全 文 ：［基金项目］国家自然科学基金项目（编号：８１４０３１８８，８１５７３８８７）；湖北省民族药物现代化工程技术研究中心（中南民族大学）开放课题（编号：
２０１５ＺＹ００２）　［作者简介］穆云妹，女，硕士研究生，研究方向：药物化学，电话：０２７－６８７４２３３２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｎｍｅｉ０８２０ｍｕ＠１６３．ｃｏｍ　［通讯作者］
李小军，男，博士，讲师，研究方向：药理学，电话：０２７－６７８４２３３２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｏｊｕｎｌｉｘｉａｏｊｕｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
平卧菊三七对二乙基亚硝胺诱导小鼠肝脏损伤的影响
穆云妹１，李婷婷１，张妹砣１，李玉桑１，李小军１，２，唐和斌１　 （１．中南民族大学药学院，湖北 武汉４３００７４；２．中南民族
大学，湖北省民族药物现代化工程技术研究中心，湖北 武汉４３００７４）
［摘要］　目的：探讨平卧菊三七茎提取物（Ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｇｙｎｕｒａ　Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ　ｓｔｅｍ，ＥＥＧＳ）对二乙基亚硝胺 （Ｄｉｅｔｈ－
ｙｌｎｉｒｔｏｓａｍｉｎｅ，ＤＥＮ）诱导小鼠化学性肝损伤的保护作用。方法：４０只昆明雄性小鼠，随机分为５组（每组８只）：空白对照组、
给药对照组、ＤＥＮ模型组、ＥＥＧＳ治疗组（５０　ｍｇ·ｋｇ－１和２００　ｍｇ·ｋｇ－１），模型及治疗组每周经口给予１６５　ｍｇ·ｋｇ－１　ＤＥＮ，８周
后停止ＤＥＮ处理，成模之后，治疗组及给药对照组每天灌胃相应剂量的ＥＥＧＳ，７　ｄ后处死小鼠。血清用于检测ＡＬＴ、ＡＳＴ活
性；ＨＥ、ＴＵＮＥＬ和ＰＡＳ染色分别检测组织病理学、细胞凋亡及糖原水平；ＲＴ－ＰＣＲ检测肝ＴＮＦ－α、ＡＰ－２等基因表达变化。
结果：与模型组相比，ＥＥＧＳ（２００　ｍｇ·ｋｇ－１）能有效降低ＤＥＮ诱导的血清ＡＬＴ、ＡＳＴ活性以及ＴＮＦ－αｍＲＮＡ和ＡＰ－２　ｍＲＮＡ
的升高，而对ＰＰＡＲ－γ、ＨＧＦ　ｍＲＮＡ的升高及ＩＬ－６　ｍＲＮＡ的降低无明显作用；且能有效减少凋亡细胞数量并抑制糖原增多，
明显改善肝实质细胞的减少和脂肪变性等病理变化。结论：ＥＥＧＳ通过下调ＴＮＦ－α，抑制炎症、细胞凋亡，阻止肝脏脂肪化，减
轻ＤＥＮ引起的化学性肝损伤。
［关键词］　平卧菊三七；二乙基亚硝胺；肝损伤；肿瘤坏死因子；炎症；细胞凋亡；脂肪变性
［中图分类号］Ｒ２８５．５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１６）０８－０６１２－０５　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１６．０８．０３
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｇｙｎｕｒａ　Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｍｅｒｒ　ｏｎ　ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｒｔｏｓａｍｉｎｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ
ＭＵ　Ｙｕ－ｍｅｉ　１，ＬＩ　Ｔｉｎｇ－ｔｉｎｇ１，ＺＨＡＮＧ　Ｍｅｉ－ｔｕｏ１，ＬＩ　Ｙｕ－ｓａｎｇ１，ＬＩ　Ｘｉａｏ－ｊｕｎ１，２，ＴＡＮＧ　Ｈｅ－ｂｉｎ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｈｕｂｅｉ　Ｗｕｈａｎ４３００７４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｕｂｅｉ　Ｐｒｏ－
ｖｉｎｃｉａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｍｏｄｅｒｎｉｚｅｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　Ｅｔｈｎｉｃ　Ｄｒｕｇｓ，Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｈｕｂｅｉ
Ｗｕｈａｎ　４３００７４，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｎ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｇｙｎｕｒａ　Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ （Ｌｏｕｒ．）Ｍｅｒｒ　ｓｔｅｍ
（ＥＥＧＳ）ｏｎ　ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｒｔｏｓａｍｉｎｅ（ＤＥＮ）－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｋｕｎｍｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　５
ｇｒｏｕｐｓ（８　ａｎｉｍａｌｓ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ）：ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ＥＥＧＳ　ｏｎｌｙ　ｇｒｏｕｐ，ＤＥＮ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＤＥＮ＋ ＥＥＧＳ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐｓ．
ＤＥＮ（１６５　ｍｇ·ｋｇ－１）ｐｅｒ　ｗｅｅｋ　ｗａｓ　ｔａｋｅｎ　ｏｒａｌｙ　ｆｏｒ　８　ｗｅｅｋｓ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｄａｍａｇｅ．Ｍｉｃｅ　ｉｎ　ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐｓ
ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｏｒａｌ　ＥＥＧＳ（５０　ｏｒ　２００　ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）ｆｏｒ　７　ｄ．Ｓｅｒｕｍ　ＡＬＴ，ＡＳＴ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＴＮＦ－αａｎｄ　ＡＰ－２ｉｎ　ｌｉｖｅｒ
ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　Ｈ＆Ｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＴＵＮＥＬ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＰＡＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．ＲＥ－
ＳＵＬＴＳ　ＥＥＧＳ　ａｔ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　２００　ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｅｌｅｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＥＮ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ＡＬＴ（２３９％ｔｏ　１３５％ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ），ＴＮＦ－αｍＲ－
ＮＡ　ｌｅｖｅｌ（１０－ｔｏ　４－ｆｏｌｄ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ），ＡＰ－２　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ（２９５％ｔｏ　１３８％ ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ），ＴＵＮＥＬ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｉｎｄｅｘ（６．３％ｔｏ
１．１％）ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ．Ｂｏｔｈ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｌｏｓｓ　ａｎｄ　ｓｔｅａｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＤＥＮ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｒｅｓｏｒｔｅｄ　ａｆ－
ｔｅｒ　ＥＥＧＳ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　ＥＥＧＳ　ｅｘｅｒｔｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ＤＥＮ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｄａｍａｇｅ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＮＦ－αｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｇｙｎｕｒａ　Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｍｅｒｒ；ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｒｔｏｓａｍｉｎｅ；ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ；ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α；ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；ａｐ－
ｏｐｔｏｓｉｓ；ｓｔｅａｔｏｓｉｓ
　　肝损伤是临床常见的危害人类健康的病因之
一。肝损伤是因肝脏受到外界伤害性因素的入侵，
从而引起的肝脏受损，化学性肝损伤是由化学性肝
毒性物质所造成的［１］。二乙基亚硝胺（Ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｒ－
ｔｏｓａｍｉｎｅ，ＤＥＮ）可造成严重的化学性肝损伤，若任
肝损伤恶化发展，最终会转变为肝硬化，甚至恶化为
肝癌。ＤＥＮ 在日常饮食中普遍存在而又难以发
现［２］。因此急需寻求一种有效的治疗ＤＥＮ等肝毒
物引起的肝损伤药物。
平卧 菊 三 七 ［Ｇｙｎｕｒａ　Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ （Ｌｏｕｒ．）
Ｍｅｒｒ］是菊科菊三七属的植物，分布于越南、泰国、
印度尼西亚和非洲以及中国的广东、海南、贵州、云
南、江西等地［３］。在我国，平卧菊三七被批准为新资
源食品（卫生部公告２０１２年第８号），且是传统的药
·２１６· 中国医院药学杂志２０１６年４月第３６卷第８期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｐｒ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．８
用植物，在云南被称为“帕崩板”。傣药主要以雅解
理论和方药来治疗肝病，提倡服用解药，解除毒素，
保持体内四塔（风、火、水、土）的平衡和协调［４］。平
卧菊三七作为传统傣药广泛用于治疗跌打损伤、骨
折等［５］；在马来西亚，平卧菊三七是一种传统食物和
药物，被称为“ｓａｍｂｕｎｇ　ｎｙａｗａ”，用于治疗糖尿病、
癌症、肾病和高血压［６］。
平卧菊三七叶是传统的药用和食用部位，其茎，
特别是老茎，在习惯上常被扔弃。前期研究发现平
卧菊三七茎醇提浸膏可有效保护酒精诱导的肝损［７］
和药物引起的肝脏损伤，后者可能与其抗炎、抗凋亡
作用有关。本文探讨其对ＤＥＮ诱导小鼠肝损的治
疗作用以开发傣药平卧菊三七的新用途。
１　材料
１．１　动物　ＳＰＦ级雄性昆明小鼠，体质量２０～２５
ｇ，合格证号：４２００４９９７１８，由湖北省食品药品安全性
评价中心提供，许可证号：ＳＣＫ（鄂）２００８－０００５。
１．２　仪器与试剂
１．２．１　试剂　ＤＥＮ（梯希爱化成工业发展有限公
司，上海）；平卧菊三七产自于广东汕头，由中科院武
汉植物所张炳坤教授鉴定；谷丙转氨酶检测试剂盒
与谷草转氨酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究
所，南 京）；ＴＵＮＥＬ （Ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｄＵＴＰ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）细胞凋亡检测
试剂盒（博士德生物有限公司，武汉）；ＰＡＳ（Ｐｅｒｉ－
ｏｄｉｃ　ａｃｉｄ－ｓｃｈｉｆｆ）染色液试剂盒（源叶生物有限公
司，上海）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，
上海）；ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ，Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ
（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ），ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥＴ　Ｔａｑ（Ｔｌｉ
ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ；ＴａＫａＲａ，大连）；肿瘤坏死因子－α
（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α，ＴＮＦ－α）、脂肪细胞型脂
肪酸结合蛋白（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ－２，ＡＰ－２）、过氧化物酶体增殖物激活受体－γ
（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－γ，
ＰＰＡＲ－γ）、白细胞介素－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）、肝细
胞生长因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＨＧＦ）和甘
油醛－３－磷酸脱氢酶 （Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＡＰＤＨ）的引物由大连ＴａＫａＲａ公
司合成，引物序列见表１。
１．２．２　仪器　多功能酶标仪（Ｍ２００，ＴＥＣＡＮ，德
国）；实时荧光定量ＰＣＲ仪（ＴＰ８００）和梯度ＰＣＲ仪
（ＴＰ６００）（ＴａＫａＲａ，日本）；冷冻离心机（５８０４Ｒ，Ｅｐ－
ｐｅｎｄｏｒｆ，德国）；半自动台式组织脱水机（ＴＰ１０２０），
加热石蜡包埋系统（ＥＧ１１５０），全自动轮转式切片机
（ＲＭ２２６５），石蜡切片摊片机（ＨＩ１２１０）和石蜡切片
表１　用于ＲＴ－ＰＣＲ的引物序列
Ｔａｂ　１　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ
基因 序列 大小／ｂｐ
ＴＮＦ－α Ｆ：５’－ＴＧＣＴＴＧＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴ－３’
Ｒ：５’－ＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＡＴＴＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴ－３’
１３２
ＡＰ－２　 Ｆ：５’－ＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴ－３’
Ｒ：５’－ＣＧＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣ－３’
１０１
ＰＰＡＲ－γＦ：５’－ＣＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡ－３’
Ｒ：５’－ＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＣ－３’
１９５
ＩＬ－６　 Ｆ：５’－ＣＣＡＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＴＴＡ－３’
Ｒ：５’－ＣＣＡＧＴＴＴＧＧＴＡＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＴＴＴＣ－３’
１６９
ＨＧＦ　 Ｆ：５’－ＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＡ－３’
Ｒ：５’－ＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴＣ－３’
２６２
ＧＡＰＤＨ　Ｆ：５’－ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ－３’
Ｒ：５’－ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧ－３’
３２１
烤片台（ＨＩ１２２０）（Ｌｅｉｃａ，德国）；显微镜（５０ｉ，Ｎｉｋｏｎ，
日本）；中草药粉碎机（ＦＷ１７７，泰斯特，天津）；旋转
蒸发仪（ＲＥ－５２Ａ，亚荣，上海）；冷冻干燥机（ＦＤ－
１Ｂ－５０，博医康，北京）。
１．３　平卧菊三七茎提取物（Ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｆｒｏｍ　Ｇ．ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ　ｓｔｅｍ，ＥＥＧＳ）的制备　取干燥
茎称重后粉碎，每次加入１０倍体积／重量的８０％乙
醇，８５℃回流提取１　ｈ，提取３次，合并提取液并浓
缩干燥，得干浸膏（密度１．４０　ｇ·Ｌ－１），得率约为
１８．５％。经高效液相色谱鉴定发现平卧菊三七茎
提取物（ＥＥＧＳ）中含有新绿原酸０．０１％，绿原酸
０．２７％，异 绿 原 酸 Ａ　０．２８％，异 绿 原 酸 Ｂ
０．０５１％，异绿原酸Ｃ０．１２％［８］。
２　方法
２．１　分组及给药　４０只雄性昆明小鼠，采用随机
数字表法分为５组：空白对照组 （ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ）、
给药对照组（ＥＥＧＳ　ｇｒｏｕｐ）、ＤＥＮ 模型组（ＤＥＮ
ｇｒｏｕｐ）、ＥＥＧＳ治疗组［ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（５０　ｍｇ·ｋｇ－１）
ｇｒｏｕｐ］和［ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（２００　ｍｇ·ｋｇ－１）ｇｒｏｕｐ］，每
组８只。ＤＥＮ模型组、２组ＥＥＧＳ治疗组分别经口
给予１６５　ｍｇ·ｋｇ－１　ＤＥＮ，其余２组给予等量生理盐
水，每周１次，共８周；模型成功后，给药对照组（２００
ｍｇ·ｋｇ－１）、ＥＥＧＳ治疗组（５０　ｍｇ·ｋｇ－１）及ＥＥＧＳ治
疗组（２００　ｍｇ·ｋｇ－１）灌胃ＥＥＧＳ，其余２组给予等量
生理盐水，每天１次，连续７　ｄ。最后一次给药结束
４　ｈ后，摘取眼球取血，小鼠处死后取肝脏。肝脏分
为两份，一份经体积分数为４％甲醛溶液固定，一份
－８０℃保存备用。
２．２　生化指标检测　血样静置离心制得血清，按照
谷丙转氨酶（Ａｌａｎｉｎｅ　ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＡＬＴ）及谷草转
氨酶（Ａｓｐａｒｔａｔｅ　ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＡＳＴ）检测试剂盒测
定谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性［９］。
２．３　组织病理学观察　上述肝脏组织固定后，包埋
切片，脱水脱蜡后经苏木精－伊红染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙ－
·３１６·中国医院药学杂志２０１６年４月第３６卷第８期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｐｒ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．８
ｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）后检测病理组织形态学变化，切片运
用ＴＵＮＥＬ细胞凋亡检测试剂盒完成 ＴＵＮＥＬ染
色以观察细胞凋亡，其中，细胞呈棕褐色的为阳性表
达及凋亡细胞；再运用 ＰＡＳ染色液试剂盒完成
ＰＡＳ染色以观察肝糖原情况，其中，细胞质中呈紫
红色的颗粒即为散在的糖原，出现在细胞核内较为
透亮的即为核糖原。
２．４　ＲＴ－ＰＣＲ检测肝组织中ＴＮＦ－α、ＡＰ－２、ＰＰＡＲ－
γ、ＩＬ－６、ＨＧＦ　ｍＲＮＡ的表达　取－８０℃保存的肝
组织１００　ｍｇ，研磨至粉末加入１　ｍＬ　ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ，
提取小鼠肝组织总ＲＮＡ。总ＲＮＡ定量提纯后，严
格按照Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ）说明书操作，检测内参 ＧＡＰＤＨ 和 ＴＮＦ－α、
ＡＰ－２、ＰＰＡＲ－γ、ＩＬ－６、ＨＧＦ等ｍＲＮＡ的表达水平。
２．５　统计学方法　采用ＳＰＳＳ１９．０进行统计分析，
以空白对照组的均值为标准，其余各组值与之相比，
所得比值作为统计值珚ｘ±ｓ，组间数据采用ｏｎｅ－ｗａｙ
ＡＮＯＶＡ并进行Ｔｕｋｅｙ检验。
３　结果
３．１　ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠肝功能的影响　如表
２所示，与空白对照小鼠血清中 ＡＬＴ活性相比，
ＤＥＮ模型组小鼠血清中ＡＬＴ活性显著提高，有统
计学意义（Ｐ＜０．０１）；ＥＥＧＳ治疗组的ＡＬＴ活性均
降低，与 ＤＥＮ 模型组相比，其中 ２００　ｍｇ·ｋｇ－１
ＥＥＧＳ治疗组显著性下降，有统计学意义（Ｐ＜
０．０１）。
表２　ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠肝功能的影响（珚ｘ±ｓ，ｎ＝８）
Ｔａｂ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＥＥＧＳ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＤＥＮ－ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｍｉｃｅ（珚ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别 ＡＬＴ／Ｕ·Ｌ－１　 ＡＳＴ／Ｕ·Ｌ－１
空白对照组 ３０．９±７．５　 ７２．６±１６．８
ＥＥＧＳ组 ２４．１±９．８　 ７０．３±８．３
ＤＥＮ模型组 ７４．１±８．９ｂ　 １２９．８±３８．４
ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（５０　ｍｇ·ｋｇ－１） ６５．８±４．３　 １００．５±４．７
ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（２００　ｍｇ·ｋｇ－１） ４１．７±６．６ｂ　 １００．４±９．９
注：与空白对照组比较，ｂ　Ｐ＜０．０１；与模型组比较，ｂ　Ｐ＜０．０１
３．２　ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠肝脏炎症、脂肪化及
增殖相关基因表达的影响　图１所示分别为肝脏
ＴＮＦ－α、ＡＰ－２、ＰＰＡＲ－γ、ＩＬ－６和 ＨＧＦ的 ｍＲＮＡ水
平变化。与相应空白对照组相比，ＤＥＮ 模型组
ＴＮＦ－α、ＡＰ－２、ＰＰＡＲ－γ和平均上调，其中 ＴＮＦ－α、
ＡＰ－２、ＨＧＦ的 ｍＲＮＡ水平显著性上调，有统计学
意义（Ｐ＜０．０１）；与ＤＥＮ模型组相比，ＥＥＧＳ治疗
组的ＴＮＦ－α、ＡＰ－２　ｍＲＮＡ表达均降低，无统计学意
义。
３．３　ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠肝组织病理学的影响
如图２所示，与空白对照相比，ＤＥＮ模型组的肝脏
注：与空白对照组比较，ａＰ＜０．０５，ｂ　Ｐ＜０．０１
Ｎｏｔｅ：ａＰ＜０．０５，ｂ　Ｐ＜０．０１，ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
图１　ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠肝脏炎症、脂肪化及增殖相关基因表
达的影响（珚ｘ±ｓ，ｎ＝８）
Ｆｉｇ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＥＥＧＳ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｉｎｆｌａｍｍａ－
ｔｉｏｎ，ｓｔｅａｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＤＥＮ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｍｉｃｅ（珚ｘ
±ｓ，ｎ＝８）
组织可见大量的细胞坏死和脂肪空泡，肝实质细胞
数量也有所减少；而与ＤＥＮ模型组相比，ＥＥＧＳ治
疗组肝脏组织的实质细胞减少、细胞坏死和脂肪空
泡程度均明显减。
３．４　ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠细胞凋亡的影响　图
３为肝脏组织的ＴＵＮＥＬ染色结果，其中，图３Ｆ为
阳性细胞表达率，包括凋亡细胞及吞噬了凋亡细胞
的巨噬细胞。与空白对照相比，ＤＥＮ模型组肝脏出
现大量凋亡细胞，且可见散在的吞噬了凋亡细胞的
巨噬细胞，阳性细胞表达率显著升高；而与ＤＥＮ模
型组相比，ＥＥＧＳ治疗组的凋亡细胞数量均减少，且
吞噬了凋亡细胞的巨噬细胞也相应减少，其中２００
ｍｇ·ｋｇ－１　ＥＥＧＳ治疗组的减少较多，阳性细胞表达
率为１．１％，相对于 ＤＥＮ模型组（表达率为６．３％）
明显降低。
Ａ．空白对照组；Ｂ．ＥＥＧＳ组；Ｃ．ＤＥＮ模型组；Ｄ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（５０
ｍｇ·ｋｇ－１）组；Ｅ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（２００　ｍｇ·ｋｇ－１）组
Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．ＥＥＧＳ　ｇｒｏｕｐ；Ｃ．ＤＥＮ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｄ．ＤＥＮ＋
ＥＥＧＳ（５０　ｍｇ·ｋｇ－１）ｇｒｏｕｐ；Ｅ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（２００　ｍｇ·ｋｇ－１）
ｇｒｏｕｐ
图２　通过 ＨＥ染色检测ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠肝组织病理学的
影响（×２００，标尺５０μｍ）
Ｆｉｇ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＥＥＧＳ　ｏｎ　ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ
ｉｎ　ＤＥＮ－ｔｒｅａｔｅｄ　ｍｉｃｅ　ｗｉｔｈ　ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ（×２００，ｓｃａｌｅ　ｂａｒｓ＝５０μｍ）
３．５　ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠糖原分布的影响　如
图４所示，与空白对照相比，ＤＥＮ模型组肝糖原清
晰可见，且大量聚集，可见散在的核糖原；而与ＤＥＮ
·４１６· 中国医院药学杂志２０１６年４月第３６卷第８期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｐｒ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．８
Ａ．空白对照组；Ｂ．ＥＥＧＳ组；Ｃ．ＤＥＮ模型组；Ｄ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（５０
ｍｇ·ｋｇ－１）组；Ｅ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（２００　ｍｇ·ｋｇ－１）组；Ｆ．阳性细胞表达
率；▲．阳性细胞；↙．吞噬了凋亡细胞的巨噬细胞
Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．ＥＥＧＳ　ｇｒｏｕｐ；Ｃ．ＤＥＮ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｄ．ＤＥＮ＋
ＥＥＧＳ（５０　ｍｇ·ｋｇ－１）ｇｒｏｕｐ；Ｅ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ （２００　ｍｇ·ｋｇ－１）
ｇｒｏｕｐ；Ｆ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｓ；▲．ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌ；↙．ａｐｏｐｔｏｔｉｃ
ｃｅｌ　ｓｗａｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
图３　通过ＴＵＮＥＬ染色检测ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠细胞凋亡的
影响（×４００，标尺５０μｍ）
Ｆｉｇ　３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＥＥＧＳ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ＤＥＮ－ｔｒｅａｔｅｄ
ｍｉｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ＴＵＮＥＬ　ｓｔａｉｎｉｎｇ（×４００，ｓｃａｌｅ　ｂａｒｓ＝５０μｍ）
模型组相比，ＥＥＧＳ治疗组的肝糖原聚集情况均得
到较大改善，其中２００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＥＥＧＳ治疗组肝糖
原减少较多。再者，肝细胞核糖原化是静态性非酒
精性脂肪性肝炎的组织学特点，图片可见ＥＥＧＳ治
疗组的核糖原数量也相应减少。
Ａ．空白对照组；Ｂ．ＥＥＧＳ组；Ｃ．ＤＥＮ模型组；Ｄ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（５０
ｍｇ·ｋｇ－１）组；Ｅ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ（２００　ｍｇ·ｋｇ－１）组；←．核糖原
Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．ＥＥＧＳ　ｇｒｏｕｐ；Ｃ．ＤＥＮ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｄ．ＤＥＮ＋
ＥＥＧＳ（５０　ｍｇ·ｋｇ－１）ｇｒｏｕｐ；Ｅ．ＤＥＮ＋ＥＥＧＳ （２００　ｍｇ·ｋｇ－１）
ｇｒｏｕｐ；←．ｎｕｃｌｅａｒ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ
图４　通过ＰＡＳ染色检测ＥＥＧＳ对ＤＥＮ模型小鼠糖原分布的影响
（×２００，标尺５０μｍ）
Ｆｉｇ　４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＥＥＧＳ　ｏｎ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ
ＤＥＮ－ｔｒｅａｔｅｄ　ｍｉｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ＰＡＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ（×２００，ｓｃａｌｅ　ｂａｒｓ＝５０μｍ）
４　讨论
在东南亚等地，傣药平卧菊三七被广泛用于治
疗癌症、糖尿病和高血压等疾病［１０］，其传统用药部
位和食用部位为叶，茎则习惯性被扔弃。为了探讨
茎是否也具备药用价值，将制备的平卧菊三七茎的
醇提浸膏用于治疗ＤＥＮ引起的小鼠肝脏损伤。经
研究发现，ＥＥＧＳ具有较好的治疗作用。由于ＤＥＮ
常用于诱导肝癌模型，ＥＥＧＳ对抗ＤＥＮ肝损提示了
其用于治疗癌症的可行性。与平卧菊三七叶提取物
在细胞水平抗癌细胞株增殖作用一致［１１－１２］。
研究结果显示，高剂量组的ＥＥＧＳ对正常小鼠
肝脏功能无影响。建立ＤＥＮ诱导的化学性肝脏损
伤模型，并给予ＥＥＧＳ治疗，采集样本后检测实验
动物肝功能及其肝脏组织病理学，确定ＥＥＧＳ的护
肝作用。结果显示，高剂量ＥＥＧＳ治疗组的 ＡＬＴ
活性较ＤＥＮ模型组，从（７４．１±８．９）Ｕ·Ｌ－１降低到
（４１．７±６．６）Ｕ·Ｌ－１具有显著性差异，提示ＥＥＧＳ
可以在一定程度上恢复肝功能，减少ＤＥＮ对肝细
胞的损伤；肝脏病理组织形态学检测结果也证实了
这一点，ＥＥＧＳ治疗组的肝脏实质细胞减少、细胞坏
死和脂肪空泡程度均较模型组有明显好转，对抗了
ＤＥＮ的肝细胞毒性。而且，ＤＥＮ可能通过抑制糖
原合酶激酶－３β（ＧＳＫ－３β）的活性，糖原合酶活性增
加，促进肝细胞糖原合成含量增加［１３］，糖代谢异常
导致了脂肪代谢异常，促进外周脂肪分解游离脂肪
酸含量增加，肝组织脂肪变性累积。而ＥＥＧＳ可能
通过抑制这一过程，降低ＤＥＮ对肝细胞的损伤。
ＴＮＦ－α生物学功能非常复杂，可通过与其受体
结合，实现其炎症、脂肪化、凋亡等方面的相关功
能［１４］。研究发现，ＥＥＧＳ护肝作用与ＴＮＦ－α密切相
关，我们并检测了相关基因，包括与炎症相关的
ＴＮＦ－α和ＩＬ－６，与脂肪化相关的ＡＰ－２和ＰＰＡＲ－γ，
以及与增殖相关的 ＨＧＦ等 ｍＲＮＡ表达。结果显
示，相对于ＤＥＮ模型组，ＥＥＧＳ能有效降低ＴＮＦ－α
和ＡＰ－２　ｍＲＮＡ水平。文献［１５］报道，ＡＰ－２参与调
节ＴＮＦ－α诱导的炎症反应，结合ＴＮＦ－α、ＡＰ－２的下
调及 ＨＥ染色中炎性细胞的减少，表明ＥＥＧＳ能有
效抑制ＴＮＦ－α诱导的炎症反应；且ＡＰ－２是脂类储
存及调节脂类代谢的靶基因［１６］，综合 ＨＥ 染色、
ＰＡＳ染色中脂肪变性程度的改善，推测ＥＥＧＳ通过
下调ＴＮＦ－α、ＡＰ－２诱导的炎症反应改善脂肪化；再
者，ＴＮＦ－α通过介导多种途径诱导凋亡［１６］，其中包
含ＡＳＫ１－ＪＮＫ信号通路。文献报道，伴有脂肪蓄积
的肝脏细胞对其十分敏感，且在肝脏中，单核细胞或
Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞吞噬的凋亡细胞也与ＴＮＦ－α的上调有
关［１７］。结合ＴＵＮＥＬ染色结果，ＥＥＧＳ治疗组的凋
亡细胞数量较模型组减少，显示 ＥＥＧＳ通过下调
ＴＮＦ－α诱导的炎症反应，抑制凋亡。
综上所述，平卧菊三七茎醇提浸膏ＥＥＧＳ通过
下调肝脏ＴＮＦ－α水平，抑制炎症、细胞凋亡，同时改
善肝脏脂肪化，具有保护ＤＥＮ诱导的小鼠化学性
肝损伤的作用。
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Ｄｉｓ　Ｓｃｉ，２０１１，５８（１０）：２８９５－２９０２．
［收稿日期］２０１５－０９－２８
［基金项目］安徽医科大学第二附属医院博士科研启动基金（编号：２０１２ＢＫＪ０２２）　［作者简介］胡伟，男，博士，副教授，副主任药师，硕士生导
师，研究方向：临床药学，电话：０５５１－６３８６６０５０，Ｅ－ｍａｉｌ：ａｙ２ｆｙｈｕｗｅｉ＠ｑｑ．ｃｏｍ
液－质联用法测定人体血浆中万古霉素的浓度
胡伟，陈璐璐，孙成，朱熙，郭成，刘丽萍　 （安徽医科大学第二附属医院药学部，安徽 合肥２３０６０１）
［摘要］　目的：运用液－质联用技术（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ），建立测定人体血浆中万古霉素浓度的方法，监测万古霉素血药浓度。方法：
以替洛福韦为内标，乙腈沉淀蛋白后，经ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法分析。采用色谱柱为安捷伦 Ｐｏｒｏｓｈｅｌ　１２０　ＥＣ－Ｃ１８柱（４．６　ｍｍ×１００
ｍｍ，２．７μｍ），流动相为混合有机相（乙腈∶甲醇－２∶１）－０．１％甲酸水溶液（１０∶９０）；流速０．４　ｍＬ·ｍｉｎ
－１；采用质谱电喷雾电离源
（ＥＳＩ），正离子模式，多重反应监测方式（ＭＲＭ）检测；待测物质万古霉素用于定量的母子离子对：ｍ／ｚ　７２５．６→ｍ／ｚ　１４４．２，内
标替洛福韦用于定量的母子离子对：ｍ／ｚ２８８．０→ｍ／ｚ１７６．２。结果：万古霉素在０．２～１００μｇ·ｍＬ
－１范围内线性关系良好，最
低定量限为０．２μｇ·ｍＬ
－１；日内ＲＳＤ均在６％以下，日间ＲＳＤ均在１２％以下。提取回收率为５８．０１％～６６．５８％。结论：该分
析方法快速、准确、灵敏度高、专属性强、重复性好，可用于医疗机构检测人体血浆中万古霉素的药物浓度。
［关键词］　万古霉素；液－质联用法；血药浓度
［中图分类号］Ｒ９２７　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１６）０８－０６１６－０５　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１６．０８．０４
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａ　ｂｙ　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
ＨＵ　Ｗｅｉ，ＣＨＥＮ　Ｌｕ－ｌｕ，ＳＵＮ　Ｃｈｅｎｇ，ＺＨＵ　Ｘｉ，ＧＵＯ　Ｃｈｅｎｇ，ＬＩＵ　Ｌｉ－ｐｉｎｇ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｅｃｏｎｄ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｎｈｕｉ　Ｈｅｆｅｉ　２３０６０１，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａｎ　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ．
ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｐｌａｓｍａ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ　ｂｙ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ．Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ．Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｐｏ－
ｒｏｓｈｅｌ　１２０　ＥＣ－Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ（４．６　ｍｍ×１００　ｍｍ，２．７μｍ）ｗａｓ　ａｄｏｐｔｅｄ，ｍｉｘｅｄ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｐｈａｓｅ（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ∶ｍｅｔｈａｎｏｌ－２∶１）－０．１％
ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０∶９０）ｗａｓ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ，ａｔ　ａ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｏｆ　０．４　ｍＬ·ｍｉｎ－１．Ａｎａｌｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｐｏｓ－
·６１６· 中国医院药学杂志２０１６年４月第３６卷第８期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｐｒ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．８