅠ), 同源染色体分离正常, 分别移向两极,
但存在着染色体丢失, 有落后染色体存在(图 6: D-F);
分裂后期Ⅱ(AⅡ), 能形成正常的四分体, 但仍存在
染色体丢失现象(图 6: G-I)。甘蓝型油菜染色体为 2n
= 38, 　菜染色体为 2n=32, 从杂种花粉母细胞的减
数分裂结果可以看出 , 杂种的染色体数数量不等 ,
但多于亲本(图 6: D-F)。





图 5 体细胞融合杂种成熟期角果与亲本的对比
左: 　菜; 中: 杂种; 右: 油菜。
Fig. 5 Silique comparison of hybrid with itsparents
Left: R indica; Middle: Hybrid; Right: B. napus.



图 6 杂种植株花粉母细胞减数分裂行为
A～C: 花粉母细胞减数第一次分裂中期; D～F: 花粉母细胞减数第一次分裂后期; G~I: 花粉母细胞减数第二次分裂后期。
Fig. 6 Meiotic chromosome behavior in PMCs of hybrid
A-C: PMCs MI; D-F: PMCs AI; G-I: PMCs AII.

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3 讨 论
　菜是一种很有开发和利用价值的野生植物资
源, 具有良好的抗(耐)性、高结实率、角果无喙等特
点, 种子中还含有　菜素, 是一种药用植物。属间物
种性状差异大 , 特点突出 , 但难度也较大 , 为获得
高质量的原生质体, 本实验对外植体进行了预处理,
使分离到的原生质体大小相对均匀、胞质丰实、产
率高、质量好。液体培养阶段, 每次添加不同的新
鲜培养基, 减轻了酚类对培养材料的毒害作用, 避
免了褐化物质在培养基中的积累, 保证了细胞的正
常分裂、增殖, 整个培养阶段未出现褐化现象。
体细胞融合杂种移栽到大田后 , 表现出缓慢
的、相对较弱的生长势, 在叶型、叶片缺刻、叶缘
裂痕、表现出　菜特征, 熟期较晚, 结实率低、出现
空角果; 杂种花粉母细胞减数分裂不正常, 有染色
体丢失现象存在, 染色体数多于亲本; 形态学和细
胞学观察的结果可以确定通过原生质体融合获得的
再生植株为杂种。
本研究建立了甘蓝型油菜与　菜的原生质体融
合培养技术体系, 探索了影响原生质体分离、融合、
培养的因素, 获得了再生植株。植株从形态、细胞
学可以确定为属间体细胞杂种, 为进一步的分子细
胞遗传研究提供了基础, 生物学鉴定工作需深入进
行。
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