全 文 ：不同盐度梯度下碱菀的遗传多样性和遗传分化
杨蓓莉 1 , 吴建江 1 , 倪福明 1 , 汪青锋2 , 王冬旭 1 , 李建辉 1 , 李钧敏 1
(1.台州学院生命科学学院 ,浙江临海 317000;2.浙江省玉环县漩门湾果蔬合作社 ,浙江玉环 317600)
　　摘要:以 RAPD分子标记技术分析了 3个不同盐度梯度下碱菀的遗传多样性与遗传分化 , 结果表明 12个引物共扩增出
165个可重复的位点 ,其中多态位点有 145个 ,总多态位点百分率为 87.88%,以中等盐度(P2)种群最高 , 高盐度(P1)种群次
之 , 低盐度(P3)种群最低。 AMOVA分子变异显示 , 83.56%变异来源于种群内 , 16.44%变异来源于种群间。种群间的遗传分
化系数(Gst)为 0.148 8,种群间基因流(Nm)为 2.860 2。
　　关键词:碱菀;RAPD;遗传多样性;遗传分化
　　中图分类号:Q943　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)01-0296-02
收稿日期:2008-07-09
基金项目:浙江省自然科学基金(编号:Y505331)。
作者简介:杨蓓莉(1987—),女 ,浙江乐清人 ,从事植物生态学研究。
通讯作者:李钧敏 ,硕士 ,副教授。 Tel:(0576)85137067;E-mail:li-
jm@tzc.edu.cn。
　　我国海岸线漫长 ,滩涂面积约 200万 km2。沿海滩涂湿
地是自然界生物多样性最丰富 、生产力最高、最具服务价值的
湿地生态系统之一 ,亦是人类最重要的生存环境之一 [ 1] 。碱
菀(铁秆蒿)(Tripoliumvulgare)是菊科碱菀属植物 ,多生长在
低位盐碱斑 、盐碱湿地和碱湖边 ,为一年生或二年生中生盐生
草本植物 。碱菀是强盐碱土和碱土的指示植物 ,在盐渍土开
发利用 、维持生态平衡方面起着重要的作用 [ 2] 。
随机扩增多态 DNA(RAPD)分子标记技术由于具有简
便 、快速 、经济 、DNA用量少 、多态性好等特点 ,被广泛应用于
植物遗传多样性和遗传结构的研究中 [ 3-5] 。最新研究表明 ,
RAPD与 AFLP一样可以作为可靠的分子标记使用 [ 6] 。本研
究利用 RAPD技术对分布于浙江省玉环县漩门湾不同时间围
塘滩涂上生长的碱菀遗传多样性与遗传分化进行研究 ,从分
子水平探讨盐生植物的适应机制 ,为盐生植物在滩涂上的引
种与生长提供理论依据 [ 7] 。
1　材料和方法
1.1　材料采集与处理
2007年 7月在玉环县西北部乐清湾内漩门二期蓄淡围
垦滩涂上 ,根据距海塘不同距离设立 3个样地 ,采集 3个盐生
植物碱菀种群 ,每种群取 30个成熟植株 ,相邻植株间的距离
在 10 m以上 , 4℃下带回实验室 ,洗净晾干 , -70℃低温冰箱
保存 ,供 DNA提取(表 1)。
表 1　3个碱菀样地的基本情况
居群 距海塘距离(m) 地理位置 围塘时间(年)
P1 10 28°14′N, 121°12′E 27
P2 1570 28°15′N, 121°13′E 15
P3 2960 28°14′N, 121°15′E 6
1.2　DNA的提取与定量
DNA的提取采用改进的 SDS法 [ 8 ] 。经 0.8%琼脂糖凝
胶电泳分析 ,用 GIS凝胶成像分析系统 (上海天能科技服务
公司)拍照定量 , -20℃保存备用 。
1.3　RAPD扩增及产物鉴定
随机引物购自上海 Sangon公司 ,经优化的扩增反应条件
为:10μlPCR反应体积 , 1 ×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L
Tris· HCl、 pH值 9.0、50 mmol/LKCl、 0.1% TritonX-
100), 0.15 mmol/L4 ×dNTP, 0.75 UTaq酶(上海华美公
司), 10 ng模板 DNA, 3.6 pmol引物(上海 Sangon公司), 1
μg/μlBSA。对照加入除模板 DNA的以上各成分 ,用双蒸水
代替总 DNA。经优化的 PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5
min;94 ℃变性 1 min、40℃退火 1min、72 ℃延伸 1.5 min,共
35个循环;72℃完全延伸 5min。所有反应在美国 Thermo公
司生产的 P×2热循环仪中进行 。扩增产物在 1.6%的琼脂
糖凝胶(含 0.5 μg/ml溴化乙锭)中电泳 ,电泳缓冲液为 0.5
×TBE,用 GIS凝胶成像分析系统(上海天能科技服务公司)
拍照保存 。
1.4　数据处理
用 λDNA/EcoRI+HindIII分子量标准参照做分子量标
记 ,对照反应产物在凝胶上的相应位置 ,按扩增有无记录电泳
带谱 ,有带记为 “ 1”,无带记为 “0”,得到 RAPD表型数据矩
阵 。将矩阵输入 POPGENE32软件进行分析 ,计算多态位点
百分率 、Shannon信息指数 、Nei指数 、遗传分化系数(Gst)、种
群间的遗传相似度和遗传距离 ,由 Gst值估算基因流(Nm)的
大小 。根据种群间的遗传距离 ,通过算术平均数的非加权成
组配对法(UPGMA)进行聚类分析 ,同时采用 AMOVA软件分
析遗传变异在种群内和种群间的分布 。
2　结果与分析
2.1　碱菀种群的遗传多样性
从 3个种群中各选出 1个 DNA样品进行 RAPD扩增 ,同
时以蒸馏水取代 DNA设置阴性对照 ,扩增产物经电泳分离后
进行引物筛选 。从 150个引物中筛选出在 3个碱菀种群中均
可扩增出清晰条带 ,且条带不弥散 、不模糊 、重复性好 ,同时阴
性对照中无带的 12个引物作为正式扩增的 RAPD引物 。 12
个引物的碱基序列见表 2。
　　12个引物对 3个碱菀种群共 90株个体的 DNA样品进
行了 RAPD分析(图 1),共检测到 165个可重复的位点 ,其中
多态位点有 145个 ,总多态位点百分率为 87.88%(表 3)。 3
—296— 江苏农业科学　2009年第 1期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2009.01.011
个样地碱菀种群的多态位点百分率为 64.24% ～ 74.55%,平
均为 68.28%,以 P2种群最高 , P1种群次之 , P3种群最低 。
表 2　RAPD分析用的 12个随机引物碱基序列
引物 序列 引物 序列 引物 序列
S26 GGTCCCTGAC S68 TGGACCGGTG S220 GACCAATGCC
S36 AGCCAGCGAA S180 AAAGTGCGGC S306 ACGCCAGAGG
S64 CCGCATCTAC S93 CTCTCCGCCA S326 GTGCCGTTCA
S303 TGGCGCAGTG S94 GGATGAGACC S370 GTGCAACGTG
　　由表 3可知 ,由 Shannon信息指数计算的 3个样地碱菀
种群总的遗传多样性为 0.411 9 ,各种群的遗传多样性变动范
围为 0.326 9 ～ 0.378 2 ,平均为 0.344 2 ,以 P2种群最高 , P1
种群次之 , P3种群最低 。由 Nei指数计算的 3个样地碱菀种
群总的基因多样性为 0.269 8 , 各种群的基因多样性为
0.218 3 ～ 0.251 9 ,平均为 0.229 7 ,也以 P2种群最高 , P1种
群次之 , P3种群最低 。
表 3　3个样地碱菀种群的遗传多样性
居群 样本数(株)
多态位点数
(个)
多态位点百
分率 (%)
Shannon
信息指数 Nei指数
P1 30 109 66.06 0.327 6 0.218 8
P2 30 123 74.55 0.378 2 0.251 9
P3 30 106 64.24 0.326 9 0.218 3
总体 100 145 87.88 0.411 9 0.269 8
2.2　碱菀种群的遗传分化
AMOVA分析结果显示 (表 4), 在总的遗传变异中 ,
25.93%的变异发生在种群间 , 74.07%的变异发生在种群内 ,
种群间和种群内变异均极显著(Υst=0.259 3 , P<0.001)。
由 Shannon信息指数计算的种群内和种群间的遗传变异见表
5 ,在总遗传变异中 ,有 83.56%存在于种群内 , 16.44%存在
于种群间 ,种群间的遗传分化系数(Gst)为 0.148 8。由 Gst估
算的种群间基因流(Nm)为 2.860 2。
表 4　碱菀种群内和种群间分子变异的 AMOVA分析
变异来源 自由度 总方差 平均方差 变异组分 变异百分率(%) 显著度
种群间 2 360.911 180.456 5.492 25.93 P<0.001
种群内 87 1 365.000 15.690 15.690 74.07 P<0.001
表 5　3个样地碱菀种群的遗传分化
Shannon信息指数 Nei指数
种群内遗传多样性Hpop 0.344 2 种群内的基因多样性 Hs 0.229 7
种群总的遗传多样性 Hsp 0.411 9 种群总的基因多样性 Ht 0.268 9
种群内遗传多样性所占比率 Hpop/Hsp 0.835 6 种群内基因多样性所占比率 Hs/Ht 0.854 2
种群间遗传多样性所占比率(Hsp-Hpop)/Hsp 0.164 4 遗传分化系数 Gst 0.148 8
基因流 Nm 2.860 2
2.3　3个样地碱菀种群的遗传距离
通过 POPGENE32软件按 Nei方法计算碱菀种群间的遗
传相似度和遗传距离(表 6)。 3个样地碱菀种群间的遗传相
似度为 0.895 1 ～ 0.936 7 ,平均为 0.922 1。其中 P1种群与 P2
种群的遗传相似度最高 , P1种群与 P3种群最低 。种群间的遗
传距离为 0.065 4 ～ 0.110 8,平均为 0.081 3。根据种群间的遗
传距离 ,通过 UPGMA进行聚类分析(图 2), P1种群与 P2种群
之间的遗传距离较小 ,先聚在一起 ,再与 P3种群聚合 。
表 6　3个碱菀种群间的遗传相似度与遗传距离
样地 P1 P2 P3
P1 0.936 7 0.895 1
P2 0.065 4 0.934 6
P3 0.110 8 0.067 7
　　注:右上部分为 Nei遗传相似度,左下部分为遗传距离。
3　讨论
慎佳泓等 [ 9] 2006年对杭州湾和乐清湾滩涂湿地的植被 、
种类及围垦时间进行了调查 ,并分析了滩涂围垦对植物多样
性的影响 ,发现建塘时间越早 ,物种数越多 ,即物种丰富度越
大 。他们认为主要与土壤的含盐量有关 。盐生植物在不断适
应盐渍化环境的同时 ,也逐渐改变生境条件 ,盐生植物群落在
发育过程中 ,不仅能改善气候条件 ,同时也能降低土壤的含盐
量 ,为其他植物的生存提供有利条件 。在建塘时间较短的海
塘内 ,因为土壤含盐量较大 ,只有少数几种耐盐能力强的植物
能够生存 ,特别是互花米草大量生长 ,占据绝对优势 。随着时
间的推移 ,土壤趋于中性化 ,相应地一些耐盐能力稍差的物种
进入该环境 。在建塘 30年以上的海塘内 ,土壤基本已成中
性 ,大量的非盐生植物的出现使得物种丰富度变大 。
3个不同碱菀种群的遗传多样性以 P2种群最高 , P1种
群次之 , P3种群最低。与 P1种群相比 , P2种群的围塘时间
较长 ,土壤盐度较低 ,种群的遗传多样性也较高;但 P3种群的
围塘时间最长 ,遗传多样性却最低 ,分析原因可能是由于 P3
种群围塘时间最久 ,开发的时间也最久 ,大多数样地均被周围
居住的农民开发成鱼塘发展养殖业 ,人为破坏较为严重 ,导致
(下转第 298页)
—297—杨蓓莉等:不同盐度梯度下碱菀的遗传多样性和遗传分化
多功能芽孢杆菌的分离 、筛选及活性测定
张广志 1 , 杨合同1, 2, 3 , 李纪顺1 , 扈进冬 1
(1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心 /山东省应用微生物重点实验室 ,山东济南 250014;
2.山东省科学院生物研究所 ,山东济南 250014;3.山东理工大学生命科学学院 ,山东淄博 255049)
　　摘要:从小麦 、禾本科杂草根际取样 ,分离固氮芽孢杆菌 , 并测定各菌株的抑菌活性及降解有机磷农药的能力 ,筛选多功
能芽孢杆菌菌株。结果表明 , 分离筛选的 11株固氮芽孢杆菌主要包括胶质芽孢杆菌(Bacilusmucilaginosus)、巨大芽孢杆菌
(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus);其中 7株菌株对立枯
丝核菌和禾谷丝核菌两种病原菌具有明显的抑菌活性;5株菌株能有效降解甲胺磷和甲基对硫磷两种有机磷农药。巨大芽孢
杆菌 BM3和地衣芽孢杆菌 BL6具有明显的固氮 、抑菌和降解有机磷农药等多种功能活性。
　　关键词:芽孢杆菌;固氮;有机磷农药;生物防治
　　中图分类号:Q93-331　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)01-0298-03
(上接第 297页)
碱菀种群的遗传多样性显著下降 。
3个不同盐度梯度的碱菀种群间的分化程度比较低 ,遗
传分化系数 Gst为 0.148 8。AMOVA分析结果显示 ,总的遗传
多样性有 83.56%存在于种群内 , 16.44%存在于种群间 ,表
明碱菀种群大部分变异存在于种群内 ,种群间存在着强烈基
因流(Nm=2.860 2)。杨明博等 [ 10 ]利用 ISSR扩增法分析了
鄂尔多斯高原不同降雨量梯度中间锦鸡儿 (Caraganada-
vazamciSancz)种群的遗传结构 ,表明中间锦鸡儿具有丰富的
遗传多样性 ,揭示了中间锦鸡儿能够广泛分布的原因 ,提供了
可以大面积种植的遗传学依据 。不同盐度梯度的碱菀种群水
平维持着较高的遗传分化 ,这与碱菀的生物学特性有关 。碱
菀为菊科专性盐生植物 ,在低位盐碱斑 、盐碱湿地和碱湖边生
长旺盛 。碱菀高的遗传多样性与低的遗传分化 ,表明了碱菀
在盐碱地上具有广泛的适应能力 。
参考文献:
[ 1]赵其国 ,高俊峰.中国湿地资源的生态功能及其分区 [ J] .中国
生态农业学报 , 2007, 15(1):1-4.
[ 2]赵可夫 ,冯立田.中国盐生植物资源 [ M] .北京:科学出版社 ,
2001.
[ 3] PalaciosC, GonzalezCF.Lackofgeneticvariabilityintherareand
endangeredLimoniumcavanilesi(Plumbaginaceae)usingRAPD
markers[ J] .MolecularEcology, 1997, 6(7):671-675.
[ 4]夏　铭 ,周晓峰 , 赵士洞.天然蒙古栎群体遗传多样性的 RAPD
分析 [ J].林业科学 , 2001, 37(5):126-133.
[ 5]李钧敏 ,金则新.浙江省境内七子花天然种群遗传多样性研究
[ J].应用生态学报 , 2005, 16(5):795-800.
[ 6] KjφlnerS, Sa°stad, SM, TaberletP, etal.Amplifiedfragment
lengthpolymorphism versusrandom amplifiedpolymorphicDNA
markers:clonaldiversityinSaxifragacernua[ J] .MolecularEcolo-
gy, 2004, 13:81-86.
[ 7]黎中宝 ,林　鹏 ,林益明.不同盐度梯度的桐花树种群的遗传多
样性和遗传分化 [ J] .海洋科学, 2001, 25(2):4-7.
[ 8]李钧敏 ,金则新 ,边才苗 ,等.大血藤 DNA提取及 RAPD研究初
探 [ J] .植物研究 , 2002, 22(4):483-486.
[ 9]慎佳泓,胡仁勇,李铭红 ,等.杭州湾和乐清湾滩涂围垦对湿地植物多
样性的影响[ J] .浙江大学学报:理学版, 2006, 33(3):324-328.
[ 10]杨明博 ,杨　劼 ,杨九艳 ,等.鄂尔多斯高原不同降雨量梯度中
间锦鸡儿(CaraganadavazamciSancz)种群的遗传结构 [ J].生
态学报 , 2006, 26(12):4027-4032.
　　微生物肥料又称生物肥料 、菌肥 、接种剂 ,是一类以微生
物生命活动及其产物确保农作物得到特定肥料效应的微生物
活体制品 。微生物种类繁多、功能多样 ,研究和应用的潜力巨
大 。微生物肥料在培肥地力 ,提高化肥利用率 ,抑制农作物对
硝态氮 、重金属 、农药的吸收 ,净化和修复土壤 ,减少农作物病
收稿日期:2008-06-16
基金项目:国家 “ 863”计划现代农业技术领域重大项目(编号:
2006AA10A211);山 东 省 科 技 攻 关 重 点 项 目 (编 号:
2005GG3209057)。
作者简介:张广志(1978—),男 ,山东临朐人 ,硕士 ,助理研究员 ,主要
从事农业微生物资源与生防等方面的研究。 E-mail:zhanggz05
@yahoo.com.cn。
通讯作者:杨合同 ,研究员。 Tel:(0531)82605386;E-mail:yanght@
keylab.net。
害发生 ,促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用 , 保护环境 ,
以及提高农产品品质和食品安全等方面已表现出不可替代的
作用 [ 1 ] 。目前微生物肥料所用菌株多是单一品种 ,不能同时
解决土壤肥力 、土传病害及农药残留等多种问题 ,因此分离筛
选具备多种功能的菌株 ,研制高效多功能微生物肥料具有重
要意义 。
芽孢杆菌在自然界中分布广泛 ,与其他微生物活菌剂相
比 ,具有在不利环境条件下形成芽孢的特点 ,且复活率高 ,同
时还具有耐酸 、耐盐 、耐高温等优点 ,在农业生产中具有较高
的稳定性 [ 2 ] 。此外 ,有些芽孢杆菌对一些病原真菌有抑制效
果 ,并能有效降解有机磷农药 。本研究从不同生境的小麦 、禾
本科杂草根际取样 ,分离筛选固氮芽孢杆菌 ,同时测定其有无
抑制病原真菌的能力和降解有机磷农药的效果 ,旨在为研制
高效多功能微生物肥料 ,解决土壤中存在的多种问题提供理
论依据 。
—298— 江苏农业科学　2009年第 1期