全 文 :[基金项目]国家自然科学基金项目(编号:81403188,81573887);湖北省民族药物现代化工程技术研究中心(中南民族大学)开放课题(编号:
2015ZY002) [作者简介]穆云妹,女,硕士研究生,研究方向:药物化学,电话:027-68742332,E-mail:yunmei0820mu@163.com [通讯作者]
李小军,男,博士,讲师,研究方向:药理学,电话:027-67842332,E-mail:xiaojunlixiaojun@hotmail.com
平卧菊三七对二乙基亚硝胺诱导小鼠肝脏损伤的影响
穆云妹1,李婷婷1,张妹砣1,李玉桑1,李小军1,2,唐和斌1 (1.中南民族大学药学院,湖北 武汉430074;2.中南民族
大学,湖北省民族药物现代化工程技术研究中心,湖北 武汉430074)
[摘要] 目的:探讨平卧菊三七茎提取物(Ethanol extraction from Gynura Procumbens stem,EEGS)对二乙基亚硝胺 (Dieth-
ylnirtosamine,DEN)诱导小鼠化学性肝损伤的保护作用。方法:40只昆明雄性小鼠,随机分为5组(每组8只):空白对照组、
给药对照组、DEN模型组、EEGS治疗组(50 mg·kg-1和200 mg·kg-1),模型及治疗组每周经口给予165 mg·kg-1 DEN,8周
后停止DEN处理,成模之后,治疗组及给药对照组每天灌胃相应剂量的EEGS,7 d后处死小鼠。血清用于检测ALT、AST活
性;HE、TUNEL和PAS染色分别检测组织病理学、细胞凋亡及糖原水平;RT-PCR检测肝TNF-α、AP-2等基因表达变化。
结果:与模型组相比,EEGS(200 mg·kg-1)能有效降低DEN诱导的血清ALT、AST活性以及TNF-αmRNA和AP-2 mRNA
的升高,而对PPAR-γ、HGF mRNA的升高及IL-6 mRNA的降低无明显作用;且能有效减少凋亡细胞数量并抑制糖原增多,
明显改善肝实质细胞的减少和脂肪变性等病理变化。结论:EEGS通过下调TNF-α,抑制炎症、细胞凋亡,阻止肝脏脂肪化,减
轻DEN引起的化学性肝损伤。
[关键词] 平卧菊三七;二乙基亚硝胺;肝损伤;肿瘤坏死因子;炎症;细胞凋亡;脂肪变性
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2016)08-0612-05 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2016.08.03
Effects of Gynura Procumbens(Lour.)Merr on diethylnirtosamine induced liver injury in mice
MU Yu-mei 1,LI Ting-ting1,ZHANG Mei-tuo1,LI Yu-sang1,LI Xiao-jun1,2,TANG He-bin1(1.Department of
Pharmacology,Colege of Pharmacy,South-Central University for Nationalities,Hubei Wuhan430074,China;2.Hubei Pro-
vincial Center of Modernized Engineering and Technology for Ethnic Drugs,South-Central University for Nationalities,Hubei
Wuhan 430074,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To investigated effects of an ethanol extraction from Gynura Procumbens (Lour.)Merr stem
(EEGS)on diethylnirtosamine(DEN)-induced liver injury in mice.METHODS Kunming mice were randomly divided into 5
groups(8 animals in each group):control group,EEGS only group,DEN model group and DEN+ EEGS treatment groups.
DEN(165 mg·kg-1)per week was taken oraly for 8 weeks to induce hepatic damage.Mice in DEN+EEGS treatment groups
received oral EEGS(50 or 200 mg·kg-1·d-1)for 7 d.Serum ALT,AST and mRNA expressions of TNF-αand AP-2in liver
tissues were detected.Paraffin-embedded liver tissues were used for H&E staining,TUNEL staining and PAS staining.RE-
SULTS EEGS at dose of 200 mg·kg-1·d-1 reduced elevation of DEN-induced ALT(239%to 135%of control),TNF-αmR-
NA level(10-to 4-fold of control),AP-2 mRNA level(295%to 138% of control),TUNEL apoptotic index(6.3%to
1.1%)and content of hepatic glycogen.Both hepatocyte loss and steatosis induced by DEN were also significantly resorted af-
ter EEGS treatment.CONCLUSION EEGS exerts inhibitory effects on DEN-induced liver damage(including inflammation,
apoptosis and steatosis)in mice through down-regulation of TNF-αexpression.
KEY WORDS:Gynura Procumbens(Lour.)Merr;diethylnirtosamine;liver injury;tumor necrosis factor-α;inflammation;ap-
optosis;steatosis
肝损伤是临床常见的危害人类健康的病因之
一。肝损伤是因肝脏受到外界伤害性因素的入侵,
从而引起的肝脏受损,化学性肝损伤是由化学性肝
毒性物质所造成的[1]。二乙基亚硝胺(Diethylnir-
tosamine,DEN)可造成严重的化学性肝损伤,若任
肝损伤恶化发展,最终会转变为肝硬化,甚至恶化为
肝癌。DEN 在日常饮食中普遍存在而又难以发
现[2]。因此急需寻求一种有效的治疗DEN等肝毒
物引起的肝损伤药物。
平卧 菊 三 七 [Gynura Procumbens (Lour.)
Merr]是菊科菊三七属的植物,分布于越南、泰国、
印度尼西亚和非洲以及中国的广东、海南、贵州、云
南、江西等地[3]。在我国,平卧菊三七被批准为新资
源食品(卫生部公告2012年第8号),且是传统的药
·216· 中国医院药学杂志2016年4月第36卷第8期Chin Hosp Pharm J,Apr 2016,Vol 36,No.8
用植物,在云南被称为“帕崩板”。傣药主要以雅解
理论和方药来治疗肝病,提倡服用解药,解除毒素,
保持体内四塔(风、火、水、土)的平衡和协调[4]。平
卧菊三七作为传统傣药广泛用于治疗跌打损伤、骨
折等[5];在马来西亚,平卧菊三七是一种传统食物和
药物,被称为“sambung nyawa”,用于治疗糖尿病、
癌症、肾病和高血压[6]。
平卧菊三七叶是传统的药用和食用部位,其茎,
特别是老茎,在习惯上常被扔弃。前期研究发现平
卧菊三七茎醇提浸膏可有效保护酒精诱导的肝损[7]
和药物引起的肝脏损伤,后者可能与其抗炎、抗凋亡
作用有关。本文探讨其对DEN诱导小鼠肝损的治
疗作用以开发傣药平卧菊三七的新用途。
1 材料
1.1 动物 SPF级雄性昆明小鼠,体质量20~25
g,合格证号:4200499718,由湖北省食品药品安全性
评价中心提供,许可证号:SCK(鄂)2008-0005。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 试剂 DEN(梯希爱化成工业发展有限公
司,上海);平卧菊三七产自于广东汕头,由中科院武
汉植物所张炳坤教授鉴定;谷丙转氨酶检测试剂盒
与谷草转氨酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究
所,南 京);TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl
transferase dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测
试剂盒(博士德生物有限公司,武汉);PAS(Peri-
odic acid-schiff)染色液试剂盒(源叶生物有限公
司,上海);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司,
上海);RNAiso Plus,Prime Script RT reagent Kit
(Perfect Real Time),SYBR Premix ET Taq(Tli
RNaseH Plus;TaKaRa,大连);肿瘤坏死因子-α
(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、脂肪细胞型脂
肪酸结合蛋白(Adipocyte fatty acid binding pro-
tein-2,AP-2)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ
(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ,
PPAR-γ)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肝细
胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)和甘
油醛-3-磷酸脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase,GAPDH)的引物由大连TaKaRa公
司合成,引物序列见表1。
1.2.2 仪器 多功能酶标仪(M200,TECAN,德
国);实时荧光定量PCR仪(TP800)和梯度PCR仪
(TP600)(TaKaRa,日本);冷冻离心机(5804R,Ep-
pendorf,德国);半自动台式组织脱水机(TP1020),
加热石蜡包埋系统(EG1150),全自动轮转式切片机
(RM2265),石蜡切片摊片机(HI1210)和石蜡切片
表1 用于RT-PCR的引物序列
Tab 1 Primer sequences for RT-PCR analysis
基因 序列 大小/bp
TNF-α F:5’-TGCTTGTTCCTCAGCCTCTT-3’
R:5’-CAGAGGGCTGATTAGAGAGAGGT-3’
132
AP-2 F:5’-CATGGCCAAGCCCAACAT-3’
R:5’-CGCCCAGTTTGAAGGAAATC-3’
101
PPAR-γF:5’-CGCTGATGCACTGCCTATGA-3’
R:5’-AGAGGTCCACAGAGCTGATTCC-3’
195
IL-6 F:5’-CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA-3’
R:5’-CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTC-3’
169
HGF F:5’-CCATGAATTTGACCTCTATGA-3’
R:5’-CTGAGGAATCTCACAGACTTC-3’
262
GAPDH F:5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’
R:5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’
321
烤片台(HI1220)(Leica,德国);显微镜(50i,Nikon,
日本);中草药粉碎机(FW177,泰斯特,天津);旋转
蒸发仪(RE-52A,亚荣,上海);冷冻干燥机(FD-
1B-50,博医康,北京)。
1.3 平卧菊三七茎提取物(Ethanol extraction
from G.procumbens stem,EEGS)的制备 取干燥
茎称重后粉碎,每次加入10倍体积/重量的80%乙
醇,85℃回流提取1 h,提取3次,合并提取液并浓
缩干燥,得干浸膏(密度1.40 g·L-1),得率约为
18.5%。经高效液相色谱鉴定发现平卧菊三七茎
提取物(EEGS)中含有新绿原酸0.01%,绿原酸
0.27%,异 绿 原 酸 A 0.28%,异 绿 原 酸 B
0.051%,异绿原酸C0.12%[8]。
2 方法
2.1 分组及给药 40只雄性昆明小鼠,采用随机
数字表法分为5组:空白对照组 (control group)、
给药对照组(EEGS group)、DEN 模型组(DEN
group)、EEGS治疗组[DEN+EEGS(50 mg·kg-1)
group]和[DEN+EEGS(200 mg·kg-1)group],每
组8只。DEN模型组、2组EEGS治疗组分别经口
给予165 mg·kg-1 DEN,其余2组给予等量生理盐
水,每周1次,共8周;模型成功后,给药对照组(200
mg·kg-1)、EEGS治疗组(50 mg·kg-1)及EEGS治
疗组(200 mg·kg-1)灌胃EEGS,其余2组给予等量
生理盐水,每天1次,连续7 d。最后一次给药结束
4 h后,摘取眼球取血,小鼠处死后取肝脏。肝脏分
为两份,一份经体积分数为4%甲醛溶液固定,一份
-80℃保存备用。
2.2 生化指标检测 血样静置离心制得血清,按照
谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)及谷草转
氨酶(Aspartate transaminase,AST)检测试剂盒测
定谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性[9]。
2.3 组织病理学观察 上述肝脏组织固定后,包埋
切片,脱水脱蜡后经苏木精-伊红染色(Hematoxy-
·316·中国医院药学杂志2016年4月第36卷第8期Chin Hosp Pharm J,Apr 2016,Vol 36,No.8
lin-Eosin,HE)后检测病理组织形态学变化,切片运
用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒完成 TUNEL染
色以观察细胞凋亡,其中,细胞呈棕褐色的为阳性表
达及凋亡细胞;再运用 PAS染色液试剂盒完成
PAS染色以观察肝糖原情况,其中,细胞质中呈紫
红色的颗粒即为散在的糖原,出现在细胞核内较为
透亮的即为核糖原。
2.4 RT-PCR检测肝组织中TNF-α、AP-2、PPAR-
γ、IL-6、HGF mRNA的表达 取-80℃保存的肝
组织100 mg,研磨至粉末加入1 mL RNAiso Plus,
提取小鼠肝组织总RNA。总RNA定量提纯后,严
格按照Prime Script RT reagent Kit(Perfect Real
Time)说明书操作,检测内参 GAPDH 和 TNF-α、
AP-2、PPAR-γ、IL-6、HGF等mRNA的表达水平。
2.5 统计学方法 采用SPSS19.0进行统计分析,
以空白对照组的均值为标准,其余各组值与之相比,
所得比值作为统计值珚x±s,组间数据采用one-way
ANOVA并进行Tukey检验。
3 结果
3.1 EEGS对DEN模型小鼠肝功能的影响 如表
2所示,与空白对照小鼠血清中 ALT活性相比,
DEN模型组小鼠血清中ALT活性显著提高,有统
计学意义(P<0.01);EEGS治疗组的ALT活性均
降低,与 DEN 模型组相比,其中 200 mg·kg-1
EEGS治疗组显著性下降,有统计学意义(P<
0.01)。
表2 EEGS对DEN模型小鼠肝功能的影响(珚x±s,n=8)
Tab 2 Effects of EEGS on hepatic functions in DEN-in-
duced liver injury mice(珚x±s,n=8)
组别 ALT/U·L-1 AST/U·L-1
空白对照组 30.9±7.5 72.6±16.8
EEGS组 24.1±9.8 70.3±8.3
DEN模型组 74.1±8.9b 129.8±38.4
DEN+EEGS(50 mg·kg-1) 65.8±4.3 100.5±4.7
DEN+EEGS(200 mg·kg-1) 41.7±6.6b 100.4±9.9
注:与空白对照组比较,b P<0.01;与模型组比较,b P<0.01
3.2 EEGS对DEN模型小鼠肝脏炎症、脂肪化及
增殖相关基因表达的影响 图1所示分别为肝脏
TNF-α、AP-2、PPAR-γ、IL-6和 HGF的 mRNA水
平变化。与相应空白对照组相比,DEN 模型组
TNF-α、AP-2、PPAR-γ和平均上调,其中 TNF-α、
AP-2、HGF的 mRNA水平显著性上调,有统计学
意义(P<0.01);与DEN模型组相比,EEGS治疗
组的TNF-α、AP-2 mRNA表达均降低,无统计学意
义。
3.3 EEGS对DEN模型小鼠肝组织病理学的影响
如图2所示,与空白对照相比,DEN模型组的肝脏
注:与空白对照组比较,aP<0.05,b P<0.01
Note:aP<0.05,b P<0.01,vs.control group
图1 EEGS对DEN模型小鼠肝脏炎症、脂肪化及增殖相关基因表
达的影响(珚x±s,n=8)
Fig 1 Effects of EEGS on expression of genes related to inflamma-
tion,steatosis and proliferation in DEN-induced liver injury mice(珚x
±s,n=8)
组织可见大量的细胞坏死和脂肪空泡,肝实质细胞
数量也有所减少;而与DEN模型组相比,EEGS治
疗组肝脏组织的实质细胞减少、细胞坏死和脂肪空
泡程度均明显减。
3.4 EEGS对DEN模型小鼠细胞凋亡的影响 图
3为肝脏组织的TUNEL染色结果,其中,图3F为
阳性细胞表达率,包括凋亡细胞及吞噬了凋亡细胞
的巨噬细胞。与空白对照相比,DEN模型组肝脏出
现大量凋亡细胞,且可见散在的吞噬了凋亡细胞的
巨噬细胞,阳性细胞表达率显著升高;而与DEN模
型组相比,EEGS治疗组的凋亡细胞数量均减少,且
吞噬了凋亡细胞的巨噬细胞也相应减少,其中200
mg·kg-1 EEGS治疗组的减少较多,阳性细胞表达
率为1.1%,相对于 DEN模型组(表达率为6.3%)
明显降低。
A.空白对照组;B.EEGS组;C.DEN模型组;D.DEN+EEGS(50
mg·kg-1)组;E.DEN+EEGS(200 mg·kg-1)组
A.control group;B.EEGS group;C.DEN model group;D.DEN+
EEGS(50 mg·kg-1)group;E.DEN+EEGS(200 mg·kg-1)
group
图2 通过 HE染色检测EEGS对DEN模型小鼠肝组织病理学的
影响(×200,标尺50μm)
Fig 2 Effects of EEGS on histopathological changes of liver tissues
in DEN-treated mice with HE staining(×200,scale bars=50μm)
3.5 EEGS对DEN模型小鼠糖原分布的影响 如
图4所示,与空白对照相比,DEN模型组肝糖原清
晰可见,且大量聚集,可见散在的核糖原;而与DEN
·416· 中国医院药学杂志2016年4月第36卷第8期Chin Hosp Pharm J,Apr 2016,Vol 36,No.8
A.空白对照组;B.EEGS组;C.DEN模型组;D.DEN+EEGS(50
mg·kg-1)组;E.DEN+EEGS(200 mg·kg-1)组;F.阳性细胞表达
率;▲.阳性细胞;↙.吞噬了凋亡细胞的巨噬细胞
A.control group;B.EEGS group;C.DEN model group;D.DEN+
EEGS(50 mg·kg-1)group;E.DEN+EEGS (200 mg·kg-1)
group;F.expression of positive cels;▲.positive cel;↙.apoptotic
cel swalowed by macrophages
图3 通过TUNEL染色检测EEGS对DEN模型小鼠细胞凋亡的
影响(×400,标尺50μm)
Fig 3 Effects of EEGS on apoptosis in liver tissues of DEN-treated
mice using TUNEL staining(×400,scale bars=50μm)
模型组相比,EEGS治疗组的肝糖原聚集情况均得
到较大改善,其中200 mg·kg-1 EEGS治疗组肝糖
原减少较多。再者,肝细胞核糖原化是静态性非酒
精性脂肪性肝炎的组织学特点,图片可见EEGS治
疗组的核糖原数量也相应减少。
A.空白对照组;B.EEGS组;C.DEN模型组;D.DEN+EEGS(50
mg·kg-1)组;E.DEN+EEGS(200 mg·kg-1)组;←.核糖原
A.control group;B.EEGS group;C.DEN model group;D.DEN+
EEGS(50 mg·kg-1)group;E.DEN+EEGS (200 mg·kg-1)
group;←.nuclear glycogen
图4 通过PAS染色检测EEGS对DEN模型小鼠糖原分布的影响
(×200,标尺50μm)
Fig 4 Effects of EEGS on glycogen distribution in liver tissues of
DEN-treated mice using PAS staining(×200,scale bars=50μm)
4 讨论
在东南亚等地,傣药平卧菊三七被广泛用于治
疗癌症、糖尿病和高血压等疾病[10],其传统用药部
位和食用部位为叶,茎则习惯性被扔弃。为了探讨
茎是否也具备药用价值,将制备的平卧菊三七茎的
醇提浸膏用于治疗DEN引起的小鼠肝脏损伤。经
研究发现,EEGS具有较好的治疗作用。由于DEN
常用于诱导肝癌模型,EEGS对抗DEN肝损提示了
其用于治疗癌症的可行性。与平卧菊三七叶提取物
在细胞水平抗癌细胞株增殖作用一致[11-12]。
研究结果显示,高剂量组的EEGS对正常小鼠
肝脏功能无影响。建立DEN诱导的化学性肝脏损
伤模型,并给予EEGS治疗,采集样本后检测实验
动物肝功能及其肝脏组织病理学,确定EEGS的护
肝作用。结果显示,高剂量EEGS治疗组的 ALT
活性较DEN模型组,从(74.1±8.9)U·L-1降低到
(41.7±6.6)U·L-1具有显著性差异,提示EEGS
可以在一定程度上恢复肝功能,减少DEN对肝细
胞的损伤;肝脏病理组织形态学检测结果也证实了
这一点,EEGS治疗组的肝脏实质细胞减少、细胞坏
死和脂肪空泡程度均较模型组有明显好转,对抗了
DEN的肝细胞毒性。而且,DEN可能通过抑制糖
原合酶激酶-3β(GSK-3β)的活性,糖原合酶活性增
加,促进肝细胞糖原合成含量增加[13],糖代谢异常
导致了脂肪代谢异常,促进外周脂肪分解游离脂肪
酸含量增加,肝组织脂肪变性累积。而EEGS可能
通过抑制这一过程,降低DEN对肝细胞的损伤。
TNF-α生物学功能非常复杂,可通过与其受体
结合,实现其炎症、脂肪化、凋亡等方面的相关功
能[14]。研究发现,EEGS护肝作用与TNF-α密切相
关,我们并检测了相关基因,包括与炎症相关的
TNF-α和IL-6,与脂肪化相关的AP-2和PPAR-γ,
以及与增殖相关的 HGF等 mRNA表达。结果显
示,相对于DEN模型组,EEGS能有效降低TNF-α
和AP-2 mRNA水平。文献[15]报道,AP-2参与调
节TNF-α诱导的炎症反应,结合TNF-α、AP-2的下
调及 HE染色中炎性细胞的减少,表明EEGS能有
效抑制TNF-α诱导的炎症反应;且AP-2是脂类储
存及调节脂类代谢的靶基因[16],综合 HE 染色、
PAS染色中脂肪变性程度的改善,推测EEGS通过
下调TNF-α、AP-2诱导的炎症反应改善脂肪化;再
者,TNF-α通过介导多种途径诱导凋亡[16],其中包
含ASK1-JNK信号通路。文献报道,伴有脂肪蓄积
的肝脏细胞对其十分敏感,且在肝脏中,单核细胞或
Kupffer细胞吞噬的凋亡细胞也与TNF-α的上调有
关[17]。结合TUNEL染色结果,EEGS治疗组的凋
亡细胞数量较模型组减少,显示 EEGS通过下调
TNF-α诱导的炎症反应,抑制凋亡。
综上所述,平卧菊三七茎醇提浸膏EEGS通过
下调肝脏TNF-α水平,抑制炎症、细胞凋亡,同时改
善肝脏脂肪化,具有保护DEN诱导的小鼠化学性
肝损伤的作用。
参考文献:
[1] 黄秀曼,杜钢军,孙婷,等.过山蕨总黄酮对肝损伤的保护作用
[J].中草药,2012,43(12):2458-2463.
[2] Pradeep K,Mohan CV,Gobianand K,et al.Effect of Cassia fis-
·516·中国医院药学杂志2016年4月第36卷第8期Chin Hosp Pharm J,Apr 2016,Vol 36,No.8
tula Linn.Leaf extract on diethylnitrosamine induced hepatic
injury in rats[J].Chem Biol Interact,2007,167(1):12-18.
[3] Rosidah,Yam MF,Sadikun A,et al.Toxicology evaluation of
standardized methanol extract of Gynura procumbens[J].J
Ethnopharmacol,2009,123(2):244-249.
[4] 吕显荣,张闯,陈眉,等.傣医“雅解”理论及其方药的研究进展.
云南中医学院学报,32(2):24-26,2009.
[5] 吴爱萍,代蓉,李相融,等.傣医解药雅解沙把对小鼠急性化学
性肝损伤的保护作用[J].中国民族医药杂志,2012,11(11):
56-60.
[6] Lee HW,Hakim P,Rabu A,et al.Antidiabetic effect of Gynu-
ra procumbens leaves extracts involve modulation of hepatic
carbohydrate metabolism in streptozotocin-induced diabetic
rats[J].J Med Plant Res,2012,6(5):796-812.
[7] Li XJ,Mu YM,Li TT,et al.Gynura procumbens reverses a-
cute and chronic ethanol-induced liver steatosis through
MAPK/SREBP-1c-dependent and-independent pathways[J].
J Agric Food Chem,2015,63(38):8460-8471.
[8] 李小军,张妹砣,穆云妹,等.平卧菊三七中绿原酸类成分的分
离鉴定及“一测多评”[J].中国医院药学杂志,2015,35(22):
2007-2011.
[9] WeiJB,Huang QF,Huang RB,et al.Asiatic acid from Potentil-
la chinensis attenuate ethanol-induced hepatic injury via sup-
pression of oxidative stress and Kupffer cel activation[J].Biol
Pharmaceutical Bul,2013,36(12):1980-1989.
[10]朱柏任,濮社班,徐德然,等.菊三七属植物化学成分及药理作
用的研究进[J].中国野生植物资源,2012,40(4):666-669.
[11]Wang H,Zhou JW,Fu DH,et al.Gynura procumbensethanolic
extract suppresses osteosarcoma cel proliferation and metasta-
sis in vitro[J].Oncol Lett,2013,6(1):113-117.
[12]Hew CS,Khoo BY,Gam LH.The anti-cancer property of pro-
teins extracted from Gynura procumbens(Lour.)Merr[J].
PLoS One,2013,8(7):e68524:1-10.
[13]吴秦川,李三强,胡景峰,等.二乙基亚硝胺诱导小鼠原发性肝
细胞癌过程中肝糖原的表达分析[J].中国临床药理学杂志,
2015,31(10):851-854.
[14]于晨辉,杜仲燕,高佳,等.4-HNE通过抑制 TNF-α介导的
NF-κB活化诱导酒精性肝损伤[J].中国病理生理杂志,2013,
29(6):1046-1052.
[15]Fu Y,Ishi KK,Munakata Y,et al.Regulation of tumor necro-
sis factor alpha promoter by human parvovirus B19 NS1
through activation of AP-1 and AP-2[J].J Virol,2002,76
(11):5395-5403.
[16]刘莉,刘亚莉,任亚浩,等.SOCS-3抑制对膳食诱导肥胖大鼠
脂肪细胞 PPAR 及 AP-2表达的影响[J].实用预防医学,
2011,18(6):975-977.
[17]Cheng Q,Li N,Chen MQ,et al.Cyclooxygenase-2 promotes
hepatocelular apoptosis by interacting with TNF-αand IL-6in
the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis in rats[J].Dig
Dis Sci,2011,58(10):2895-2902.
[收稿日期]2015-09-28
[基金项目]安徽医科大学第二附属医院博士科研启动基金(编号:2012BKJ022) [作者简介]胡伟,男,博士,副教授,副主任药师,硕士生导
师,研究方向:临床药学,电话:0551-63866050,E-mail:ay2fyhuwei@qq.com
液-质联用法测定人体血浆中万古霉素的浓度
胡伟,陈璐璐,孙成,朱熙,郭成,刘丽萍 (安徽医科大学第二附属医院药学部,安徽 合肥230601)
[摘要] 目的:运用液-质联用技术(LC-MS/MS),建立测定人体血浆中万古霉素浓度的方法,监测万古霉素血药浓度。方法:
以替洛福韦为内标,乙腈沉淀蛋白后,经LC-MS/MS方法分析。采用色谱柱为安捷伦 Poroshel 120 EC-C18柱(4.6 mm×100
mm,2.7μm),流动相为混合有机相(乙腈∶甲醇-2∶1)-0.1%甲酸水溶液(10∶90);流速0.4 mL·min
-1;采用质谱电喷雾电离源
(ESI),正离子模式,多重反应监测方式(MRM)检测;待测物质万古霉素用于定量的母子离子对:m/z 725.6→m/z 144.2,内
标替洛福韦用于定量的母子离子对:m/z288.0→m/z176.2。结果:万古霉素在0.2~100μg·mL
-1范围内线性关系良好,最
低定量限为0.2μg·mL
-1;日内RSD均在6%以下,日间RSD均在12%以下。提取回收率为58.01%~66.58%。结论:该分
析方法快速、准确、灵敏度高、专属性强、重复性好,可用于医疗机构检测人体血浆中万古霉素的药物浓度。
[关键词] 万古霉素;液-质联用法;血药浓度
[中图分类号]R927 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2016)08-0616-05 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2016.08.04
Determination of vancomycin in human plasma by LC-MS/MS
HU Wei,CHEN Lu-lu,SUN Cheng,ZHU Xi,GUO Cheng,LIU Li-ping(Department of Pharmacy,Second
Hospital of Anhui Medical University,Anhui Hefei 230601,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To develop an LC-MS/MS method for determination of vancomycin concentration in plasma.
METHODS Plasma samples were precipitated by acetonitrile.Tenofovirdisoproxil was used as internal standard.Agilent Po-
roshel 120 EC-C18column(4.6 mm×100 mm,2.7μm)was adopted,mixed organic phase(acetonitrile∶methanol-2∶1)-0.1%
formic acid water solution(10∶90)was mobile phase,at a flow rate of 0.4 mL·min-1.Analytes were determined by using pos-
·616· 中国医院药学杂志2016年4月第36卷第8期Chin Hosp Pharm J,Apr 2016,Vol 36,No.8