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火绒草抗氧化活性成分及其结构分析



全 文 :天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2013,25:296-301
文章编号:1001-6880(2013)3-0296-06
收稿日期:2012-11-09 接受日期:2013-01-22
基金项目:自治区高校科研计划项目(XJUEDU2010I13)
* 通讯作者 Tel:86-013999273566;E-mail:gou ping@ sina. com
火绒草抗氧化活性成分及其结构分析
吴楠贞,展 锐,苟 萍*
新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046
摘 要:通过测定火绒草(Leontopodium leontopodioides)醇提物不同部位的总还原力,羟自由基(·OH)和亚硝酸
盐清除活性,表明乙酸乙酯部位能有效浓缩抗氧化的活性物质,具有较强的还原力,以及清除羟基自由基和亚
硝酸盐的活性。进一步以火绒草抗氧化活性成分为导向,对醇提物的乙酸乙酯部位进行了硅胶柱层析和制备
薄层层析,得到了丰度较高的一个单体化合物,经紫外、红外、氢谱和碳谱分析,推测该化合物的结构为对羟基
苯乙酮。
关键词:火绒草;抗氧化活性;成分结构;对羟基苯乙酮
中图分类号:Q946. 82 文献标识码:A
Anti-oxidation Active Components and Structure Analysis
from Leontopodium leontopodioides
WU Nan-zhen,ZHAN Rui,GOU Ping*
College of Biological Science and Technology,Xinjiang University,Wulumuqi 830046,China
Abstract:The anti-oxidation activities of different parts of edelweiss(Leontopodium leontopodioides)alcohol extracts were
evaluated by determination of total reducing power,superoxide anion,scavenging hydroxyl radical(·OH)and nitrite ac-
tivities. The results showed that ethyl acetate parts can effectively concentrate anti-oxidation activity substances,which
had strong reducing power,scavenging hydroxyl free radicals and nitrite activity. Further,in order to track the edelweiss
anti-oxidation activity components,we obtained a abundance higher monomer compound by silica gel column chromatog-
raphy and preparative thin layer chromatography in ethyl acetate parts of the alcohol extract. The compound structure was
presumed para-hydroxyl-acetophenone through analysis of ultraviolet,infrared,hydrogen and carbon spectrum.
Key words:Leontopodium leontopodioides;anti-oxidation activity;compound structure;para-hydroxyl-acetophenone
火绒草(Leontopodium leontopodioides (Willd)
Beauv)系菊科火绒草属植物,主要分布于亚洲、欧洲
和南美洲,约有 56 种,其中 25 种火绒草在民间作为
药用植物。火绒草可用来治疗急(慢)性肾炎、尿道
炎、蛋白尿、血尿等多种肾脏疾病,以及风热感冒、创
伤出血等疾病[1]。火绒草属植物中含有多种化学
成分,如倍半萜类、黄酮类、苯丙素类和甾体类等化
合物[2-5]。Alexander I. Gray[6]等从高山火绒草中分
离出六种倍半萜类化合物。Ji Xin Li[7]从长叶火绒
草(Leontopodium longifolium)根部分离出两种新的
倍半萜类化合物,涂永勤等从华火绒草中分离出 3
种黄酮类化合物,3,5-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮
(6,7-Dimethoxy-3,5-dihydroxy flavono1)、3,5,7-三羟
基-8-甲 氧 基 黄 酮 (8-methoxy-3,5,7-hydmxy
flavono1)和槲皮素(quercetin)[8]。另外,还分离鉴
定出了 3 种甾体类化合物,谷甾醇(sitosterol)[9,10]、
菜 油 甾 醇(campesterol)和豆甾醇 (stigmaster-
ol)[11]。
抗氧化与人类的健康有密切的关系,当人体抗
氧化途径出现障碍或产生过多自由基时,就会导致
细胞损伤,引起心脏病、癌症、衰老等多种疾病。食
物中的亚硝酸盐是形成亚硝胺的前体物质,而亚硝
胺是很强的致癌物质,因此,消除亚硝酸盐类是防治
癌症产生的有效途径之一[l2]。天然抗氧化剂具有
安全、可靠、环保和毒副作用小的优点,日益受到人
们的极大关注。中草药中的一些天然的化合物具有
抗氧化活性,对保持机体健康和防止疾病的发生是
十分有益的。天然植物中多酚类化合物如黄酮、原
花青素、香豆素、有机酸等不仅具有抗氧作用,而且
能清除亚硝酸根的作用[13,14]。Su 等[15]对 195 种天
然植物中草药进行了抗氧化性能研究,发现其中近
半数具有抗氧化作用,且 22 种天然植物乙醇提取物
的抗氧化能力强于等重量的生育酚。国内外对火绒
草提取物的抑菌,抗炎,镇痛,降血糖等作用都有一
定研究,但对其抗氧化作用和清除亚硝酸盐类的作
用鲜有报道。本文以火绒草的醇提物抗氧化活性为
导向,筛选出抗氧化活性的有效成分,并对其进行结
构鉴定,为开发利用火绒草中天然抗氧化成分提供
理论依据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
火绒草于 7 月初采于新疆乌鲁木齐市南山(海
拔 1800 m) ,经本院植物教研室索菲娅副教授鉴定
为(Leontopodium leontopodioides (Willd) ,Beauv) ,保
存于新疆大学生命科学与技术学院本实验室标本
室,清洗泥土阴干,粉碎后备用。
1. 2 试剂
NaNO2、AlCl3、NaOH、FeSO4、K3Fe(CN)6、水杨
酸、邻苯三酚、柠檬酸、HC1、Na2HPO4、Na2CO3、对氨
基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、α-萘胺、石油醚、氯仿、乙
酸乙酯、正丁醇、无水乙醇等均为分析纯;二甲胺;没
食子酸(生化试剂)、芦丁(生化试剂)均为分析纯。
1. 3 仪器
SZ2 型双配套循环水式多用真空泵上(海一
科仪器有限公司) ,电子天平(日本 Shimadzu 公
司) ,752 型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有
限公司) ,减压蒸馏装置(沈阳得维斯控制系统有限
公司) ,真空干燥器(上海恒科 DZF-6050) ,超速离
心机(北京华威中仪科技有限公司) ,超声波清洗仪
(济南巴克超声波科技有限公司) ,红外线光谱仪
(天津市拓普仪器有限公司) ,HT-PNMR12-9 90
MHz核磁共振谱仪(上海寰彤科教设备有限公司)。
1. 4 实验方法
1. 4. 1 火绒草的提取分离
火绒草 4. 6 公斤→95%乙醇冷浸(7d∶ 7d∶ 7d)
→热提取 2 h→回收溶剂得浸膏约 198 g。浸膏用温
水溶解,不溶物用 50%乙醇溶解,水相及 50%乙醇
相分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取至无
色。回收溶剂得各部位浸膏,并将各部位分别配制
成 10 mg /mL的供试液,进行抗氧化实验。
1. 4. 2 总还原力的测定
采用 Dobner 等的方法[16,17],取 2. 5 mL 供试液
于试管中,依次加入 2. 5 mL 0. 2 mo1 /L PBS 缓冲溶
液(Phosphate buffer saline,PBS,pH 6. 6)5 mL 1%
铁氰化钾溶液(K3Fe(CN)6) ,于 50 ℃中保温 20 min
后快速冷却,再加入 2. 5 mL 10% 醋酸溶液,以 3
000 rpm的转速离心 10 min,取上清液 2. 5 mL,依次
加入 2. 5 mL 蒸馏水,0. 5 mL 0. 1% 三氯化铁
(FeCl3) ,充分混匀,静置 10 min 后,在 700 nm 测吸
光度值 A,吸光度值越高还原力越强。以 Vc做阳性
对照。
1. 4. 3 羟自由基( ·OH) 清除活性的测定
采用 Fenton 法[18-20],H2O2 和 Fe
2 + 混合发生
Fenton反应,生成具有很高反应活性的·OH,·OH
能被水杨酸有效的捕获,并生成有色物质,但若加入
具有清除作用的物质,便会与水杨酸竞争,有色产物
的生成量减少。向试管中加入不同浓度的火绒草提
取物 2 mL,依次加 6 mmol /L 的 FeSO4 溶液 2 mL,
2. 4 mmol /L的 H2O2 溶液 2 mL,摇匀,静置 10 min,
再加入 6 mmol /L的水杨酸溶液 2 mL 摇匀,然后 37
℃水浴 30 min,离心(3 000 rpm,10 min) ,取上清液
于 500 nm测吸光值,以 Vc做阳性对照。
清除率 s% =[1-( Ai-Aj ) /A0]× 100%
其中 A0 为空白对照;Ai 为反应液的吸光度值;
Aj 为不加水杨酸时提取液自身的吸光度值。
1. 4. 4 清除亚硝酸盐自由基的测定
采用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐清除率[21],
pH 3. 0 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 2 mL,加入样
液 2 mL,5 μg /mL的亚硝酸钠标液 1 mL 于 50 mL
容量瓶中,在 37 ℃水浴 1 h,取出,立即加入 0. 4%
对氨基苯磺酸 2 mL,混匀,静置 3 ~ 5 min,分别加
1. 0 mL 0. 2% 盐酸萘乙二胺溶液,加水至刻度混
匀,静置 15 min,在 538 nm下测定吸光度,平行做三
个重复求平均值,同时做空白对照实验。
清除率 /% = [( A0-A) /A0]× 100%
A0:未加提取液时 NaNO2 的吸光度值(以试剂
空白溶液为参比溶液) ;A:加入提取液后 NaNO2 的
吸光度值(以火绒草提取液为参比溶液)。
1. 4. 5 火绒草抗氧化成分的分离纯化及结构分析
将醇提物乙酸乙酯部位浸膏 3 g 上硅胶柱,石
油醚∶丙酮(9∶ 1 ~ 1 ∶ 2)梯度洗脱,每 20 mL 收集一
管,得馏分 Fr1 ~ Fr20,经薄层层析检测合并 Rf 相同
的组分,通过制备薄层色谱进行分离,展开剂为环己
烷∶丙酮∶乙酸(60∶ 30∶ 1. 5) ,用小刀将条带刮下,乙
醇溶解,放置,过滤,浓缩,得到单体化合物,该化合
792Vol. 25 吴楠贞等:火绒草抗氧化活性成分及其结构分析
物喷 10% 硫酸乙醇呈显红棕色。
2 结果与分析
2. 1 火绒草的提取分离
干燥火绒草全草 4. 6 kg,粉碎,95% 食用乙醇
冷浸提取三次,每次 7 d,热提取 2 h,合并提取液,浓
缩,蒸干,得到浸膏。浸膏温水混悬,分别用石油醚,
氯仿,乙酸乙酯,正丁醇萃取至无色,得到各部位浸
膏进行抗氧化活性测定(图 1)。
图 1 火绒草的提取分离流程
Fig. 1 The separation process of Leontopodium leontopodioides
2. 2 总还原力测定
火绒草醇提浸膏用不同的有机溶剂萃取测定总
还原力,结果表明,乙酸乙酯部位的还原力最强,其
它部位总还原力的强弱依次为正丁醇部位、水相和
氯仿部位,并都呈现出量效关系,而石油醚部位无还
原力(图 2,图 3)。火绒草醇提物用乙酸乙酯、正丁
醇和氯仿萃取后,在总还原力的吸光度为 0. 5 时,萃
图 2 Vc总还原力
Fig. 2 Reducing power of Vc
取各部位的提取物浓度物均比醇提物低,说明萃取
的各部位能有效浓缩还原性物质,其浓缩效果为乙
酸乙酯 >正丁醇 >氯仿(表 1)。醇提液乙酸乙酯萃
取后的总还原力比醇提物提高了近 30 倍。
图 3 火绒草醇提物各部位总还原力
Fig. 3 Various parts total reducing power of Leontopodium
leontopodioides ethanol-extractions
892 天然产物研究与开发 Vol. 25
表 1 火绒草醇提物各部位总还原力比较
Table 1 The comparison of various parts total reducing power of Leontopodium leontopodioides ethanol-extractions
醇提物
Ethabol
醇提物氯仿部位
Chloroform
醇提物乙酸乙酯部位
Ethyl aetate
醇提物正丁醇部位
Butanol
吸光度 Absorbance 0. 5 0. 5 0. 5 0. 5
浓度 Concentration (mg /mL) 4. 42 2. 22 0. 15 0. 32
2. 3 清除羟基自由基活性
火绒草醇提浸膏用不同的有机溶剂萃取后测定
清除羟基自由基活性。通过比较它们的 IC50可知,
清除自由基活性顺序为:乙酸乙酯部位 >正丁醇部
位 >氯仿 >水相(表 1)。乙酸乙酯部位清除羟基自
由基活性的 IC50比醇提物降低了 31%,说明该部位
浓缩了清除羟基自由基的活性物质。乙酸乙酯部位
图 4 Vc清除羟基自由基活性
Fig. 4 Hydroxyl radical(·OH)-scavenging activity of Vc
随着提取物浓度的增加,清除羟基自由基活性增加,
当浓度达到 10 mg /mL 清除羟基自由基活性达到
90%(图 4,图 5)。
图 5 火绒草各提取部位清除羟基自由基活性
Fig. 5 Hydroxyl radical(·OH)-scavenging activity of Le-
ontopodium leontopodioides various extract parts
表 2 火绒草各提取部位清除羟基自由基 IC50
Table 2 Hydroxyl radical(·OH)-scavenging IC50 of Leontopodium leontopodioides various extract parts
醇提物
Ethabol
醇提物氯仿部位
Chloroform
醇提物乙酸乙酯部位
Ethyl aetate
醇提物正丁醇部位
Butanol
水相
Water phase
Vc
Vc
IC50(mg /mL) 2. 5 7. 82 1. 72 2. 8 5. 06 0. 278
2. 4 清除亚硝酸盐活性
火绒草醇提浸膏用不同的有机溶剂萃取后测定
亚硝酸盐清除活性,除了石油醚部位外,其它部位均
有较高的亚硝酸盐清除率。氯仿部位、乙酸乙酯部
位和水相具有量效关系。乙酸乙酯部位提取物浓度
为 10 mg /mL 清除亚硝酸盐活性最大,达到 74%。
乙酸乙酯部位清除亚硝酸盐活性的 IC50约为 Vc的 1 /4
(图 6,图 7,表 3)。通过比较 IC50可知,亚硝酸盐清除
活性是:乙酸乙酯部位 >正丁醇部位 >氯仿 >水相。
图 6 Vc清除亚硝酸盐活性
Fig. 6 The sodium nitrite scavenging activity of Vc
图 7 火绒草各提取部位清除亚硝酸盐活性
Fig. 7 Sodium nitrite scavenging activity of Leontopodium
leontopodioides various extract parts
2. 5 抗氧化成份的分离纯化及结构鉴定
通过上述火绒草不同部位提取物抗氧化活性的
测定,明确了醇提物的乙酸乙酯部位具有较强抗氧
化性,进一步对该部位进行硅胶柱层析和制备薄层,
得到一个丰度较高的浅黄色单体化合物(图 8)。
992Vol. 25 吴楠贞等:火绒草抗氧化活性成分及其结构分析
表 3 火绒草各提取部位清除亚硝酸盐 IC50
Table 3 Sodium nitrite scavenging IC50 of Leontopodium leontopodioides various extract parts
醇提物氯仿部位
Chloroform
醇提物乙酸乙酯部位
Ethyl aetate
醇提物正丁醇部位
Butanol
水相
Water phase
Vc
Vc
IC50(mg /mL) 6. 1 2. 14 4. 08 5. 63 0. 46
图 8 单体化合物的 TLC检测
Fig. 8 TLC detection of monomer compound
该化合物 UVλmax(MeOH)218 nm 吸收峰表明
有共轭双键存在,276 nm吸收峰提示苯环上有发色
基团取代并与苯环共轭。IR:3 419 cm-1的宽峰为羟
基峰,1 718 cm-1的峰为羰基的吸收峰,1 580,1 514
cm-1为苯环的骨架振动,1 170,1 114,1 076 cm-1为
-C-O-C-吸收峰。1HNMR:δ 2. 51(s,3H)处的氢信号
提示结构式中存在单峰甲基,芳香区的一组双峰氢
信号[δ 7. 87(2H,d,J = 8. 8 Hz)和 δ 6. 84(2H,d,J
= 8. 8 Hz) ]提示结构式中含有一个对位二取代的
苯环结构片段。13CNMR:δ 199. 5 处的碳信号提示结
构中存在羰基,δ 164. 0,132. 1,130. 0,116. 2 处碳信
号进一步提示结构式中存在一个对位二取代的苯环
结构片段,且 δ 164. 0 的碳原子与氧原子相连。通
过紫外、红外、氢谱和碳谱(1H NMR δ:2. 51 (3H,s,
H-8) ,6. 84 (2H,d,J = 8. 2 Hz,H-3,5) ,7. 87 (2H,
d,J = 8. 8 Hz,H-2,6) ;13 C NMR δ:23. 8 (q,C-8) ,
116. 0 (d,C-3,5) ,130. 3 (s,C-1) ,132. 1 (d,C-2,
6) ,164. 0 (s,C-4) ,199. 5 (s,C-7) ) ,推测该化合物
的结构为对-羟基苯乙酮,其氢谱、碳谱数据与 Mi-
chael Vogl[22]报道一致。
图 9 对羟基苯乙酮的结构
Fig. 9 The structure of para-hydroxyl-acetophenone
3 讨论
近年来报道的抗氧化的天然活性物质主要有:
黄酮、苯酚类、皂苷类、鞣质类、生物碱、香豆素等。
天然植物中的酚类、黄酮类物质具有清除机体内自
由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老、预防心血管系统
疾病、防癌、抗辐射等生物活性。火绒草醇提物中含
有黄酮,酚类,生物碱,有机酸,香豆素、强心甙等物
质,其中酚类物质主要以黄酮类化合物为主[23]。本
研究证实了火绒草醇提物用不同有机溶剂萃取,乙
酸乙酯部位具有较强的还原力,以及清除羟基自由
基和亚硝酸盐的活性,并且乙酸乙酯部位能有效浓
缩抗氧化的活性物质。通常醇提物的乙酸乙酯部位
含有许多中等极性的化合物,如多酚,黄酮,生物碱,
有机酸等,我们以火绒草抗氧化活性为导向,通过对
醇提物乙酸乙酯部位进行硅胶柱层析和制备薄层得
到了丰度较高的一个单体化合物,推测该化合物的
结构为对羟基苯乙酮。对羟基苯乙酮广泛存在于红
景天属、茵陈、菊科橐吾属等植物中[24-26],但尚未见
在火绒草中存在的报道。对羟基苯乙酮具有利胆、
排胆、保肝、抗病毒、降血脂等多方面的功能[27-29],
对羟基苯乙酮属于一种酚类物质,具有抗氧化的官
能团,我们的实验也证实该化合物具有抗氧化功效,
对羟基苯乙酮的一些药理作用可能是通过抗氧化途
径实现。
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