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时间延长而增大;而在设定的范围内，多糖提取率随酶量和提
取温度增加均是上升后达到一个平衡，即最大值。从经济角
度和提取的可行性考虑，将 2． 5 h定为最适提取时间，最佳提
取酶量和提取温度可以由上述方程求导得到，即灵芝多糖提
取最佳工艺条件为提取温度 50． 59 ℃、酶量 1． 80%、提取时
间 2． 5 h，在该条件下由响应面模型预测的灵芝多糖提取率的
理论值为 11． 55%。
为了验证试验的可靠性，采用最优提取条件浸提灵芝多
糖，考虑到试验操作的可行性，为方便实际操作，将条件修正
为提取温度 51 ℃、酶量 1． 80%、提取时间 2． 5 h，在此条件下
实际提取率 11． 25%，实际测定值比理论预测值(11． 55%)低
2. 60%。由此可见，采用响应面分析法优化得到的浸提条件
参数准确可靠，具有很好的实际应用价值。
3 结论
在单因素试验设计的基础上，通过设计 3 因素 3 水平响
应面分析法试验，确定灵芝多糖的提取最佳工艺参数为提取
温度 51 ℃、酶量 1． 80%、提取时间 2． 5 h，按照此工艺提取灵
芝多糖的提取率较高，实际提取率可达 11． 25%。
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红凤菜总黄酮的富集方法
任冰如，陈 剑，吕 寒，梁呈元，吴菊兰，刘 艳，李维林
(江苏省中国科学院植物研究所 /南京中山植物园 /江苏省药用植物研究开发中心 /江苏省抗糖尿病药物筛选技术服务中心，江苏南京 210014)
摘要:探讨从红凤菜新鲜茎叶中富集总黄酮的方法，以槲皮素为对照品，用比色法测定样品中的总黄酮含量;以红
凤菜新鲜茎叶为原料，比较用不同浓度乙醇提取总黄酮的效果;以乙醇粗提物为试验样品，比较不同吸附材料在静态
和动态情况下对总黄酮的吸附和解吸附性能。结果得到总黄酮含量的标准曲线为:y = 2． 215 7x － 0． 2511，r = 0． 999 1
(n = 3)，其中 x为吸光度，y为槲皮素的质量(mg);结果还表明，用 95%乙醇提取总黄酮的效果最佳，用大孔树脂 NKA
分离总黄酮的效果最好，此外 D －101、HPD －100、X －5 也有较好的分离效果。综合研究结果认为，用 95%乙醇作提
取溶剂、用 NKA大孔树脂吸附层析，可有效地富集红凤菜新鲜茎叶中的总黄酮。
关键词:红凤菜;总黄酮;提取;分离
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2014)06 － 0260 － 03
收稿日期:2013 － 09 － 23
项目来源:江苏省产学研联合创新资金(编号:BY2012213);江苏省
科技基础设施建设计划 － 科技公共服务平台项目(编号:
BM2011117)。
作者简介:任冰如(1964—)，女，江苏宜兴人，博士，研究员，主要从事
植物资源的研究与开发工作。Tel:(025)84347081;E － mail:
renbingru@ 263． net。
通信作者:李维林，博士，研究员，研究方向为植物学。E － mail:
lwlcnbg@ mail． cnbg． net。
红凤菜(Gynura bicolor)为菊科菊三七属植物，别称血皮
菜、观音菜、观音苋、紫背天葵等，可以作为蔬菜食用，近年来
在江苏等多个地区都有栽培和销售。红凤菜全草可入药，味
甘、辛，性凉，具有凉血止血、清热消肿的功效［1］。有研究显
示，红凤菜含有黄酮类物质［2 － 4］，黄酮类物质具有保护心血
管、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等活性［5］，因此
从红凤菜中提取黄酮类物质具有重要意义。本试验以红凤菜
的新鲜茎叶为原料，探讨用不同浓度乙醇提取总黄酮的效果，
并在此基础上选用不同吸附材料对红凤菜粗提物中的总黄酮
进行吸附与解吸附试验，以期筛选分离效果优良的吸附材料，
有效地富集总黄酮。
1 材料与方法
1． 1 试验仪器
Mettler AE － 240 十万分之一电子天平;KQ － 300DE 型数
控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;BM252C 电动搅
拌机，广东美的精品电器制造有限公司;TU － 1810 紫外可见
分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;HY － 4A 数显
调速多用振荡器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。
1． 2 试验材料
红凤菜于 2003 年 7 月引自中国重庆，凭证标本号
—062— 江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 6 期
0648614，凭证标本保存于江苏省中国科学院植物研究所标本
馆(NAS)。红凤菜的新鲜茎叶采自江苏省中国科学院植物
研究所的试验苗圃中。
NKA大孔树脂，购自南开大学化工厂;AB － 8 大孔树脂，
购自天津南开和成科技有限公司;HPD － 100、X － 5 大孔树
脂，购自河北沧州宝恩化工有限公司;D101 大孔树脂，购自天
津海光化工有限公司;100 － 200 目聚酰胺粉末，购自浙江省
台州市路桥四甲生化塑料厂。
1． 3 试验试剂
槲皮素对照品购自中国食品药品检定研究院，批号:
100081 － 200907，ID:A34P － 2DV6。所用试剂均为分析纯。
1． 4 试验方法
1． 4． 1 总黄酮含量的标准曲线制作及样品总黄酮含量的测
定 精确称取 12． 1 mg 槲皮素对照品，用 80%乙醇定容至
50 mL，即配成浓度为 0． 242 g /L的溶液。分别精确吸取 0． 0、
1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0、4． 0 mL 槲皮素对照品溶液至 7 支试
管中，每个浓度重复 3 次;分别加入 0． 3 mL 5% NaNO2，摇匀;
6 min后分别加入 0． 3 mL 10% Al(NO3)3，摇匀后放置 6 min;
加入 4． 0 mL 4% NaOH 并加水定容至 10 mL，放置 10 ～
15 min;在 510 nm处测定吸光度值(D510 nm)。以加入的槲皮
素含量(mg)为纵坐标，测得的 D510 nm为横坐标，计算线性相
关方程，作为测定总黄酮含量的标准曲线。吸取一定体积的
待测样品代替槲皮素对照品，以相同的方法测定 D510 nm，根据
标准曲线计算样品中的总黄酮含量。
1． 4． 2 不同浓度乙醇提取红凤菜总黄酮的试验 称取 4 份
20 g 红凤菜鲜叶，分别加入 100 mL 体积分数为 0、50%、
70%、95%的乙醇水溶液，电动搅拌机匀浆后用超声波提取
1 h(设定温度为 50 ℃，功率为 90%)，过滤后精确吸取 3 mL
滤液，按“1． 4． 1”中的方法测定总黄酮含量，每个样品重复 2
次。分别取 3 mL不同浓度的乙醇提取液并用 70%乙醇定容
到 10 mL，作为不同提取液的空白对照。
1． 4． 3 不同层析材料对红凤菜总黄酮的吸附分离特性试验
1． 4． 3． 1 红凤菜总黄酮提取液的制备 称取 1 000 g新鲜红
凤菜茎叶，加入 4 000 mL 95%乙醇，超声波提取后过滤，将滤
渣重复提取 1 次，合并滤液并浓缩至 500 mL，置于冰箱中沉
淀去杂;过滤后取滤液，减压浓缩以去除残余乙醇，定容至
250 mL，得红凤菜总黄酮粗提液。
1． 4． 3． 2 不同层析材料的静态吸附筛选试验 分别称取
1． 00 g 处理过的 NKA 大孔树脂、HPD － 100 大孔树脂、D101
大孔树脂、X －5 大孔树脂、AB －8 大孔树脂和 100 ～ 200 目聚
酰胺粉末，装入三角瓶中后分别加入 20． 0 mL 红凤菜总黄酮
粗提液，振荡 4 h以使总黄酮充分被吸附，过滤即得 20． 0 mL
吸附液。取上述饱和吸附后的层析材料，分别加入 15． 0 mL
80%乙醇，振荡 4 h使总黄酮充分解吸附，过滤即得 15． 0 mL
解吸附液。吸取 0． 1 mL 各吸附液、解吸附液，按“1． 4． 1”中
的方法测定总黄酮含量，按照下列公式计算不同层析材料在
室温下的吸附量、吸附率、解吸附量及解吸附率。
吸附量(mg /g)=(原液总黄酮含量 ×原液体积 －吸附液
总黄酮含量 ×吸附液体积)/树脂质量;
吸附率 =［(原液总黄酮含量 －吸附液总黄酮含量)/原
液总黄酮含量］× 100%;
解吸附量(mg /g)=(解吸液总黄酮含量 ×解吸液体积)/
树脂质量;
解吸率 = 解吸附量 /吸附量 × 100%。
1． 4． 3． 3 不同层析材料的动态吸附筛选试验 分别称取
3． 00 g 处理过的 NKA 大孔树脂、HPD － 100 大孔树脂、D101
大孔树脂、X －5 大孔树脂、AB －8 大孔树脂和 100 ～ 200 目聚
酰胺粉末，按湿法装柱，得床体积 5 mL;用 10 倍床体积的纯
净水洗涤，吸取 10． 0 mL红凤菜总黄酮提取液上柱，收集流出
液，得 10． 0 mL过柱流出液;各柱加水 10 mL 洗脱，收集流出
液，得 10 mL水洗脱液;再加入 15 mL 80%乙醇洗脱并收集流
出液，得 15 mL解吸附液。用上述方法测定各溶液中的总黄
酮含量。按以下公式计算不同层析材料的上柱量、吸附量、解
吸附量和解吸附率。
上柱量(mg /g)=(原液总黄酮含量 ×原液体积 －过柱流
出液总黄酮含量 ×过柱流出液体积)/树脂质量;
吸附量(mg /g)=(原液总黄酮含量 ×原液体积 －过柱流
出液总黄酮含量 ×过柱流出液体积 －水洗脱液总黄酮含量 ×
水洗脱液体积)/树脂质量;
解吸附量(mg /g)=(解吸液总黄酮含量 ×解吸液体积)/
树脂质量;
解吸附率 =解吸附量 /吸附量 × 100%。
2 结果与分析
2． 1 总黄酮含量的标准曲线
图 1 表示以槲皮素为对照品，用比色法测得的总黄酮含
量的标准曲线，其中 x为吸光值，y 为槲皮素的质量(mg)，回
归方程为:y = 2． 215 7x － 0． 251 1，r = 0． 999 1(n = 3)。可以
看出槲皮素在 0． 242 ～ 0． 968 mg 范围内与吸光度呈良好的
线性关系。
2． 2 不同浓度乙醇提取红凤菜总黄酮的试验
由表 1 可见，水提液中的总黄酮含量最低，随着乙醇浓度
的增加，提取液中的总黄酮含量明显增加，以 95%乙醇的提
取效果最好。
表 1 不同乙醇浓度对红凤菜新鲜茎叶中总黄酮的提取效果
样品编号
乙醇浓度
(%)
提取液的总黄酮含量(mg /mL)
重复 1 重复 2 平均值
1 0 0． 004 0． 005 0． 005
2 50 0． 208 0． 226 0． 217
3 70 0． 834 0． 758 0． 796
4 95 0． 885 0． 911 0． 898
—162—江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 6 期
2． 3 不同层析材料对红凤菜总黄酮的吸附分离特性试验
2． 3． 1 不同层析材料的静态吸附筛选试验 各种层析材料
对红凤菜总黄酮的静态吸附效果见表 2。
表 2 不同层析材料的对红凤菜总黄酮的静态吸附效果
层析材料类型
结构
特性
吸附量
(mg /g)
吸附率
(%)
解吸附量
(mg /g)
解吸附率
(%)
NKA大孔树脂 非极性 120 40． 9 61 50． 6
HPD － 100 大孔树脂 非极性 145 49． 5 76 52． 1
D － 101 大孔树脂 非极性 150 51． 1 77 51． 5
X － 5 大孔树脂 非极性 125 42． 7 70 56． 2
AB － 8 大孔树脂 弱极性 129 43． 9 65 50． 8
聚酰胺 极性 127 43． 4 61 47． 9
可以看出，5 种大孔树脂对红凤菜粗提物中总黄酮的静
态吸附效果有差异，其中 D －101、HPD －100 大孔树脂的吸附
量、吸附率、解吸附量均较高，解吸附率与 AB － 8、NKA 大孔
树脂相近但低于 X －5 大孔树脂。
由结果还可以看出，极性吸附材料聚酰胺的吸附量、吸附
率和解吸附量均低于 D － 101、HPD － 100 大孔树脂，与 NKA、
X － 5、AB － 8 大孔树脂相当，解吸附率则低于所有选用的大
孔树脂。
因此可见，在所测定的 6 种层析材料中，D － 101、HPD －
100 大孔树脂有较好的静态吸附性能，但解吸附率并不突出;
X －5 大孔树脂的静态吸附效果一般，但解吸附率最高;聚酰
胺的静态吸附性能一般，解吸附性能最低。
2． 3． 2 不同层析材料的动态吸附筛选试验 表 3 是各种层
析材料对红凤菜总黄酮的动态吸附效果，可以看出其吸附情
况与静态吸附有较大差异。
表 3 不同层析材料的对红凤菜总黄酮的动态吸附效果
层析材料类型 结构特性
上柱量
(mg /g)
吸附量
(mg /g)
解吸附量
(mg /g)
解吸附率
(%)
NKA大孔树脂 非极性 33 27 22 80． 5
D － 101 大孔树脂 非极性 31 25 20 81． 2
HPD － 100 大孔树脂 非极性 31 25 21 84． 3
X － 5 大孔树脂 非极性 30 24 19 79． 4
AB － 8 大孔树脂 弱极性 27 21 16 75． 0
聚酰胺 极性 33 22 9 43． 4
由结果可以看出，与 5 种大孔树脂相比，极性较高的吸附
材料聚酰胺的上柱量较高，达 33 mg /g;但吸附量低于 NKA、
HPD －100、D －101 和 X － 5 大孔树脂，略高于 AB － 8 大孔树
脂;而其解吸附量与解吸附率则大大低于所选用的 5 种大孔
吸附树脂。可见对于红凤菜总黄酮来说，聚酰胺的吸附性能
尚可，但解吸附能力较差，不宜用于红凤菜粗提物中总黄酮的
分离。
还可以看出，在所选用的 5 种大孔吸附树脂中，弱极性的
AB －8 大孔树脂对红凤菜粗提物中总黄酮的上柱量、吸附
量、解吸附量和解吸附率均低于其他 4 种非极性大孔树脂;而
非极性的 NKA大孔树脂的上柱量、吸附量、解吸附量均最高，
解吸附率低于 HPD －100 大孔树脂，与 D － 101、X － 5 大孔树
脂相当。
综合考虑以上动态吸附的指标，NKA大孔树脂是分离红
凤菜粗提物中总黄酮的优选吸附材料，其他 3 种非极性大孔
树脂即 D －101、HPD － 100、X － 5 大孔树脂也有较好的分离
效果。
3 讨论
研究结果显示，红凤菜中的黄酮类化合物主要是槲皮素、
山柰酚及其苷类物质［2 － 4］，因此可以采用乙醇 －水混合溶剂
进行提取。裴咏萍等以干燥的红凤菜叶片为原料，研究了红
凤菜总黄酮的提取工艺，结果表明乙醇浓度对总黄酮的提取
有显著影响，以 70%乙醇提取效果最好［6］。由于红凤菜新鲜
茎叶含水量高于 90%［7］并且茎秆呈肉质状而难以干燥，为了
节省劳力、降低能耗，本试验直接采用新鲜茎叶为原料进行提
取。通过比较不同浓度乙醇的提取效果显示，95%乙醇对红
凤菜新鲜茎叶的总黄酮提取效果最佳。
一般认为，大孔吸附树脂的吸附是依靠树脂与化合物之
间的范德华引力或形成的氢键，聚酰胺的吸附作用是依靠其
分子中的酰胺羰基与黄酮类化合物的酚羟基形成的氢键［5］，
大孔树脂和聚酰胺均被广泛应用于黄酮类化合物的分离和富
集。本次试验结果显示，被极性吸附材料聚酰胺所吸附的总
黄酮的解吸附性远远低于非极性或弱极性的大孔树脂，其原
因可能是聚酰胺与黄酮分子间形成了较稳定的氢键，导致难
以解吸附。
虽然在静态吸附试验中大孔树脂 D － 101、HPD － 100 表
现出了较好的吸附性能，但在动态吸附试验中其吸附性能均
低于 NKA，说明大孔树脂 D － 101、HPD － 100 吸附的总黄酮
容易被水洗脱，而 NKA能较牢固地吸附总黄酮。在动态吸附
试验中，NKA大孔树脂既有较好的吸附性能又有较好的解吸
附性能。为了有效地分离红凤菜粗提物中的总黄酮，并综合
考虑各种材料的吸附效果，应优先选用 NKA大孔树脂进行动
态柱层析;同时试验表明，非极性的 D －101、HPD － 100、X － 5
大孔树脂也有较好的分离效果。
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