全 文 ：反应, 且清毒片与反义核酸联合使用能协同提高抑制
率及诱导凋亡率。因此,清毒片联合反义核酸可能可
以作为抗急性白血病的方法之一。
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收稿日期: 2009 - 07 - 10
基金项目:湖南省教育厅科研项目 ( 06C 637 )
作者简介:刘胜贵 ( 1965 - ) ,男,湖南宁乡人,教授,硕士, 主要从事微生
物学与民族药用植物活性成分研究。
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羊耳菊有机溶剂提取物的抑菌作用研究
刘胜贵 1, 2,陈鸠鸠 1,李 军 1, 陈富成 1,邓 乐 2
( 11怀化学院生物工程系, 湖南 怀化 418008; 21湖南师范大学生命科学学院,湖南 长沙 410081)
摘 要: 目的:评价羊耳菊提取物抗微生物活性,为广泛应用于传统医药系统的药物提供科学依据。方法: 通过使用
不断增强极性的有机溶剂,即石油醚、氯仿、乙醇、甲醇、丙酮和冰醋酸, 获得羊耳菊根、茎、叶的提取物。使用药敏纸片扩
散法和试管二倍稀释法 ,研究了提取物对大肠杆菌 ( E. co liO1)、白色念珠菌 ( Candida a lbicans)、金黄色葡萄球菌 ( S taphy-
lococcus aureus 91053)、甲型副伤寒沙门氏菌 ( Salmonella para typhiA )、铜绿假单胞菌 ( P seudom ona s ae rug ino sa)、粪肠球菌
( Entero coccus faeca lis)的体外抑菌特性。结果:羊耳菊不同有机溶剂提取物都具有抑菌作用,其中, 冰醋酸提取物的抑菌
效果最好, 其次是乙醇和丙酮提取物,石油醚提取物抑菌效果略差;根和叶提取物抑菌作用比茎提取物好;提取物对革兰
氏阳性抑制效果比革兰氏阴性菌好。结论 :羊耳菊有机溶液提取物体外试验证实了该民间药物具有抗菌活性, 也表明了
羊耳菊是一种有开发潜力的新抗菌药物资源。
关键词: 羊耳菊;提取物; 抑菌圈直径; M IC值
中图分类号: R28412 文献标识码: A 文章编号: 1000 -1719( 2010) 03 - 0398 - 03
Antmi icrobial Effects of Inula Cappa O rganic SolventExtrac ts
LIU Sheng-gui1, 2, CHEN Ju-ju1, LI Jun1, CHEN F u-cheng1, DEN Le2
( 11D epar tm ent o f L ife Sciences, Huaihua University, Huaihua, 418008, Huna i, Ch ina;
21Co llege of Life Sciences, Hunan Norm alUn iversity, Changsha, 410081, Hunai, Ch ina)
Abstrac t: Ob jective: To evalua te the antim icrobia l activ ity o f ex trac ts o f this plan t in o rde r to prov ide scientific proo f fo r its
w ide app lication in traditional medic ine system.M ethod s: Extraction of who le roots, stem s and leave s o f Inula cappa using so lvents
o f increa sing po la rity, nam ely, pe troleum e the r, chloroform, e thano ,l m e thano ,l acetone and g lacia l ace tic acid, respec tively, w ere
obta ined. The extrac ts we re te sted fo r their in v itro antim icrob ia l prope rties by using a disk - diffusion and seria l two - fo ld d ilu-
tions m ethod. Results: A ll o f the p lant extracts tested had antim icrobia l ac tivities. The g lac ial ace tic acid ex trac ts exhibited a stron-
ge r and broade r spec trum of an tibac te rial activ ity, fo llowed by the e thano l and ace tone ex tracts. Bo th roo t and leave ex trac ts have
stronge r antim ic robial ac tivities than stem ex tracts, and the p lant ex tracts we rem o re active aga instG ram - positive bacteria than a-
ga inst G ram - nega tive bac te ria. Conclusion: This in v itro study corroborated the an tim icrobia l activ ity o f the selec ted plan ts used
in fo lkloric m edic ine and a lso show ed that Inu la Cappa DC. could be po ten tial sources o f new antim ic robial agents.
K ey words: Inu la cappa, ex trac,t Inh ibition zone in diam e ter, m inim a l inhibition concentration (M IC)
全球 75% ~ 80% 的人口, 尤其以发展中国家居
多,自古以来主要以药用植物治疗疾病。近年来,药用
植物在发达国家的应用也在增加 [1 ]。由于滥用抗生素
导致多种抗药性细菌的产生, 以及抗生素产生副作用
等严峻问题,迫使人们从药用植物中寻找治疗感染性
疾病的新抗菌药物和生物活性物质。在世界各地, 已
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DOI：10.13192/j.ljtcm.2010.03.19.liushg.087
有许多关于植物提取物的抗微生物活性的研究报
道 [2 - 5]。羊耳菊 ( Inula cappa DC. ), 系菊科旋覆花属
植物, 亚灌木,根状茎粗壮 [6 ], 在我国南方分布较为广
泛。其味苦微辛, 性平无毒, 驱风利湿,行气化滞。经
过调查了解,湖南通道县侗族民间常用羊耳菊治疗疟
疾、痢疾、风湿关节疼痛、腹泻、产后感冒、肝炎、痔疮和
疥癣。目前,国内、外尚没有研究其抑菌作用的报道。
本文通过研究羊耳菊根、茎、叶不同有机溶剂提取物抑
菌特性,证明其抗菌潜力。
1 材料与方法
11 1 材料 羊耳菊采自湖南通道侗族自治县, 根、茎、
叶三部分别置 60e 干燥箱中干燥至恒重,经粉碎后,
过 20目筛。
11 2 试剂和仪器 ( 1)实验菌种: 大肠杆菌 ( E. co li
O1)、白色念珠菌 ( C andida a lbicans)、金黄色葡萄球菌
( S taphy lococcus aureus 91053)、甲型副伤沙门氏菌
( Sa lmonella para typhi A)、铜绿假单胞菌 ( Pseudomonas
ae rug inosa)、粪肠球菌 ( Enterococcus faeca lis), 由怀化
学院微生物学实验室提供。
( 2)培养基: LB( Luria -Bertani)液体培养基:蛋白
胨 10g, N aC l 10g, 酵母粉 5g, 用 1mo l /L NaOH 调
pH710, 用蒸馏水定容至 1000mL。于 121e 灭菌
20m in。 LB固体培养基: LB液体培养基中加 11 6%的
琼脂粉,煮沸溶化后定容。于 121e 灭菌 20m in[ 7]。
11 3 方法 ( 1)羊耳菊根、茎、叶不同溶剂提取物的
制备: 称取羊耳菊根、茎、叶粉末各 30g, 在每份样品中
分别加入甲醇、乙醇、冰醋酸、石油醚、氯仿、丙酮各
90mL,按表 1提供的温度进行回流提取和减压浓缩。
回流提取时间为 3h,趁热过滤,滤渣再加溶剂 30mL重
复操作 2次,合并 3次滤液,减压浓缩成浸膏。浸膏用
3%乙醇 3~ 4mL溶解,最后用蒸馏水定容为 30mL, 制
成含生药 1g /mL溶液,置 4e 冰箱中备用 [ 8]。
表 1 各种不同有机溶剂回流提取的温度和减压浓缩温度
溶剂 95%乙醇 冰醋酸 石油醚 氯仿 丙酮
回流提取温度 70e 80 100 60 65 60
减压浓缩温度 45e 60 60 45 45 45
( 2)菌悬液的制备:将所有供试菌活化后,分别接
种到固体 LB平板培养基中,细菌于 37e 培养 16~ 18h
(白色念珠菌培养 24h)。挑取单菌落,参照麦氏比浊
管,用无菌生理盐水将菌液浓度调到为 1 @ 106CFU /
mL备用。
( 3)抗微生物敏感性试验: 抗微生物试验根据药
敏纸片扩散法 [ 9]进行, 并作适当修改。将滤纸打成直
径为 6mm的圆形纸片, 灭菌烘干后,分别放人羊耳菊
各提取物中浸泡 1~ 2m in, 取出并在温度低于 60e 的
条件下烘干, 即制成药敏纸片。取 01 1mL浓度为 1 @
106CFU /mL的大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球
菌、甲型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌菌
悬液均匀地涂布在平板上, 用无菌镊子将药敏纸片贴
在含菌的平板上,每个平板贴 3种药敏纸片。放入恒
温 37e 恒温箱中, 细菌培养 24h, 白色念珠菌培养
36h。测量抑菌圈的直径。
( 4)试管二倍稀释法测定的 M IC值: 将无菌试管
分成 6组,每组 54支。每组试管再分成 6小组, 每小
组 9支。第 1支试管中加入 1mL2倍浓度的 LB液体
培养基,其他试管中各加入 1mL LB液体培养基,向第
1支试管中加入 1mL提取液后按 2倍稀释法, 使各管
药液浓度分别为 01 5、01 25、01 125、01 0625、0103125、
01 015625、01 007813、01003906、01 001953g /mL, 然后向
各管中加入 01 1mL的含 1 @ 106CFU /mL的细菌悬液,
将培养物置于 37e 培养 18 ~ 24h。从培养液中取出
01 1mL涂布于固体 LB培养基平板上,于 37e 培养 24h
后观察。以上试验重复 3次。以无菌生长的平板所对
应的提取液浓度作为最低抑菌浓度 (M IC)。
2 结果与分析
21 1 药敏纸片法测定的抑菌圈直径 帖有药敏纸片
的含菌平板培养 24h后,观察药敏纸片周围是否产生
的抑菌圈,并测量抑菌的直径 (含药敏纸片直径 )。羊
耳菊根、茎、叶的不同溶剂的提取物对不同细菌的抑菌
直径取 3次试验的平均值。如表 2~ 4所示。
表 2 羊耳菊根不同溶剂提取物对 6种供试菌的抑菌圈直径 (mm )
试验菌种 不同溶剂提取物的抑菌半径甲醇 乙醇 冰醋酸 石油醚 氯仿 丙酮
E. co liO 1 814 1210 1618 710 1110 1218
Cand ida alb icans 1214 1610 2018 716 1214 1412
S taphy lococcus au reus 1410 2118 2410 814 1610 1710
S alm onella paratyph iA 1116 1910 2218 812 1412 1610
P seudom onas aeruginosa 910 1310 1810 ) 1012 1310
E nterococcu s faecalis 716 1212 1510 ) 918 1012
注: / ) 0表示没有抑菌效果,以下同。
表 3 羊耳菊茎不同溶剂提取物对 6种供试菌的抑菌圈直径 (mm )
菌种 不同溶剂提取物的抑菌半径甲醇 乙醇 冰醋酸 石油醚 氯仿 丙酮
E. co liO 1 716 1018 1416 ) 916 1112
Cand ida alb icans 1110 1510 1916 ) 1116 1318
S taphy lococcus au reus 1216 1610 2312 718 1410 1310
S alm onella paratyph iA 1010 1410 2012 7 1210 1110
P seudom onas aeruginosa 910 1116 1412 614 812 1016
E nterococcu s faecalis ) 910 1310 ) 710 812
表 4 羊耳菊叶不同溶剂提取物对 6种供试菌的抑菌圈直径 (mm )
菌种 不同溶剂提取物的抑菌半径甲醇 乙醇 冰醋酸 石油醚 氯仿 丙酮
E. co liO 1 810 1212 1510 710 1010 1218
Cand ida alb icans 1110 1510 2110 810 1212 1316
S taphy lococcus au reus 1510 1916 2412 812 1414 1510
S alm onella paratyph iA 1016 1412 2110 716 1310 1214
P seudom onas aeruginosa 812 1216 1614 ) 1010 918
E nterococcu s faecalis 716 914 1314 618 816 812
从表 2~ 4可以看出,羊耳菊根、茎、叶不同有机溶
剂提取物都表现出对供试菌一定程度的抑菌活性, 其
中冰醋酸提取物抑菌活性最强,抑菌谱最广,根、叶、茎
抑菌圈范围分别是 151 0~ 24mm、131 4~ 241 2mm、13~
231 2mm;其次是乙醇丙酮和氯仿提取物, 石油醚的提
取物抑菌活性较弱, 抑菌谱略窄。提取物对革兰氏阳
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性菌金黄色葡萄球菌抑制效果最好, 羊耳菊叶提取物
的抑菌圈直径达到了 241 2 mm, 对革兰氏阴性菌和真
菌白色念珠菌抑制效果较弱。比较羊耳菊根、茎,叶提
取物的抑菌效果发现:根与叶提取物抑菌效果较强,茎
提取物的抑菌效果较弱。
21 2 试管二倍稀释法测定的 M IC值 经过观察培养
物中试管透明度,同时对培养物用涂布平板法检查细
菌生长情况, 计算中草药提取物的最低抑菌浓度
(M IC )。如表 5~ 7所示。
表 5 羊耳菊根不同溶剂提取物对 6种供试菌的 M IC值 ( m g /mL)
试验菌种 不同溶剂提取物的 M IC值甲醇 乙醇 冰醋酸 石油醚 氯仿 丙酮
E. coliO
1 12510 12510 12510 12510 12510 12510
Cand ida alb icans 6215 6215 6215 6215 6215 6215
S taphy lococcus au reus 6215 6215 6215 6215 6215 6215
S alm onella paratyph iA 3116 3116 3116 3116 3116 3116
P seudom onas aeruginosa 12510 12510 12510 12510 12510 12510
E nterococcu s faecalis 50010 50010 50010 50010 50010 50010
表 6 羊耳菊茎不同溶剂提取物对 6种供试菌的 M IC值 ( m g /mL)
试验菌种 不同溶剂提取物的 M IC值甲醇 乙醇 冰醋酸 石油醚 氯仿 丙酮
E. co liO1 25010 12510 1516 - 25010 12510
Cand ida alb icans 12510 1516 718 50010 12510 6215
S taphy lococcus au reus 3116 718 718 12510 6215 1516
S alm onella paratyph iA 6215 3116 718 ) 25010 12510
P seudom onas aeruginosa 6215 1516 319 50010 50010 25010
E nterococcu s faecalis 12510 6215 3116 ) ) 50010
表 7 羊耳菊叶不同溶剂提取物对 6种供试菌的 M IC值 ( m g /mL)
试验菌种 不同溶剂提取物的 M IC值甲醇 乙醇 冰醋酸 石油醚 氯仿 丙酮
E. co liO1 12510 6215 1516 50010 12510 6215
Cand ida alb icans 613 1516 718 12510 6215 1516
S taphy lococcus au reus 1516 718 210 12510 3116 1516
S alm onella paratyph iA 3116 1516 319 25010 1516 6215
P seudom onas aeruginosa 12510 6215 718 ) 6215 12510
E nterococcu s faecalis 12510 6215 718 50010 12510 25010
从表 5~ 7可以看出,冰醋酸提取物对所有供试验
菌的 M IC值最小,其中冰醋酸叶提取物对金黄色葡萄
球菌的 M IC值为 21 0mg /mL,其次乙醇、丙酮和氯仿提
取物也都具有较广的抑菌谱, 石油醚提取物的 M IC值
较大, 说明抑菌效果较差。试管二倍稀释法测定的
M IC值与药敏纸片扩散法测定抑菌圈直径具有较好的
一致性。
3 讨 论
中草药具有抗微生物活性是由于提取物中存在着
多种的化学成分,如挥发油、黄酮类化合物、三萜类化
合物及其它天然酚类化合物, 这些物质被称之抗微生
物活性成分 [10]。从羊耳菊的研究中, 笔者已发现根、
茎、叶中具有黄酮类化合物,根中还含有较丰富的挥发
油。由于根中含有挥发油和黄酮类化合物,而叶中挥
发油含量甚微,但含有较多的黄酮类化合物,因此根和
叶提取具有较强抑菌作用。茎由于其支持功能, 含有
较多的纤维素和木质素,故单位质量的茎提取物抑菌
效果较弱。
制备不同植物提取物所用溶剂不同,是由于不同溶
剂极性和溶解性差异 [11 ]。从 6种不同溶剂提取物可知,
冰醋酸提取物抑菌效果最好,其次是乙醇、丙酮、氯仿提
取物,而石油醚提取物抑菌效果较差。说明冰醋酸是一
种提取羊耳菊黄酮类化合物的良好有机溶剂。
羊耳菊提取物对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌有很
强的抑菌作用,而对革兰氏阴性菌和真菌抑制作用较
弱,可能与细菌细胞壁的结构有关。金黄色葡萄球菌
细胞壁较厚,但结构简单, 仅具有一层肽聚糖与磷壁酸
构成的单层结构,黄酮类化合物可能容易与之结合,并
进入细胞内; 革兰氏阴性菌细胞壁虽薄, 但含有脂多
糖、脂蛋白和磷脂分子构成的外壁,黄酮类化合物不易
结合与渗入。
本文通过药敏纸片扩散法和试管二倍稀释法进行
羊耳菊抗菌作用的研究, 其结果具有相关一致性。药
敏纸片扩散法由于操作的简便性及半定量性, 更适合
用于抗菌药物的初步筛选, 而试管二倍稀释法的精确
定量关系和操作的复杂性, 更适合用于抑菌作用的指
标和动力学研究。
从本文的研究中可知, 羊耳菊用于治疗感染性疾
病,在侗族地区既具有传统的经验, 又有微生物学基
础,是一种有希望开发的天然抗菌剂。对提取物中生
物活性成分的分离纯化和进一步研究, 将有助于我们
提高羊耳菊抗微生物作用的理解。
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