全 文 ：437植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2005, 31 (4): 437-440
2004-10-21收到，2005-04-11接受。
国家自然科学基金项目(No. 30271067)资助。
*通讯作者(E-mail: lifl@bjfu.edu.cn; Tel: 010-62338717)。
低温锻炼对绵头雪莲花组织培养苗抗寒性及抗氧化酶活性的影响
陈玉珍，李凤兰 *
(北京林业大学生物科学与技术学院，教育部林木花卉育种与基因工程重点实验室，北京 100083)
摘要：高山植物绵头雪莲花(Saussurea laniceps Hand.-
Mazz.)组织培养苗经 2℃低温锻炼后抗寒性明显增强，
SOD、CAT、POD活性明显提高，可溶性蛋白质、脯
氨酸含量升高，而可溶性糖含量没有明显变化。脱锻
炼期间可溶性蛋白质含量仍高于低温锻炼期间的水平，
脱锻炼后抗氧化酶活性略有上升或保持稳定状态。这
些变化是绵头雪莲花组织培养苗适应低温逆境的生理
生化基础。
关键词：绵头雪莲花；低温锻炼；抗寒性；抗氧化酶
中图分类号：Q945
青藏高原的高山环境具有强烈的日辐射、低
温、疾风等不利于植物生长的生态条件，即使在
植物生长旺盛的 7~8月份也是“白昼如夏季，夜
晚如寒冬”，植物在 1 d中可能经历多次的冻融
胁迫(卢存福等 2003)。关于高山植物抗寒性的研
究(卢存福等 1998; 周党卫等 2003)，还仅限于野外
植物材料直接采样测定。在控制低温驯化条件
下，研究高山植物抗寒性形成的机制，很少有报
告(陈玉珍和卢存福 2002)。本文利用组织培养获
得的绵头雪莲花组织培养苗，研究低温锻炼过程
中这种高山植物的抗冻性、抗氧化酶活性、脯氨
酸以及可溶性蛋白质含量等的变化，以探索绵头
雪莲花抗寒性形成的生理生化机制。
1　材料与方法
1.1　实验材料
绵头雪莲花(S. laniceps Hand.-Mazz.)种子采自
西藏东部林芝地区。
1.2　组织培养苗的培养
将消毒后的绵头雪莲花种子播种在MS培养
基上，把长出的无菌苗叶片剪成 0.5 cm×0.5 cm，
接种在诱导愈伤组织的培养基(MS+BA0. 5 m g/L+
NAA2 mg/L)上，在黑暗中培养。再把诱导出的黄
绿色愈伤组织接种在分化培养基(MS+BA1.5 mg/L+
NAA0.2 mg/L)上，培养基的 pH为 5.8，琼脂 0.55%，蔗
糖浓度为 3%。培养室温度(昼 /夜)控制在 23/20℃。
选择长势好的幼芽在(MS+ NAA0.2 mg/L)培养基上诱
导生根，在MS培养基中继代 2次后选择长势一致
(株高 8~9 cm)的组织培养苗用于生理生化指标的测
定。
1.3　低温锻炼处理
把组培苗放置于2℃低温室(光照强度50 µmol
m-2 s-1)中低温锻炼，15 d后放到培养室(昼 /夜温
度 23/20℃，16 h光照)中脱锻炼。分别在低温锻
炼 0、3、6、9、12、15 d 和脱锻炼 1、3、5
d 后取样。称取一定量植株材料，液氮中冰冻，
锡纸严密包裹后放入 -84℃冰箱中保存。
1.4　酶活性的测定
取 1.0 g组织培养苗植株于液氮中研磨，用
50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.0)提取，13 000×g、
4℃离心 20 min，收集上清液，用于酶活性和可
溶性蛋白质含量测定。
超氧化物歧化酶 ( S O D ) 活性测定采用
Giannoplitis和 Ries ( 1977)的方法。根据 SOD抑
制氮蓝四唑(NBT)的光化还原的原理，酶活性单
位采用抑制光化还原NBT 50%为 1个活性单位。
过氧化氢酶(CAT)活性测定采用高锰酸钾滴定
法，酶活性以mg H2O2 mg-1蛋白min-1表示；过
氧化物酶(POD)活性采用李合生等(2002年)方法测
定，以每分钟内ΔA470变化0.01为1个活性单位(U) 。
上述实验采用 5株幼苗混合取样，重复 3次。
1.5　蛋白质、脯氨酸及可溶性糖含量的测定
蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝(Bradford
1976)法测定，用牛血清白蛋白做标准曲线。脯
氨酸含量测定参照朱广廉等(1990)的方法。可溶
性糖含量的测定采用蒽酮法(李合生 2002)，测定
研究简报 Short Communication
438 31卷 植物生理与分子生物学学报
结果为可溶性糖的含量占鲜重的百分比。
以上测定采用 5株幼苗混合取样，重复 3次。
1.6　抗冻性测定
把组培苗(对照、2℃低温锻炼 7 d和 15 d、
2℃低温锻炼15 d后脱锻炼3 d和5 d)放于WD4005
型低温实验箱中，以 2.5℃/h的速度降温，分别
在 -5、-10、-15、-20和 -25℃下停留 30 min
后取出冰冻的材料，在 4℃化冻过夜。然后将材
料转移到组培室(昼 /夜温度 23/20℃，16 h光照)。
在其后的 7~10 d内检测叶片的存活和植株的生长，
统计存活率。每个处理 10株组织培养苗，2个重
复。
2　结果与讨论
2.1　低温锻炼对绵头雪莲花抗冻性的影响
表 1 显示，在 23℃组培室培养的绵头雪莲花
组织培养苗能够在-5℃存活，在-10℃ 下受试植
株几乎全部受冻害死亡。经 2℃锻炼 7 d的植株，
在-10℃冰冻胁迫下，受试的 10株组织培养苗有
4株存活下来；2℃锻炼 15 d的幼苗，经-10℃胁
迫能够完全存活下来。这表明绵头雪莲花组织培
养苗有较强的耐寒性，而且抗寒力可被低温锻炼
明显提高。组织培养苗经 2℃锻炼 15 d后，脱锻
炼 3 d或 5 d，植株在-10℃下的存活率都有所下
降，但仍和低温锻炼 7 d的植株抗寒性相当。
2.2　低温锻炼后可溶性蛋白质、脯氨酸、可溶性
糖含量及抗氧化酶活性的变化
绵头雪莲花组培苗经 2℃低温锻炼，可溶性
蛋白质和脯氨酸含量明显升高，脱锻炼后可溶性
蛋白质含量仍高于低温锻炼期间的水平(图 1A、
B); 但低温锻炼并没有使绵头雪莲花组织培养苗植
株中可溶性糖含量增加(图 1C)，这与以往的研究
报告不同(李美茹等 2000; 王世珍等 2003)。
低温(2℃)锻炼后，绵头雪莲花组织培养苗
SOD、CAT活性明显升高。脱锻炼期间，酶的
活性仍高于常温生长植株的水平(图 1D、E)。2℃
低温锻炼期间，POD (U mg-1 FW min-1)活性逐步
升高，但至第 15 天又下降至对照水平。脱锻炼
3 d，POD 活性明显升高，但脱锻炼至第 5 天，
POD活性又下降至对照水平。若以U mg-1 protein
min-1来计量，低温锻炼及脱锻炼后，POD 的活
性稍有下降(图 1F)，说明 POD总活力的增加水平
低于可溶性蛋白质含量的增加。可以确信的是，
低温锻炼使上述抗氧化酶的活性均升高。
潘杰等(1994)的研究表明，低温锻炼后不同
抗寒品种冬小麦细胞内蛋白质含量的增加与其品种
的抗寒性成正相关。蛋白质含量的增加，有助于
提高细胞内的束缚水，降低冰点，并可能导致细
胞液过冷却的形成，从而成为防止细胞内结冰、
避免细胞冰冻死亡的原因之一(简令成 1992)。Xin
(1998)等对 esk1拟南芥的研究表明，高浓度的脯
氨酸是其抗冻性较高的重要原因之一。低温锻炼
使绵头雪莲花组培苗可溶性蛋白质和脯氨酸含量上
升，可能是其抗冻性增强的重要生理生化基础。
低温逆境中 SOD、CAT、POD活性水平与
植物的抗寒性强弱有着十分密切的关系，并可以
作为植物抗寒性检测的生理指标(戴金平等1991;李
美茹等 2000; Foyer等 1994)。低温锻炼提高了绵
头雪莲花组织培养苗细胞内抗氧化酶活性(图 1)，
从而会削弱由低温胁迫引起的膜蛋白和膜脂过氧
化，避免对幼苗的伤害，提高绵头雪莲花组织培
养苗的抗寒力(表 1)。这与前人用黄瓜、凤眼莲
等植物获得的结果是一致的(刘鸿先等1985; 季成等
1989; 戴金平等 1991)。
低温锻炼可以明显提高绵头雪莲花组培苗的
抗寒力，在脱锻炼过程中抗寒性生化指标维持较
高水平，加之绵头雪莲花组培苗最适生长温度较
低(适宜生长温度 20~23℃，在 5℃的条件下也可
以生长，但温度达到 25℃以上植株就会死亡)，充
分证明它保留了高山植物耐低温的遗传特性，因
此可以利用绵头雪莲花组织培养苗来研究高山植物
对模拟高山环境条件(低温、低气压、强辐射)的
生理生化适应机制。本研究为探讨高山植物对高
山环境的适应机理建立了一个可行的实验体系。
表 1　低温锻炼对绵头雪莲花组织培养苗抗冻性的影响
Table 1　Effect of cold-hardening on the freezing tolerance of
S. laniceps plantlets

Treatment of
Survival number of 10 freezed plantlets

cold-hardening
at different subzero temperatures
–5℃ –10℃ –15℃ –20℃ –25℃
Control (23℃) 10 1 0 0 0
2℃, 7 d 10 4 0 0 0
2℃,15 d 10 10 1 0 0
2℃,15 d→ 23/20℃ 3 d 10 5 0 0 0
2℃,15 d→ 23/20℃ 5 d 10 4 0 0 0
439陈玉珍等: 低温锻炼对绵头雪莲花组织培养苗抗寒性及抗氧化酶活性的影响4期
参 考 文 献
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Roles of mucilage cells and glycoproteins at mesophyll
图 1 绵头雪莲花组织培养苗低温锻炼和脱锻炼过程中可溶性蛋白质、脯氨酸、可溶性糖含量及抗氧化酶活性的变化
Fig.1 Changes in contents of soluble protein, proline and carbohydrate and activities of SOD, catalase, and peroxidase of plantlets of
S. laniceps during cold-hardening and deacclimation
An arrow indicates the starting of deacclimation (at 23/20℃) of the cold-hardened plantlets.
440 31卷 植物生理与分子生物学学报
Effects of Cold-hardening on Freezing Tolerance and Antioxidant En-
zyme Activities in Plantlets of Saussurea laniceps Hand.-Mazz.
CHEN Yu-Zhen, LI Feng-Lan*
(The Key Laboratory of Education Ministry for Genetic Breeding and Gene Engineering of Woody and Ornamental Plants, College of Biological
Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)
Abstract: Living conditions for plants in the
mountains become increasingly less favorable
with increasing altitude. In the alpine region, the
plants are commonly exposed to daily rather than
seasonal temperature fluctuations and by fre-
quent freezing temperature. To elucidate the
freezing tolerance mechanism of alpine plants,
Saussurea laniceps Hand.-Mazz.was used as a
model plant. It is a perennial herbal plant dis-
tributed in alpine regions of Yunnan and Tibet
of China. It can survive on mountains with el-
evations over 4 000 m. Wild S. laniceps plants
are propagated only by seeds in the alpine areas.
Micropropagation of S. laniceps through seed
was a desirable method to get enough seedlings
for freezing research. Micropropagation through
plantlets derived from germinated S. laniceps
seeds collected from Tibet was achieved
successfully. Activities of antioxidant enzyme
and solute contents were investigated in plant-
lets of S. laniceps. Freezing tolerance in plant-
lets increased after 7 or 15 d of cold-hardening
(Table 1). Cold-hardening (2℃) increased the
activities of SOD, peroxidase, and catalase (Fig.
1) in plantlets. A similar increase was also ob-
served in the protein and proline content (Fig.
1), whereas soluble carbohydrates changed little
(Fig.1). These results obtained suggest that the
higher activities of SOD, peroxidase, and
catalase, as well as the higher protein and pro-
line content may be biochemical adaptation for
freezing toleranc in cold-hardened S. laniceps
plantlets. Interestingly, deacclimation was slow;
even after the plants were placed again under a
temperature of 21–23℃ for 5 d, the higher freez-
ing hardiness, enzyme activities, protein and pro-
line content acquired after cold acclimation
remained. In conclusion, our plantlet cultures
have proved to be good materials for experimen-
tation on freezing resistance in study of freez-
ing-resistance mechanism in the alpine plant S.
laniceps.
Key words: Saussurea laniceps; cold-hardening; freezing
resistance; antioxidant enzyme
This work was supported by the National Natural Science Foundation
of China (No.30271067).
*Corresponding author (E-mail: lifl@bjfu.edu.cn; Tel: 010-62338717).
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