全 文 ：植物资源与环境学报 2014，23(3):108 － 110
Journal of Plant Ｒesources and Environment
红凤菜新鲜茎叶中总黄酮提取物的 LC － MS分析
任冰如，吕 寒，陈 剑，梁呈元，吴菊兰，李维林①
〔江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园)江苏省药用植物研究开发中心 江苏省抗糖尿病药物筛选技术服务中心，江苏 南京 210014〕
LC-MS analysis of total flavonoids extracts from fresh stem and leaf of Gynura bicolor ＲEN Bingru，LYU Han，
CHEN Jian，LIANG Chengyuan，WU Julan，LI Weilin① (Jiangsu Center for Ｒesearch and Development of Medicinal
Plants，Jiangsu Provincial Service Center for Anti-diabetic Drugs Screening，Institute of Botany，Jiangsu Province and the
Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China)，J． Plant Ｒesour． ＆ Environ． 2014，23(3):108 － 110
Abstract:Four total flavonoids extracts were obtained from fresh stem and leaf of Gynura bicolor DC． by method of ethanol
extraction-macroporous resin column chromatography-polyamide column chromatography-recrystallization， and their
compositions were analyzed by LC-MS technology． The results show that there are six groups of flavonoid absorption peak in
total flavonoids extracts of G． bicolor，which is identified to be eight components including rutin，quercetin-3-O-
rubinobioside， hyperoside， isoquercitrin， kaempferol-3-O-rubinobioside， kaempferol-3-O-rutinoside， kaempferol-3-O-
galactoside and astragalin． This extraction method can effectively extract and purify total flavonoids from fresh stem and leaf
of G． bicolor，so it can be used for factory production．
关键词:红凤菜;LC － MS;总黄酮;槲皮素;山柰酚
Key words:Gynura bicolor DC．;LC-MS;total flavonoids;quercetin;kaempferol
中图分类号:Q946． 83;Ｒ284． 1 文献标志码:A 文章编号:1674 － 7895(2014)03 － 0108 － 03
DOI:10． 3969 / j． issn． 1674 － 7895． 2014． 03． 15
红凤菜(Gynura bicolor DC．)为菊科(Compositae)菊三七属
(Gynura Cass．)植物，别名血皮菜、观音菜、观音苋、紫背天葵
等，主要分布于中国南方各地，全草均可入药［1］;也可作为蔬
菜食用，在国内多个地区均有栽培和销售。目前已知红凤菜
含有黄酮类、酚性酸类、萜类、甾醇类、脂肪酸类、生物碱类及
花青素类等［2 － 7］成分。由于黄酮类成分多具有保护心血管、抗
肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎和抗病毒等作用［8］，因此对红凤
菜中黄酮类成分的研究具有深度开发价值。
作者采用“乙醇提取 －大孔树脂柱层析 －聚酰胺柱层析
－重结晶”方法从红凤菜新鲜茎叶中提取获得不同分离阶段
的黄酮类化合物，并采用 LC － MS技术结合薄层层析对其进行
检测分析，考察提取分离过程中黄酮类化合物的富集和纯化
状况，以期为红凤菜中黄酮类化合物高效提取纯化工艺的建
立提供基础实验数据。
1 材料和方法
1． 1 材料
供试红凤菜取自江苏省·中国科学院植物研究所实验苗
圃，于 2003 年 7 月引自重庆，凭证标本保存于江苏省·中国科
学院植物研究所标本馆 (NAS)，凭证标本号为 0648614。
使用的乙腈(美国 Fisher公司)和甲酸(美国 Tedia 公司)
均为色谱纯级;采用 Milli － Q 纯水仪(美国 Millipore 公司)制
备超纯水。
1． 2 方法
1． 2． 1 对照品溶液制备 参照陈剑［5］的方法从红凤菜中分
离制得黄酮苷类对照品芦丁(rutin)、异槲皮苷(isoquercitrin)
和紫云英苷(astragalin)以及有机酸类对照品异绿原酸 A
(isochlorogenic acid A)和异绿原酸 C(isochlorogenic acid C)，上
述 5 个对照品均通过 NMＲ、MS 和文献比对等进行结构鉴定。
分别取各对照品适量，用甲醇配成质量浓度 0． 1 mg·mL －1的
对照品溶液。
1． 2． 2 总黄酮成分的分离及样品溶液的制备 取红凤菜新鲜
茎叶 5 kg，用 20 L体积分数 95%乙醇室温冷浸提取 7 d，提取
液减压浓缩并冷沉去杂。上清液上 NKA 大孔树脂柱，依次用
2 倍体积的水以及体积分数 30%、50%、70%和 95%乙醇进行
梯度洗脱;以 BAW〔V(正丁醇)∶ V(乙酸)∶ V(水)= 4∶ 1∶ 5〕为
展开剂、质量体积分数 1%AlCl3为显色剂对洗脱液进行聚酰胺
薄层层析;合并具有黄酮反应的洗脱液，减压浓缩至无醇味。
取一部分洗脱液在沸水浴上蒸干，得到样品Ⅰ;另一部分洗脱
收稿日期:2013 － 09 － 29
基金项目:江苏省产学研联合创新资金项目(BY2012213);江苏省科技基础设施建设计划———科技公共服务平台项目(BM2011117)
作者简介:任冰如(1964—)，女，江苏宜兴人，博士，研究员，主要从事植物资源的研究与开发工作。
①通信作者 E-mail:lwlcnbg@ mail． cnbg． net
液进行聚酰胺柱层析，依次用 2 倍体积的水以及体积分数
30%、50%、70%和 95%乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，每流份为
1 /10 柱床体积，减压浓缩后室温放置，至黄酮结晶析出后，过
滤，将滤液合并后进行干燥，得到样品Ⅱ，同时得到不同流份
的结晶即样品Ⅲ和样品Ⅳ。各样品均取 5 mg，分别用体积分
数 80%甲醇溶解并定容至 10 mL，用孔径 0． 22 μm微孔滤膜过
滤，即为供试样品溶液。
1． 2． 3 LC － MS 检测条件 参照文献［5］、使用 Agilent 6530
Accurate － Mass Q － TOF LC － MS 超高效液相 －精确飞行时间
质谱联用仪(美国 Agilent公司)进行 LC － MS分析。
色谱分析条件:AgilentZorbaxSB － C18色谱柱(100mm ×
4． 6 mm，1． 8 μm，美国Agilent公司);流速 0． 5 mL·min －1，柱
温 25 ℃，进样量 5． 0 μL。流动相 A 为乙腈、流动相 B 为体积
分数 0． 1%甲酸溶液，梯度洗脱过程:0 ～ 30 min，5% ～ 40% A;
30 ～ 40 min，40% ～ 100% A;40 ～ 45 min，100% ～ 5% A。紫外
采集数据范围为 200 ～ 400 nm，检测波长 360 nm。
质谱分析条件:ESI负离子模式，喷雾气压力 50 psig，干燥
气流速 10 L·min －1，干燥气温度 350 ℃，毛细管电压 3 500 V;
碎裂电压 175 V;扫描范围(m/z)50 ～ 1 000。
2 结果和分析
2． 1 红凤菜总黄酮提取物的组成成分解析
红凤菜新鲜茎叶总黄酮提取物的 LC － MS 检测结果见表
1，表中的化合物名称根据对照品和样品的 LC － MS图谱、保留
时间(Ｒt)和负离子模式下一级质谱的分子离子峰［M － H］－
并结合文献［4 － 5］中的数据确定。
根据对照品的质谱信息，鉴定出 1 号峰(Ｒt 17． 64 min，
［M － H］－ m/z 609)为芦丁，3 号峰(Ｒt 18． 60 min，［M － H］－
m/z 463)为异槲皮苷，6 号峰(Ｒt 20． 35 min，［M － H］－ m/z
447)为紫云英苷。因作者采用的 LC － MS 检测条件与文献
［5］完全一致，故参照文献［5］确定样品中其余黄酮苷类成分
分别为:3 号峰(Ｒt 18． 67 min，［M － H］－ m/z 593)为山柰酚 －
3 － O － 洋槐苷(kaempferol-3-O-rubinobioside)，4 号峰(Ｒt 19． 31
min，［M －H］－ m/z 593)为山柰酚 －3 － O －芸香苷(kaempferol-3-
O-rutinoside)，5号峰(Ｒt 19． 72 min，［M －H］－ m/z 447)为山柰酚
－3 －O －半乳糖苷(kaempferol-3-O-galactoside )。
表1分析结果显示:红凤菜中的黄酮苷多以槲皮素或山
表 1 红凤菜新鲜茎叶总黄酮提取物的 LC －MS分析结果
Table 1 LC-MS analysis result of total flavonoids extracts from fresh stem and leaf of Gynura bicolor DC．
峰号
No． of
peak
保留时间 /min
Ｒetention time
［M － H］－
m/z
化合物1)
Compound1)
样品吸收峰
Absorption peak of samples
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
1 17． 64 609 芦丁 rutin* √ √ √
609 槲皮素 － 3 － O －洋槐苷 quercetin-3-O-rubinobioside √ √
2 18． 35 463 金丝桃苷 hyperoside √ √ √
3 18． 60 463 异槲皮苷 isoquercitrin* √ √ √
18． 67 593 山柰酚 － 3 － O －洋槐苷 kaempferol-3-O-rubinobioside √ √ √
4 19． 31 593 山柰酚 － 3 － O －芸香苷 kaempferol-3-O-rutinoside √ √ √
5 19． 72 447 山柰酚 － 3 － O －半乳糖苷 kaempferol-3-O-galactoside √ √ √
6 20． 35 447 紫云英苷 astragalin* √ √ √
7 20． 81 515 异绿原酸 A isochlorogenic acid A* √
8 21． 66 591 － √
515 异绿原酸 C isochlorogenic acid C* √
9 21． 89 489 － √
1)* :与对照品一致 Corresponding to reference substance;－:未鉴定 Not identified．
柰酚为苷元，其连接的糖包括六碳醛糖〔如 D － 葡萄糖(D-
glucose)或 D －半乳糖(D-galactose)〕和甲基五碳糖〔如 L －鼠
李糖(L-rhamnose)〕。鉴于样品Ⅰ和样品Ⅱ的 1 号峰呈不对称
肩峰，故推测 1 号峰(Ｒt 17． 64 min，［M －H］－ m/z 609)除含芦丁
外，还含有槲皮素 －3 － O －洋槐苷(quercetin-3-O-rubinobioside);
2号峰(Ｒt 18． 35 min，［M －H］－ m/z 463)和与其相邻的异槲皮苷
具有相同的分子量，故推测其为金丝桃苷(hyperoside)。
2． 2 红凤菜总黄酮提取物的分离效果分析
由表 1 还可见:样品Ⅰ除了具有 6 组黄酮苷吸收峰外，还
有 3 个包含 4 种成分的杂质峰(即 7 ～ 9 号峰)，对照文献［5］，
确定 7 号峰(Ｒt 20． 81 min，［M － H］－ m/z 515)为异绿原酸 A
(isochlorogenic acid A)，8 号峰(Ｒt 21． 66 min，［M － H］－ m/z
515)为异绿原酸 C(isochlorogenic acid C)，另外 2 种成分尚未
能确定。样品Ⅰ经过聚酰胺柱层析得到的样品Ⅱ中不含有
7 ～ 9 号杂质峰，且保留了 6 个黄酮苷吸收峰，说明聚酰胺柱层
析可有效纯化红凤菜的黄酮苷提取物。
样品Ⅲ含有 1 号峰(Ｒt 17． 64 min，［M － H］－ m/z 609)、3
号峰(Ｒt 18． 67 min，［M － H］－ m/z 593)和 4 号峰(Ｒt 19． 31
901第 3 期 任冰如，等:红凤菜新鲜茎叶中总黄酮提取物的 LC － MS分析
min，［M － H］－ m/z 593)3 个峰信号;样品Ⅳ含有 2号峰(Ｒt
18． 35 min，［M － H］－ m/z 463)、3 号峰(Ｒt 18． 60 min，［M －
H］－ m/z 463)、5 号峰(Ｒt 19． 72 min，［M － H］－ m/z 447)和 6
号峰(Ｒt 20． 35 min，［M － H］－ m/z 447)4 个峰信号。与样品
Ⅰ不同的是，样品Ⅲ中的 1 号峰为对称的峰信号，3 号峰只有 1
个分子离子峰信号(［M － H］－ m/z 593)，而样品Ⅳ中的 3 号
峰也只有 1 个分子离子峰信号(［M － H］－ m/z 463)。以上结
果说明，采用聚酰胺柱层析结合重结晶方法可使红凤菜中的
不同黄酮苷成分得到较好的分离。
3 讨 论
在上述获得的黄酮苷成分中，槲皮素 － 3 － O －洋槐苷和
槲皮素 － 3 － O －半乳糖苷在红凤菜化学成分的相关研究中未
见报道，造成这一结果的原因除与分离手段不同有关外，还与
供试样品的性质不同有关。前人的研究多采用红凤菜干燥叶
片，而作者采用的是红凤菜新鲜茎叶，采用新鲜植物样品能更
全面地保留原有的化学成分。虽然如此，还应采用其他分析
手段对红凤菜中上述 2 种成分进行进一步的验证。
此外，从红凤菜新鲜茎叶中分离或检测到的黄酮苷成分
主要以槲皮素或山柰酚为苷元，这与他人的研究结果［2 － 5］一
致。因此，在测定红凤菜总黄酮成分时建议将样品中的黄酮
苷进行酸水解，并以槲皮素和山柰酚为对照品采用高效液相
法进行定量测定，以获得较准确的结果。
采用“体积分数 95%乙醇提取 － NKA 大孔树脂柱层析 －
聚酰胺柱层析 －重结晶”的工艺流程可有效地从红凤菜新鲜
茎叶中分离获得总黄酮，该工艺能耗低、操作简便、产品纯度
高，可用于工厂化生产。
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(责任编辑:佟金凤
檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲
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011 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 23 卷