全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１６（０６）：９２～９９
第一作者简介：赵乐（１９８３－），男，博士，讲师，现主要从事药用植物
分子生物学等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｌｅ１９８３＠１２６．ｃｏｍ．
责任作者：郑晓珂（１９６１－），女，博士，教授，博士生导师，现主要从
事中药活性成分及作用机制等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｘｋ．２００６
＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：国家重点基础研究发展计划“９７３计划”资助项目
（２０１３ＣＢ５３１８０２）；河南中医学院博士科研基金资助项目（ＢＳＪＪ２０１１－
０７）。
收稿日期：２０１５－１２－１６
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６０６０２３
独行菜ＬａＳＰＳ基因的克隆与
生物信息学分析及原核表达
赵 乐１，２，马 利 刚１，２，韩 杜 菀１，冯 卫 生１，２，郑 晓 珂１，２
（１．河南中医学院 药学院，河南 郑州４５００４６；２．呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心 河南 郑州４５００４６）
摘 要：以独行菜（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ａｐｅｔａｌｕｍ）幼苗叶片为试材，采用ＰＣＲ方法，扩增得到ＬａＳＰＳ
基因的开放阅读框（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），构建ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ原核表达载体并在大肠杆菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中表达ＬａＳＰＳ重组蛋白。结果表明：ＬａＳＰＳ基因ＯＲＦ长１ ２６９ｂｐ，编码４２２个
氨基酸，包含茄呢醇焦磷酸合酶结构域，是异戊烯基合成酶家族的成员；序列分析发现，ＬａＳＰＳ蛋
白定位于叶绿体中，不含信号肽没有跨膜区；通过序列比对和系统进化分析，显示ＬａＳＰＳ蛋白与
拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＳＰＳ２蛋白相似度为９１％，亲缘关系最近；在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
菌株中成功表达ＬａＳＰＳ重组蛋白，为研究ＬａＳＰＳ基因在独行菜质体醌生物合成途径中的功能奠
定了基础。
关键词：独行菜；茄呢醇焦磷酸合酶；基因克隆；序列分析；原核表达
中图分类号：Ｒ ２８２．７１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１６）０６－００９２－０８
质体醌（ｐｌａｓｔｏｑｕｉｎｏｎｅ，ＰＱ）和泛醌（ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ，ＵＱ）
是植物体内主要２种含有异戊二烯基侧链的醌类，它们
作为电子载体参与多种生化反应［１］。质体醌存在于叶
绿体中，是光合电子传递链的组成成分，参与电子从光
系统ＩＩ传递到细胞色素ｂ６ｆ复合体，是植物光合作用不
可缺少的重要部分，而泛醌存在于线粒体中，是呼吸电
子传递链的组成成分，参与电子从ＮＡＤＨ脱氢酶复合
体传递到细胞色素ｂｃ１ 复合体，是生物氧化过程不可缺
少的成员［２－３］。质体醌和泛醌都含有的异戊烯基侧链，
是苯醌的衍生物，不同物种的质体醌和泛醌含有不同长
度的异戊烯基侧链。大多数植物的质体醌和泛醌都含
有９或１０个异戊烯基单位的侧链，如在拟南芥中含有
ＰＱ－９和ＵＱ－９［４］。
质体醌和泛醌的异戊烯基侧链来源于异戊烯基
焦磷酸（ＩＰＰ）和它的异构体二甲基烯丙基焦磷酸
（ＤＭＡＰＰ）。在植物中ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ主要由存在于细
胞质中的甲羟戊酸途径（ｍｅｖａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｐａｔｈｗａｙ，ＭＶＡ
ｐａｔｈｗａｙ）和存在于质体中的甲基赤藓糖醇磷酸途径
（ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｉｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ，ＭＥＰ ｐａｔｈｗａｙ）来
合成［５］。同位素标记试验显示泛醌的异戊烯基侧链来
源于ＭＶＡ途径生成的ＩＰＰ，而质体醌的异戊烯基侧链
则来源于 ＭＥＰ途径生成的ＩＰＰ［６－７］。异戊烯基侧链从
ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ开始合成，先形成较短的异戊烯基链，如
１５碳的法呢基焦磷酸（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＦＰＰ）和２０碳
的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，
ＧＧＰＰ），然后由一系列多聚异戊烯基焦磷酸合成酶
（ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）催化，这些酶都具有异
戊烯基转移酶（ｐｒｅｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）的活性，以ＩＰＰ为单
位，每次延伸５个碳原子。这些多聚异戊烯基焦磷酸合
成酶已在不同的微生物中被克隆，从原核生物细菌到真
核生物酵母，但是在高等植物中对这些多聚异戊烯基焦
磷酸合成酶还研究较少［８－１０］。目前仅在拟南芥、水稻和西
红柿克隆得到了茄呢醇焦磷酸合酶（ｓｏｌａｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＰＳ），用来合成４５碳的茄呢醇焦磷酸，进一步
合成质体醌ＰＱ－９［１，１１－１２］。
独行菜（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ａｐｅｔａｌｕｍ Ｗｉｌｄ．）属十字花科独
行菜属植物，其种子称为北葶苈子，是泻肺平喘、利水消
肿的重要中药［１３］。现已从独行菜中分离得到多种化学
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北方园艺２０１６（０６）：９２～９９ ·生物技术·
成分，有强心苷、异硫氰酸和硫苷类、脂肪油类、生物碱
类、黄酮类、酚酸类、香豆素类、类萜类等，其药理作用有
改善心血管功能、细胞毒活性、止咳平喘、利尿等［１３］。目
前独行菜方面的研究多集中于化学成分的分离和药理
作用的研究，关于光合作用中质体醌和电子传递链中泛
醌的研究尚鲜见报道。
根据课题组前期获得的大量独行菜转录组数据，其
中有一个注释为茄呢醇焦磷酸合酶（ＳＰＳ）的基因，该研
究首次从独行菜中克隆了ＳＰＳ基因的ｃＤＮＡ序列，进行
生物信息学分析，发现ＬａＳＰＳ蛋白可能定位在叶绿体，
参与质体醌的生物合成，然后将ＬａＳＰＳ基因克隆至原
核表达载体ｐＥＴ－３２ａ中，构建重组质粒ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ，
成功在大肠杆菌中表达ＬａＳＰＳ蛋白，为进一步研究
ＬａＳＰＳ基因在独行菜光合电子传递链组分质体醌生物
合成中的作用和功能奠定了基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
独行菜采自河南省伏牛山自然保护区，由河南中医
学院董诚明教授和谢晓龙博士鉴定为十字花科植物独
行菜属独行菜，取其种子在１６ｈ、２３℃光照，８ｈ、２０℃黑
暗条件，于人工气候箱中培养，采其幼苗叶片作为供试
材料。
植物总ＲＮＡ提取试剂盒、质粒小提试剂盒、普通
ＤＮＡ产物纯化试剂盒、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅⅠ、普通琼脂糖
凝胶ＤＮＡ回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公
司。反转录试剂盒ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔⅡＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、
大肠杆菌感受态细胞Ｔｒａｎｓ５α和ＢＬ２１（ＤＥ３）购自北京
全式金生物科技有限公司。Ｅｘ Ｔａｑ酶、限制性核酸内切
酶（ＥｃｏＲⅠ、ＸｈｏⅠ）、ｐＭＤ１９－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、Ｔ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ购自
ＴａＫａＲａ公司。引物合成、样品测序由北京三博远志生
物技术有限责任公司完成。
１．２ 叶片总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成
使用植物总ＲＮＡ提取试剂盒提取独行菜幼苗叶
片总ＲＮＡ，用ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００和１％琼脂糖凝胶电泳
检测ＲＮＡ的含量和完整性。以得到总ＲＮＡ为模板，
ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，使用反转录试剂盒，合成得到叶片
ｃＤＮＡ。
１．３ 独行菜ＳＰＳ基因克隆
根据课题组前期得到的独行菜转录组数据，用
Ｐｒｉｍｅｒ ５软件设计ＳＰＳ基因的特异性引物：ＬａＳＰＳ－
Ｅｘｐ－Ｆ（５′－ＣＧ ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＴＧＴ －３′，下
划线部分为ＥｃｏＲＩ酶切位点），ＬａＳＰＳ－Ｅｘｐ－Ｒ（５′－
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＣ－３′，下划线部分为
ＸｈｏⅠ酶切位点），以叶片ｃＤＮＡ为模板，按照下列条件进
行ＰＣＲ扩增：９５℃２ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，５３．４℃１５ｓ，７２℃
１ｍｉｎ ３６ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。经１％琼脂糖
凝胶电泳检测ＰＣＲ产物后，用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试
剂盒回收与预期大小一致的条带，然后将其连接到
ｐＭＤ１９－Ｔ载体上，转化大肠杆菌Ｔｒａｎｓ５α感受态细胞，
均匀涂布在含有氨苄青霉素的ＬＢ平板上，３７℃培养１２
ｈ后，经ＰＣＲ检测后挑选阳性克隆进行测序。
１．４ 独行菜ＳＰＳ基因的生物信息学分析
将测序得到的序列通过ＮＣＢＩ ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ查找开
放阅读框，并通过ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｐ与ｎｒ数据库进行序列比
对分析。ＬａＳＰＳ基因编码蛋白的理化性质预测采用
ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ提供的在线工具Ｐｒｏｔｐａｒａｍ；
使用ＩｎｔｅｒＰｒｏ Ｓｃａｎ预测蛋白的保守结构域；采用ＳＷＩＳＳ－
ＭＯＤＥＬ进行蛋白质的三维同源建模；使用ＳｉｎａｌＰ４．０
Ｓｅｒｖｅｒ进行分泌蛋白预测；利用Ｔａｒｇｅｔ Ｐ １．１Ｓｅｒｖｅｒ进
行蛋白定位信号预测；跨膜区预测通过ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ
ｖ．２．０；使用ＭＥＧＡ ５软件相邻连接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）
构建系统进化树。
１．５ 独行菜ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ原核表达载体的构建与诱
导表达
用ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ分别对测序正确的测序正确的
ｐＭＤ１９－Ｔ－ＬａＳＰＳ质粒和原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ进行双
酶切，１％琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收目的基因片
段和载体片段，回收后，用Ｔ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １６℃的过夜
连接，然后转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，均匀
涂布在ＬＢ固体平板（含有１００ｍｇ／Ｌ的氨苄青霉素），
挑取单克隆进行质粒的提取，然后用ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ双
酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒送北京三博远志公司
测序。
将测序正确的单克隆接种于含氨苄青霉素的ＬＢ液
体培养基中，３７℃培养过夜后，按照１∶１００比例接种
到含氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中，３７℃、２２０ｒ／ｍｉｎ
振荡培养至对数生长期（ＯＤ６００至０．６），然后在２８℃、
０．４ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ、１５０ｒ／ｍｉｎ条件下培养８ｈ，诱导独行
菜ＬａＳＰＳ重组蛋白的表达。诱导完成后，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
（５％浓缩胶和１０％分离胶）检测重组蛋白的表达。
２ 结果与分析
２．１ 独行菜ＬａＳＰＳ基因的克隆
由图１可知，ＰＣＲ扩增得到１条１ ２００ｂｐ左右的条
带，与预期大小相符。经测序后得到独行菜ＬａＳＰＳ基
因的ｃＤＮＡ序列，大小为１ ２６９ｂｐ，编码４２２个氨基酸，
ＬａＳＰＳ基因序列信息已提交到ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ，注册号
为ＫＴ３１８７３４。
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注：Ｍ，ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，ＬａＳＰＳ基因ＯＲＦ。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，ＯＲＦ ｏｆ ＬａＳＰＳｇｅｎｅ．
图１ ＰＣＲ扩增ＬａＳＰＳ基因ＯＲＦ
Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬａＳＰＳｇｅｎｅ ＯＲＦ
２．２ 独行菜ＬａＳＰＳ基因编码蛋白的生物信息学分析
２．２．１ 理化性质分析 ＬａＳＰＳ基因编码４２２个氨基酸残
基，通过ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ的在线软件Ｐｒｏｔｐａｒａｍ
预测ＬａＳＰＳ基因编码蛋白的分子式为Ｃ２０３３Ｈ３２９５Ｎ５５９Ｏ６３３
Ｓ２２，分子量是４６．４０ｋＤａ，等电点为５．１５，带负电残基 （Ａｓｐ
＋Ｇｌｕ）为５８，带正电残基数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为４７。该蛋白的
不稳定系数为４３．４９，说明ＬａＳＰＳ蛋白不稳定，亲水性系
数为－０．０５３，说明该蛋白为亲水性蛋白。ＬａＳＰＳ基因的
ｃＤＮＡ编码区序列及对应氨基酸序列如图２所示。
２．２．２ 保守结构预测 使用ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ预测的
ＬａＳＰＳ蛋白的保守结构域如下：多聚异戊烯基合成相关
酶（ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ）（ＩＰＲ０１７４４６）、多聚异戊
烯基合成酶（ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）（ＩＰＲ００００９２）、茄呢醇
焦磷酸合酶（ｓｏｌａｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＩＰＲ０１４１２０）、
异戊二烯合成酶结构域（ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｏｍａｉｎ）
（ＩＰＲ００８９４９）。
图２ ＬａＳＰＳ基因ｃＤＮＡ编码区序列及对应氨基酸序列
Ｆｉｇ．２ Ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＬａＳＰＳｇｅｎｅ ｃＤＮＡ
图３ ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ预测ＬａＳＰＳ蛋白的保守结构域
Ｆｉｇ．３ ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ
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２．２．３ 信号肽、亚细胞定位及跨膜区预测 利用
Ｓｉｇｎａｌ Ｐ４．１Ｓｅｒｖｅｒ预测ＬａＳＰＳ蛋白为非分泌蛋白，不
具有信号肽。利用在线软件Ｔａｒｇｅｔ Ｐ１．１Ｓｅｖｅｒ预测
ＬａＳＰＳ蛋白的亚细胞定位情况，结果表明ＬａＳＰＳ定位于
叶绿体中（图４），利用 ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０预测
ＬａＳＰＳ的跨膜区，结果表明 ＬａＳＰＳ蛋白无跨膜区
（图５）。
注：Ｌｅｎ表示序列长度，ｃＴＰ代表序列含有叶绿体转运肽，ｍＴＰ代表
序列含有线粒体靶向肽，ＳＰ代表序列含有分泌途径的信号肽，ｏｔｈｅｒ代表
在细胞内其它地方，Ｌｏｃ表示根据得分预测亚细胞定位（Ｃ表示叶绿体，Ｍ
表示线粒体，Ｓ表示分泌途径），ＲＣ表示预测的可靠性等级（分为１到５
级，数值越小表示预测的可信度越高）。
Ｎｏｔｅ：Ｌｅｎ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ，ｃＴＰ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ，ｍＴＰ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＳＰ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ
ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，ｏｔｈｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ａｎｙ ｏｔｈｅｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ
ｃｅｌ，Ｌｏｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｃｏｒｅｓ（Ｃ，
Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ；Ｍ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ；Ｓ，Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ），ＲＣ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ
ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ １ｔｏ ５，ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＲＣ ｔｈｅ ｓａｆｅｒ
ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）．
图４ ＬａＳＰＳ蛋白亚细胞定预测
Ｆｉｇ．４ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒ
ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ
图５ ＬａＳＰＳ蛋白跨膜区预测
Ｆｉｇ．５ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ
２．２．４ 三维结构预测 用ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ对ＬａＳＰＳ蛋白
的二级结构进行预测。结果显示，在该蛋白中α?螺旋结
构占４９．５３％，β?折叠占３．７９％，无规则卷曲占４６．６８％。
用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ预测ＬａＳＰＳ蛋白的三级结构，以拟南
芥的一个长链焦磷酸合成酶（ｌｏｎｇ－ｃｈａｉｎ－ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｅｎｙｌ
ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＰＤＢ ＩＤ：３ＡＱ０）为模板，序列相
似度为３９．４３％，在第１０２～４２２位氨基酸建模，模型覆盖
率７５％。
图６ ＬａＳＰＳ蛋白质三级结构预测
Ｆｉｇ．６ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ
２．２．５ 多序列比对分析 依据 ＮＣＢＩ网站上通过
ｂｌａｓｔｐ比对ｎｒ蛋白数据库的搜索结果，独行菜ＬａＳＰＳ
蛋白与拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）的位于叶绿体的
ＡｔＳＰＳ２蛋白（ＢＡＤ８８５３４．１）序列相似性最高，达９１％，
与拟南芥位于线粒体的ＡｔＳＰＳ１蛋白（ＢＡＤ８８５３３．１）相
似度为７９％，与其它植物序列相似性较高的ＳＰＳ蛋白
为橡胶树（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）ＨｂＳＰＳ蛋白（ＡＢＤ９２７０７．１）
相似度为７１％，番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＳｌＳＰＳ蛋白
（ＡＢＩ６３６２７．１）相似度为６７％，水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）
的位于叶绿体的ＯｓＳＰＳ２蛋白（ＢＡＧ９００３７．１）相似度
为６３％，而与水稻位于线粒体中的 ＯｓＳＰＳ１蛋白
（ＡＫ０７１２９９．１）的相似度只有３３％。使用ＤＮＡＭＡＮ
８．０软件对以上各种植物的ＳＰＳ蛋白进行多序列比
对，结果表明ＬａＳＰＳ蛋白与其它植物的ＳＰＳ蛋白一样，都
含有２个富含天冬氨酸［ＤＤ（Ｘ）ｎＤ］的保守序列（图７）。
２．２．６ 系统进化树分析 从ＵｎｉＰｏｒｔ数据库中，选取其
它植物中参与异戊烯基侧链合成的酶，如法呢基焦磷酸
合成酶（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦＰＰＳ）、牻牛儿
基牻牛儿基焦磷酸合成酶（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＧＧＰＰＳ）以及茄呢醇焦磷酸合酶（ｓｏｌａｎｅｓｙｌ
ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＰＳ），共２０条蛋白序列作为参考，
构建系统进化树。如图８所示，这些参与异戊烯基侧链
合成的酶，分为三大类，一类是ＳＰＳ系列，ＬａＳＰＳ归属这
一分支，其中ＬａＳＰＳ与ＡｔＳＰＳ２亲缘关系较近，序列相似
性为９１％，这与多序列比对分析结果一致；第二类是
ＧＧＰＰＳ系列；第三类是ＦＰＰＳ系列，这些酶都具有异戊
烯基转移酶的活性（图８）。
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·生物技术· 北方园艺２０１６（０６）：９２～９９
注：保守序列ＤＤ（Ｘ）ｎＤ用黑色框标出。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｔｉｆｓ，ＤＤ（Ｘ）ｎＤ，ａｒｅ ｂｏｘｅｄ ｉｎ ｂｌａｃｋ．
图７ ＬａＳＰＳ与其它植物中ＳＰＳ蛋白的多序列比对分析
Ｆｉｇ．７ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＬａＳＰＳ ａｎｄ ＳＰＳ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
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北方园艺２０１６（０６）：９２～９９ ·生物技术·
注：用于构建此系统进化树蛋白的登陆号为拟南芥 ＡｔＳＰＳ２
（ＢＡＤ８８５３４．１），拟南芥ＡｔＳＰＳ１（ＢＡＤ８８５３３．１），橡胶树ＨｂＳＰＳ（ＡＢＤ９２７０７．１），
番茄 ＳｌＳＰＳ（ＡＢＩ６３６２７．１），水稻 ＯｓＳＰＳ２（ＢＡＧ９００３７．１），丹参 ＳｍＳＰＳ
（ＡＦＫ２９２８５．１），水稻ＯｓＳＰＳ１（ＡＫ０７１２９９．１），拟南芥ＡｔＧＧＰＳ６（ＮＰ＿１７５３７６．１），
番茄ＧＧＰＰＳ１（ＡＢＢ８２５５４．１），番茄ＧＧＰＰＳ２（ＡＢＢ８２５５５．１），辣椒ＣａＧＧＰＰＳ１
（Ｐ８００４２．１），水 稻 ＯｓＧＧＰＰＳ１（ＢＡＨ００５３７．１），拟 南 芥 ＡｔＧＧＰＰＳ１
（ＢＡＨ００５３７．１），拟南芥 ＧＧＰＰＳ３（ＮＰ＿１８８０７３．２），拟南芥 ＧＧＰＰＳ４
（ＮＰ＿１７９４５４．１），拟南芥 ＡｔＧＧＰＰＳ２（ＮＰ＿１７９９６０．１），拟南芥 ＡｔＦＰＰＳ１
（Ｑ０９１５２．２），水稻ＯｓＦＰＰＳ３（ＢＡＧ９３１２８．１），水稻ＯｓＦＰＰＳ１（ＢＡＡ１９８５６．１），
水稻ＯｓＦＰＰＳ２（ＢＡＡ３６３４７．１）。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｒｅ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，ＡｔＳＰＳ２ （ＢＡＤ８８５３４．１），Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，ＡｔＳＰＳ１
（ＢＡＤ８８５３３．１），Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ，ＨｂＳＰＳ（ＡＢＤ９２７０７．１），Ｓｏｌａｎｕｍ
ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ，ＳｌＳＰＳ（ＡＢＩ６３６２７．１）；Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ，ＯｓＳＰＳ２（ＢＡＧ９００３７．１）；
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ，ＳｍＳＰＳ（ＡＦＫ２９２８５．１）；Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ＯｓＳＰＳ１（ＡＫ０７１２９９．１）；
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，ＡｔＧＧＰＳ６ （ＮＰ＿１７５３７６．１）；Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ，ＧＧＰＰＳ１
（ＡＢＢ８２５５４．１）；Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ，ＧＧＰＰＳ２（ＡＢＢ８２５５５．１）；Ｃａｐｓｉｃｕｍ
ａｎｎｕｕｍ，ＣａＧＧＰＰＳ１（Ｐ８００４２．１）；Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ＯｓＧＧＰＰＳ１（ＢＡＨ００５３７．１）；Ａ．
ｔｈａｌｉａｎａ，ＡｔＧＧＰＰＳ１ （ＢＡＨ００５３７．１）；Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，ＧＧＰＰＳ３ （ＮＰ ＿
１８８０７３．２）；Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，ＧＧＰＰＳ４（ＮＰ＿１７９４５４．１）；Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，ＡｔＧＧＰＰＳ２
（ＮＰ＿１７９９６０．１）；Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，ＡｔＦＰＰＳ１（Ｑ０９１５２．２）；Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ＯｓＦＰＰＳ３
（ＢＡＧ９３１２８．１）；Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ＯｓＦＰＰＳ１（ＢＡＡ１９８５６．１）；Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ＯｓＦＰＰＳ２
（ＢＡＡ３６３４７．１）．
图８ ＬａＳＰＳ与其它植物ＳＰＳ、ＧＧＰＰＳ、
ＦＰＰＳ蛋白的系统进化分析
Ｆｉｇ．８ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ
ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ＳＰＳ，ＧＧＰＰＳ ａｎｄ ＦＰＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
２．３ ＬａＳＰＳ原核表达载体的构建
用ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ分别对原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ和
测序正确的ｐＭＤ１９－Ｔ－ＬａＳＰＳ质粒进行双酶切，利用重
组ＤＮＡ技术，得到重组质粒ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ，然后转化
大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），选择单克隆提取质粒后，用
ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ进行双酶切鉴定，结果显示有１ ２００ｂｐ左
右的目的条带和６ ０００ｂｐ左右的载体条带（图９）。将双
酶切鉴定正确的单克隆送到公司测序，测序结果显示重
组质粒ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ中ＬａＳＰＳ的序列与目的基因
ＬａＳＰＳ序列一致，未发生碱基突变或移码突变，表明已
成功将ＬａＳＰＳ基因克隆到原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ上。
注：Ｍ，ＤＬ １０ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切结果。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，ＤＬ １０ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｂｙ ＥｃｏＲＩ
ａｎｄ ＸｈｏＩ．
图９ 原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ的双酶切鉴定
Ｆｉｇ．９ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
注：Ｍ，蛋白分子量标准；Ｃ，含ｐＥＴ－３２ａ空载体的Ｅ．ｃｏｌｉ菌株在２８℃、
０．４ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ条件下诱导８ｈ表达的总蛋白；１，相同条件下含
ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ质粒的Ｅ．ｃｏｌｉ菌株表达的总蛋白。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ；Ｃ，Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐＥＴ－３２ａ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ａｔ ２８℃ｆｏｒ ８ｈ；１，Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｅ．
ｃｏｌｉ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳｉｎｄｕｃｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．
图１０ ＬａＳＰＳ重组蛋白的原核表达
Ｆｉｇ．１０ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ
２．４ ＬａＳＰＳ蛋白的原核表达
将测序正确的ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ质粒转化大肠杆菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）后，当大肠杆菌生长至ＯＤ６００为０．６时，在
２８℃、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ、１５０ｒ／ｍｉｎ条件下培养８ｈ，诱
导独行菜ＬａＳＰＳ重组蛋白的表达。如图１０所示，提取
７９
·生物技术· 北方园艺２０１６（０６）：９２～９９
总蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在约６０ｋＤａ处出现目的
蛋白条带，与预测的重组ＬａＳＰＳ的蛋白分子量符合，而
含有空载体（ｐＥＴ－３２ａ）的对照样品，同样条件下诱导表
达后，在６０ｋＤａ处未见条带出现。结果表明，ＬａＳＰＳ蛋
白成功在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达。
３ 讨论
质体醌是光合电子传递链中不可缺少的组分，在植
物中一般含有９个异戊烯基单位的侧链，如ＰＱ－９，对于
植物的光合作用极为重要。该研究首次从独行菜中克
隆了一条参与质体醌合成的基因ＬａＳＰＳ，并利用生物信
息学方法分析了ＬａＳＰＳ基因编码的蛋白序列，结果表
明ＬａＳＰＳ与其它植物中ＳＰＳ蛋白相似性较高，含有异戊
烯基合酶和茄呢醇焦磷酸合酶保守结构域，具有ＤＤ（Ｘ）
ｎＤ的保守序列，具有异戊烯基转移酶活性。通过多序
列比对和系统进化树分析，发现ＬａＳＰＳ蛋白与ＡｔＳＰＳ２蛋
白有９１％的相似性，亲缘关系最近。拟南芥中目前报道
有２种茄呢醇焦磷酸合酶，分别为ＡｔＳＰＳ１和ＡｔＳＰＳ２，负
责拟南芥中泛醌和质体醌的类异戊烯基侧链的合成，进
一步研究表明，ＡｔＳＰＳ１定位于线粒体中，是线粒体呼吸
电子转移不可缺少的条件；ＡｔＳＰＳ２定位于叶绿体中，是
叶绿体光合电子转移的必要条件［４］。ＴＡＲＧＥＴ Ｐ预测
ＬａＳＰＳ蛋白定位于叶绿体中，所以，独行菜ＬａＳＰＳ蛋白
可能和拟南芥的ＡｔＳＰＳ２为同一类型的酶，功能也相似，
定位于叶绿体中，参与质体醌的生物合成。
该研究通过构建原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ，成
功在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中表达了独行菜ＬａＳＰＳ
蛋白，大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株可以增加细胞质中蛋白
质二硫键的形成，使得蛋白的可溶性更好，同时，利用
ｐＥＴ－３２ａ载体表达的重组蛋白Ｎ端带有６个Ｈｉｓ Ｔａｇ标
签，方便后续重组蛋白的纯化［１４］。这些结果为纯化
ＬａＳＰＳ蛋白，进一步研究ＬａＳＰＳ蛋白的生物学活性，以
及ＬａＳＰＳ基因在独行菜质体醌生物合成途径中的生物
学功能奠定了基础。
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（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ ４５００４６；２．Ｃｏｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ
Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ＆Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ ４５００４６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ａｐｅｔａｌｕｍａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ
（ＯＲＦ）ｏｆ ＬａＳＰＳｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｅｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
８９
北方园艺２０１６（０６）：９９～１０２ ·生物技术·
第一作者简介：喻晓敏（１９８４－），女，硕士，编辑，现主要从事植物生
物技术及出版学等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：２１５８１８７２＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：李世升（１９８３－），男，博士，讲师，现主要从事作物发育与
育种等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｓｈｉｓｈｅｎｇ２００２＠ｗｈｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（２０１３ＣＦＣ１２６）；湖北省
教育厅自然科学研究资助项目（Ｄ２０１２２７０３）。
收稿日期：２０１５－１２－２３
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６０６０２４
根癌农杆菌介导的萝卜
遗传转化方法研究
喻 晓 敏１，吴 雷２，王 魁３，李 世 升２，徐 漫２
（１．黄冈师范学院 黄冈师范学院学报编辑部，湖北 黄冈４３８０００；２．黄冈师范学院 湖北省经济林木种质改良重点实验室，
大别山特色资源协同创新中心，生命科学学院，湖北 黄冈４３８０００；３．华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉４３００７０）
摘 要：以“短叶－１３”萝卜为试材，采用浸花法，使用含有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）报告基因的根
癌农杆菌浸泡生长状态良好的萝卜花序，研究了农杆菌介导萝卜遗传转化的新方法。结果表明：
ＧＦＰ蛋白能够在萝卜幼根中成功表达。
关键词：转基因；根癌农杆菌；萝卜；浸花法
中图分类号：Ｓ ６３１．１０３．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１６）０６－００９９－０４
萝卜（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）属十字花科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）
萝卜属一年或两年生草本植物，是油菜的近缘物种。萝
卜在世界范围内广泛种植，且有着十分悠久的种植历
史。在长期的进化、栽培及选育过程中，萝卜品种越发
丰富，在根形、根色、叶形、叶色及风味、收获期和抽苔期
等方面表现各有差异。近年来有关萝卜的新型用途也
渐渐呈现，如叶用萝卜、食荚萝卜及油用萝卜等。随着
萝卜用途的扩大，萝卜在人们日常生活中显得日益重要
的同时，也逐渐成为众多学者开展科学研究的重要对
象。萝卜的生长发育规律在个体、细胞及分子等多方
面、多层次不断得到揭示。随着测序技术的飞速发
展［１］，许多物种基因测序工作正在进行，像蕃茄、黄瓜、大
白菜及大豆等全基因组测序已完成。萝卜测序工作正
在开展，部分测序结果也被陆续公布。例如包含萝卜部
分基因信息的数据库已由美国康奈尔大学开发建成，该
库（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｂｔｉ．ｃｏｒｎｅｌ．ｅｄｕ／ｒａｄｉｓｈ）包含大量基因
序列信息，主要有萝卜线粒体全基因组序列、表达序标
签（ＥＳＴ）、单基因序列及其功能提示、生物化学信号通路
及单核苷酸多样性（ＳＮＰ）、简单序列重复标记（ＳＳＲ）和
遗传图谱等重要信息。另外，日本学者也为日本萝卜
（Ｄａｉｋｏｎ）建立了含有２６ ６０６个ＥＳＴ的小型数据库，这些
ＥＳＴ可拼接成１０ ３８１个ｕｎｉｇｅｎｅ［２］。最近，日本学者公
布了萝卜全基因组序列［３］，为深入分析萝卜基因功能以
及进一步改良萝卜种质资源提供了极大便利。
为了能更快捷且有针对性的改良萝卜种子、根形及
其它重要性状，将拟南芥业已十分成熟的浸花转基因法
在萝卜中作了尝试。萝卜遗传体系的建立，一方面为解
读萝卜基因的功能提供方便，另一方面可极大促进萝卜
种质改良及育种水平，进而为社会经济发展服务。该研
究报导了农杆菌成功介导的萝卜遗传转化新方法，利用
绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）及卡那霉
ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＯＲＦ ｏｆ ＬａＳＰＳｇｅｎｅ ｗａｓ １ ２６９ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＫＴ３１８７３４），
ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ４２２ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｔｈｅ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｓｏｌａｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ
ｄｏｍａｉｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ‘ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ’ｆａｍｉｌｙ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｗｈｉｃｈ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｈａｄ ｎｏ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＬａＳＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ，９１％ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ，ｗｉｔｈ ＡｔＳＰＳ２ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ－３２ａ－ＬａＳＰＳ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＬａＳＰＳ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｅｌｓ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｏｌｏｗ－ｕｐ ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｏｆ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｓｔｏｑｕｉｎｏｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ａｐｅｔａｌｕｍ；ｓｏｌａｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
９９